Summary
3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.
Abstract
Tümörü ifadede protein analizi onun patoloji çalışma çeşitli yönlerini ilgilidir. Çok sayıda protein tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşması devlet uygulamaları ile biyolojik olarak tarif edilmiştir. Bu biyolojik analizleri de tümörü hasta ve tümörü modelleri üretilen tümör neurospheres (NS) karakterize etmek kullanışlıdır. Tümör NS hangi onlar türetilmiştir ve daha doğru olabilir ayna gliyom biyoloji tümör farklı özelliklerini değerlendirmek için değerli vitro modeli sağlar. Burada biz biyolojik tümör NS içinde analiz etmek için ayrıntılı bir yöntem tarif parafin gömülü tümörle NS immünhistokimya (IHC) kullanarak.
Introduction
Gliomas tarafından fenotipik ve genotypic özellikleri1Dünya Sağlık Örgütü göre sınıflandırılmış merkez sinir sisteminin birincil solid tümör vardır. Bu sınıflandırma varlığı ya da yokluğu biyolojik2çekici bir kaynağı temsil sürücü mutasyonlar içermektedir. Biyolojik ölçülen ve terapötik müdahale3farmakolojik yanıtlarının yanı sıra normal ve patolojik işlemleri belirtmek için değerlendirilen biyolojik özellikleri vardır. Biyolojik tespit tümör doku ve hücreleri tümörü türetilmiş, farklı açıdan biyolojik onun karakterizasyonu etkinleştirme. Mutasyona uğramış isocitrate dehidrogenaz 1 (IDH1), bir mutant enzim daha iyi prognoz4ile ilişkili alt-sınıf gliomas karakteristik gliyom biyolojik bazı örnekler. Mutasyona uğramış IDH1 sık sık TP53 ve alfa-talasemi/mental retardasyon sendromu X'e (ATRX) ile birlikte dile getirdi-mutasyon ihracı, belirli bir gliyom tanımlama alt tür4,5. ATRX ihracı mutasyonlar da Pediatrik yüksek kalitede gliomas2,%6 44'ortaya çikmaktadir ve agresif tümörler ve genomik istikrarsızlık6,7ile ilişkili bulunmuştur. Buna ek olarak, Pediatrik diffüz içsel pontine gliomas (DIPG) bir K27M mutasyon histon H3 gen H3F3A veya HIST1H3B/C gen1,6olup göre alt gruplar farklı. Bu nedenle, alt bölümü, çalışma ve gliomas tedavisi daha daha fazla gelişimi sağlayacak ayrı varlıklar olarak Moleküler Karakterizasyonu giriş izni hedefli tedaviler her alt türü için. Buna ek olarak, biyolojik analizini apoptosis8, autophagy9, hücre döngüsü ilerleme10, hücre proliferasyonu11ve hücre farklılaşması12 gibi farklı biyolojik süreçlerin değerlendirmek için kullanılabilir .
İnsan kanser mevcut genetik lezyonlar liman genetiği hayvan modelleri hastalık ilerleme aracılık yolları sinyal çalışması için kritik önem taşımaktadır. Bizim Laboratuvar insan gliyom alt türlerinden13,14özetlemek belirli mutasyonlar yataklık gliyom genetiği fare modelleri geliştirmek için uyku Güzellik (SB) transposase sistemi hayata geçirdi. Bu genetik fare modelleri vitro çalışmalar 3D sisteminde etkinleştirmek tümör kaynaklı NS oluşturmak için kullanılır, tümör içinde in situ15' te yansıtma belirgin özellikleri mevcut. Ayrıca, NS orthotopical nakli fareler içine özelliklerini birincil tümör korumak ve karşılık gelen birincil tümörün15histopatolojik, genomik ve fenotipik özellikleri taklit ikincil tümörler oluşturabilirsiniz.
Kültür, serum-Alerjik Beyin tümör hücreleri kök hücre özellikleri ile zenginleştirilmiş ve epidermal büyüme faktörleri (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) huzurunda onlar NS kültürler gibi tek hücre kaynaklı koloniler olarak yetiştirilir. Kök Hücre Böl ve hücresel kümeleri oluşturur, ancak bu seçici kültür sistemi içinde en ayırt edici veya farklılaşmış hücreler hızla, ölmek. Bu tümörü tümör Özellikler16,17,18tutar bir NS kültür üretimi sağlar. Tümörü NS tümör biyolojisi, tanı, prognoz, sınıflandırma, tümör ilerleme durumunu ve hücre farklılaşma durumu da biyolojik analizi de dahil olmak üzere çeşitli yönlerini değerlendirmek için kullanılabilir. Burada, tümörü NS oluşturmak ve 3D kültürler parafin içinde kullanılmak üzere embed için bir protokol ayrıntılı IHC boyama için. Sabitleme ve tümörü NS gömme bir NS morfolojisi daha iyi hangi gliyom NS hücre ayrılma için stresli işleme tabi tutulur ve basık haline geleneksel cytospin yöntemi19' a, göre korunur üstünlüktür. Buna ek olarak, gömme genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleştirme herhangi bir endojen fluorophore ifadeden quenches. Bu yöntem genel işlem katıştırma parafin ile tümörü hücreleri 3D yapısını korumak ve karakterizasyonu tümörü neurospheres immünhistokimya kullanarak etkinleştirmek için hedeftir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. nesil bir fare modelinden türetilmiş Beyin tümör Neurospheres
- Diseksiyon yordamı önce sinir kök hücre ortam hazırlamak (NSC medya: DMEM/F12 özel sayı: 1 x B27, 1 x N2 ek, 1 x normocin ve 1 x antibiyotik/insan rekombinant EGF ve basic-FGF konsantrasyonları 20 ng/mL her yönü ile antimycotic). 1.5 mL tüp NSC medya 300 µL ile doldurun ve daha sonrası için saklıdır.
- Bir fare ile büyük bir tümör seçin.
Not: plazmid veya virüs enjekte biyoluminesans kodlar Eğer bir tümör boyutu bioluminescence tarafından izlenebilir. Genellikle, büyük bir tümör > 106 fotonlar/s/cm2/sr biyolüminesans var. - Fare ile bir doz aşımı isoflurane ötenazi: kağıt mendil isoflurane ile demlemek ve tahriş önlemek için fare ile doğrudan temas kaçınarak doku euthanization odasında tanıtmak. Fareler pedal refleks (genellikle 5-10 dk) gösterme kadar bekleyin. Fare başını kesmek ve beyin Calinescu vd içinde açıklandığı gibi incelemek 13.
- Tümör floresan, floresan lamba ile donatılmış diseksiyon mikroskop içinde beyin tümörü kitle tanımlamak için kullanın. İyi forseps ile normal beyin dokusundan (genellikle 5-7 mm çapında) tümör incelemek.
- NSC medya (adım 1.1) ile 1,5 mL tüp disseke tümör yerleştirin. Hafif basınç uygulayarak microcentrifuge tüp duvarlara uyan bir tek kullanımlık plastik havaneli ile tümör lunaparkçı.
- Hücre kümeleri ayırmak için enzim-Alerjik ayrışma ortamının 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
- Hücre süspansiyon 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve süzgeç NSC medya 20 mL ile yıkayın.
- 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet 6 mL veya 15 mL NSC medya, Pelet büyüklüğüne bağlı olarak yeniden askıya alma.
- Tümör hücre süspansiyon bir T-25 veya T-75 kültür şişesi ve kültür bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de % 95'i hava ve % 5 CO2bir atmosfer ile plaka.
- 3 gün sonra sağlıklı askıya alınmış NS aktarmak ve onları yeniden T-25 veya T-75 doku kültürü şişesi plakası. Gerekirse, daha fazla NSC medya kültür için ekleyin.
Not: Genellikle bir nüfus hücre olacak, bazı ölü olacak, bazı yapıştırılır ve bazı medya yüzen NS oluşturan
2. koruma ve NS Passaging
Not: aşırı büyüme önlemek ve nispeten yüksek yoğunluklu hücreleri korumak. İzdiham küreler boyutu (siyah merkezlerinin büyük küre ortalama büyüme) tarafından belirlenir. NS büyüme hızının tümörler oluşturmak için kullanılan oncogenes bağlı olacaktır.
- Bir kez NS kültür confluency ulaştı, steril santrifüj tüpü kültüründe toplamak ve NS 300 x g 5 min için de cips.
- Süpernatant atmak, hücre dekolmanı çözümü 1 mL ekleyin ve pipet Pelet yeniden askıya alma.
- Tüp flicking 5 min için 37 ° C'de hücre ayrılma yardımcı olmak için her 2 dk kuluçkaya.
Not: NS confluency ulaştığınızda, onlar genellikle macroscopically küçük beyaz küreler görülebilir. Hücre ayrılma sağlamak için en azından tüm görünür NS kayboldu gerekir. - HBSS 1 5 mL ekleyin x ve pipet birkaç kez. 5 dakika süreyle 300 x g Pelet hücreleri süpernatant atmak. Pelet NSC medya rekombinant EGF ve temel FGF ile 5 ml yeniden askıya alma.
- Hücre 1 mL NSC medya ve kültür T-75 şişesi bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 15 mL % 95'i hava ve % 5 CO2atmosferiyle ekleyin.
- Büyüme faktörleri (EGF ve temel FGF) her 3 günde ekleyin. Ortam ışık dönüşürse turuncu ve hücreleri henüz konfluent değil, medya değiştirmek. Bunu yapmak için 300 x g 4 dk için de NS santrifüj kapasitesi ve yeniden büyüme faktörleri ile desteklenmiş NSC medya askıya alma.
Not: oluşan Pelet boyutuna bağlı olarak, hücre daha fazla şişeler bölmek gerekebilir.
3. uzun süreli depolama için NS dondurma
- NS kültür konfluent olduğunda hücreleri 2.1-2.4 adımlarda açıklandığı gibi ayırmak. Pelet HBSS içinde yeniden askıya alınmış edildikten sonra bir aliquot çıkarmak ve hücreleri saymak.
- 300 x g 4 dk için hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant mümkün olduğu kadar kaldırın.
- Medya (ısı-inaktive FBS, % 10 DMSO) dondurma Pelet yeniden askıya alma. 1 x 106 ve 3 x 10 mL başına şişe başına6 hücre arasında dondurmak için tavsiye edilir.
- Çok cryovials ve yavaş yavaş şişeleri soğumasını gerekli olarak yeniden askıya alınmış hücrelerde tarafından ilk buz için aktarmadan sonra -20 ° c sonra-80 ° C ve nihayet bir sıvı azot saklama kabı için ertesi gün bölün.
4. tümör NS fiksasyonu
- Kültür tümör T-25 şişesi 2-3 gün kadar hücreleri konfluent NS (~ 3 x 106 hücre). Tümör NS bir 15 mL konik tüp bir en az bir T-25 konfluent şişesi toplamak. 300 x g 5 min için de cips.
- Pelet 1 mL % 10 formalin yeniden askıya alma ve oda sıcaklığında (RT) 1 x HBSS 10 dk. eklemek 5 mL için tutmak ve adım 3.2 yapılır gibi hücreleri cips. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.
- Buzda Pelet içeren 15 mL konik tüp yerleştirin.
5. parafin tümör NS katıştırma
- Yıkanmış NS Pelet % 2 sıcak sıvı özel 500 µL içinde yeniden askıya alma ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.
- Hemen özel polymerizes kadar özel katıştırılmış NS buza koyun. NS barındıran özel parça kaldırın. Kaset (Şekil 2) işleme doku için NS ile polimerli özel parça yerleştirin.
- (Bir otomatik parafin işlemci kullanarak) doku işleme devam etmek ve (bir gömme istasyonunu kullanarak) katıştırma alkol.
6. NS parafin gömülü kesit
- Su banyosu 42 ° C-ayarla ve dikkatlice o dümdüz edildi emin olmak için iki boya fırçaları kullanarak microtome üzerinde bıçak ekleyin. Bu bıçak sadece kırpma için kullanın.
- Parafin blok üzerinde microtome yerleştirin. Sigara dominant el ile her bölümün kalınlığını denetler sol tarafta bulunan kolu üzerinde bastırın. 30 µm kalınlık gösterir ikinci durdurmak için tuşuna basın.
- Blok kesme başlar (i.e., aşırı parafin kaldırma) örnek yüzeyine ulaşılana kadar sağ eli ile kaba el çarkı çevirerek. Bu noktada, döşeme kalınlığı 10 mikron veya 5 mikron kontrol kolu bırakın. Örnek yüzeyinin ulaşıldığında kısaltma kesin.
- Bir buz kutusu buz ile doldurun ve parafin blok buz üzerinde yerleştirildiğinde, su doğrudan buz dokunmaktan korumak parafin blok etrafında bir film gibi davranan sadece yeteri kadar su ekleyin. Parafin blok 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
- Eski bıçak atmak ve kesit için yeni bir tane ekleyin. Kuru blok gazlı bez kullanarak sonra yere microtome.
- Sigara dominant el ile parafin şerit çekmek için kullanılan Kıvrımlı pensler çifti elde edilir. Parafin şerit su banyosu aktarmak için kullanılan sağ yakınındaki bir nemli boya fırçası tut. Başlamak bölümüne hızlı bir sağ eli ile kaba el çarkı çevirerek pace. Forseps sol el parafin şerit tutmak için kullanın.
- Islak boya fırçası parafin şerit su banyosu aktarmak için kullanın.
- Forseps eğrisi bölümleri yüzeysel forseps iki parafin kesitler arasında yerleştirerek, daha sonra iki bölüm uzağa hafifçe iterek tarafından parçalayın için kullanın.
Not: Bu hareket tamamen parafin bölüm yüzeyinde olmalıdır. Aşağı üstünde belgili tanımlık parça bastırmayın. - Pozitif yüklü yapışma mikroskop slayta ayrı parafin kesitler itmek için nemli boya fırçası kullanın.
- Bunları slayt kutularına saklamak önce kuru gecede bir kimyasal başlık içinde slaytlara izin. Slaytlar depolanmasını gerçekleştirilen leke türüne göre değişir.
7. immünhistokimya (IHC) parafin gömülü NS
- Parafin bir metal raf slaytlar yerleştirip onlara 20 dk 60 ° C'de kuluçka eritebilir.
- Slayt kuluçka RT bir rehidrasyon Tren içinde tarafından deparaffinize: 3 x 5 min için ksilen, %100 2 x etanol için 2 dk, %95 2 x etanol için 2 dk, %70 1 x etanol için 2 dk ve 1 x 2 dk. Hereonu, deiyonize su musluk suyu antijen alma kadar slaytları tutmak , kurumasını olarak neden olur non-spesifik antikor bağlama.
- Sitrat arabellek (10 mM sitrik asit, %0.05 non-iyonik deterjan, pH 6) 125 ° c 30 için slaytları kuluçkaya s ve 90 ° c 10 s. Onları soğumasını sonra slayt 5 kez distile su ile durulayın.
- RT, Slaytlar %0,3 H2O2 30 dk içinde kuluçkaya.
- 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek (TBS % 0,025 deterjan) yıkama içinde slaytlar yıkayın.
- RT, slaytlar 30 dk için çözüm (% 10 at serum, TBS % 0,1 BSA) engelleme ile kuluçkaya.
- Gecede 4 ° C'de oksijen odasında slaytlar ile birincil antikor seyreltme çözüm (TBS % 0,1 BSA) hazırlanan kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.
- RT, Slayt 1 h için biotinylated ikincil antikor seyreltme çözümde hazırlanan ile kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.
- RT, slaytlar avidin-biotinylated horseradish peroksidaz karmaşık ile 30 dk için karanlıkta kuluçkaya. 3 kez nazik ajitasyon ile 5 min için arabellek yıkama içinde slaytlar yıkayın.
- DAB-H2O2 substrat markalar burada için 2-5 dk RT. az slaytlarla kuluçkaya
- 3 kez dokunun su ile durulayın. (1-2 s) hematoksilen çözüm counterstain için slaytları daldırma ve takas kadar musluk suyu iyice yıka.
- Slaytları aşağıdaki gibi kurutmak: 2 min için distile suda kuluçkaya, % 80'i etanol içinde 3 kez daldırma, % 95 etanol 2 min için 2 kez kuluçkaya, % 100 etanol 2 dk her, için 2 kez kuluçkaya ve sonunda 3 dakika için 3 kez ksilen içinde.
- Coverslip ksilen tabanlı montaj orta ile slaytlar ve koyup RT, düz bir yüzeye kadar görüntüleme için hazır kuruyuncaya kadar bırakın. Not: 3, 3'-boyama, diaminobenzidine (DAB) gerçekleştirme slaytları RT. saklanabilir Ayirt boyama gerçekleştirilirse, ancak, slaytlar karanlıkta fotoğraf beyazlatma azaltmak için-20 ° C'de muhafaza edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Değer biçmek Eğer tümör NS üretmek için gereken boyuta ulaştı ve tümör gelişimi izlemek için bioluminescence kullanarak tümör tarafından yayılan ışıma analiz ettik. Bu luciferase (Şekil 1A ve 1B) ışıldama sinyal ile iletim verimliliği pups ve tümör ilerleme çalışma sağlar. 1 x 107 fotonlar/s/cm2/sr (Şekil 1B) bir sinyal tümör boyutu eriştiği zaman, beyin NS üretimi için işlenebilir. Başka bir bu sistemin farklı floresan proteinlerin kodlama dizisi gen teslim ve tümör oluşturulmasında kullanılan plazmid eklenebilir bir avantajdır. Sonra eklenen genetik değişikliği, ifade bir floresan lamba (Şekil 1C) ile donatılmış bir diseksiyon mikroskop kullanarak doğrulayabilirsiniz. WT-IDH1 (Şekil 1D) ve mIDH1 (Şekil 1E) tümör üretilen NS karakteristik küresel Morfoloji ve belirli genetik lezyon ( ile ilgili fluorophores bir ifade tarafından tanımlanır i.e., shATRX ve shp53 ile ilişkili GFP ve Katushka ilişkili mIDH1 ile; Resim 1 D ve 1E). IHC NS ile devam etmek için hücreleri sabit sonra özel ve parafin (Şekil 2) gömülü. NS parafin blok içinde katıştırma uzun süreli depolama için izin ve NS 3D yapılarının korunması dahil olmak üzere çeşitli yararları vardır. Katıştırılmış NS için belirli gliyom biyolojik boyanabilen. Bu tekniği kullanarak, analiz ettik ATRX, Ki67 ve OLIG2 ifadesi (oligodendrocyte farklılaşma marker) (Şekil 3A-3_C). Biz bir özellik LGG tümörü olan ATRX protein NS kültürleri (Şekil 3A), düşük ifade düzeyleri alt tür şu anda varlık doğruladı okudu4. Ayrıca, Ki-67, hücre çoğalması, iyi tarif bir biyomarker mIDH1 NS (Şekil 3B), tümör hücrelerinin önemli bir özelliktir etkin proliferasyon gösteren pozitif çıktı. İlginçtir, daha büyük tümörü NS kümeleri ortasına lokalize hücreleri, Ki-67 (Şekil 3B), onlar, çevre için yerelleştirilmiş Ki-67 pozitif hücrelerinin aksine Proliferasyona değil olduğunu belirten negatifti. Gerçeğini periferik hücreler büyüme ortamından besin erişim yok nedeniyle bu fenomen olabilir. Onlar bu büyük boyutu ulaştığınızda, tümörü NS ayrışmış pasajlı ve. Son olarak, wt-IDH1 NS Olig2, oligodendrocyte farklılaşma (Şekil 3C) katılan bir transkripsiyon faktörü için olumlu idi.
Resim 1 : GFP ve Katushka-Güzellik (SB) beyin tümörü uyku pozitif üzerinden oluşturulan tümörü neurospheres. (A) tümörü (NRAS/shP53/shATRX/IDH1-R132H) ikna etmek için ışıklı sinyal genetik lezyonlar yataklık Plasmid'ler ile birlikte SB-transposase plazmid ile enjekte bir yenidoğan fare. (B) 132 gün sonrası enjeksiyon (DPI) tümör gelişim gösteren ışıldama. (C) A parlak-alan ve son nokta aşamaya bir fareden hasat beyin floresan görüntü. Tümör noktalı çizgi arasındadır ve floresan gazetecilere, GFP ve Katushka için olumlu alandır. (D ve E) Tümör neurospheres shP53 ve shATRX ile ilişkilendirilen GFP ifade SB beyin tümörleri üretilen; Katushka IDH1-R132H için ilgili ve. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Parafin gömülü gliyom NS için iş akışı gösterimini. NS bir T-25 şişesi 15 mL konik tüp içine toplanan ve % 10 formalin içinde sabit. O zaman, NS HBSS ile yıkanmış ve % 2 özel içinde gömülü. Polimerli özel içeren gliyom NS bir kaset doku işleme ve parafin katıştırma için yerleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Biyolojik HRP-DAB tespiti ile immünhistokimya temsilcisi sonuçlarını. (A-C) Parafin gömülü mIDH1 tümörü NS üzerinde gerçekleştirilen IHC lekeli ATRX (A) ve Ki67 (B) için ve wt-IDH1 tümörü NS lekeli için OLIG2 (C). Kırmızı oklar biyomarker boyama için pozitif hücreler gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, hangi içinde beyin içinde in situbüyüyen tümör hücreleri karakteristik 3D yapısını korumak immünhistokimya parafin gömülü gliyom NS, gerçekleştirmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem ayrıntı. Bu teknik cam veya plastik yüzeyler kaplama hücreleri kullanarak üzerinde aşağıdaki avantajları vardır: Ben) NS; 3D yapısını korunması II) protein ifade analiz önce hücre ayrılma stresinin önlenmesi; III) genetiği tümör NS, floresan spectra boyama etkinleştirme herhangi bir endojen fluorophore ifadeden, Şoklama; ve IV) uzun süreli depolama.
Bu tekniğin önemli bir adım hücreleri özel rastlanılmaması dağıtılır ve birlikte clumped değil emin olmak için de yeniden askıya alınmış sağlamaktır. Bu teknik bir sınırlama hücre kültürü çalışmalarının ve yordam boyama IHC önce işleme NS ile ilgili zaman alıcı birkaç adım ötededir. Bu yöntemi uygulamak için gerekli yüksek sayısı ikinci bir kısıtlamadır. Hücre sayısı az 1 x 106 hücreler ise, başına NS görüş alanı kümeleri her bölümde çok az sayıda hücre olacak. Bu nedenle, tümörü hücre kültürü yavaş büyüyen ise hücre ideal sayısı ulaşmak zor olabilir. Biz en az 3.0 x 106 hücreler içeren bir konfluent T-25 şişesi kullanılır. Kullanılan hücre sayısı olarak değiştirilmesi istenen; Ancak, gömme işlemi için uygun büyüklükte bir NS Pelet elde etmek gereklidir. Bundan sonra katıştırılmış NS bir düzenli parafin gömülü taşı olarak manipüle edilebilir ve sonra kesit ve protein ifade ayirt tarafından çözümlenecek boyama IHC veya IHC DAB boyama kullanarak geçebilirsiniz.
Blokların ve aşağıdaki protokol için IHC kesit sonra bölümler hematoksilen (mavi) ile counterstained. Doku hedef protein ifade eder, kahverengi bir sinyal görünür (Şekil 3) olmalıdır. IHC sonra bölümleri de kahverengi iseniz (yüksek arka plan), bu 1) non-spesifik ikincil antikor biding, endojen peroksidaz, ya da 3) yetersiz engelleme eksik 2) bir Şoklama nedeniyle olabilir. 1) bir negatif kontrol slayt (yalnızca ikincil bir antikor ile inkübe) ikincil antikor non-spesifik bağlama, 2) zaman Şoklama peroksidaz artan veya 3) engelleme kuluçka dönemi artan kontrol etmek yanında istimal bu sorunlar çözülebilir. Öte yandan, sinyal yok algılanırsa, epitopları hala, hangi antijen alma için kullanılan arabellek türü bağlı olabilir maskelenir ki mümkündür. Bizim deneyim, biz sitrat tampon, kullanarak boyama tatmin edici oldu ama bu doku ve antikor bağımlı, olabilir ve antijen Alma arabellekleri için farklı formüller 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) arabellek21gibi kullanılabilir. Bunlar IHC boyama için ilgili en yaygın sorunları vardır, ama diğer zorluk herhangi bir anlaşmazlık durumunda, sorun giderme gibi herhangi bir diğer IHC ile yapılmalıdır (i.e., birincil ve ikincil antikorların farklı dilutions çalışırken farklı engelleme reaktifler, farklı engelleme zamanlarda, vb).
Protein ifade hücreleri parafin gömülü kullanarak değerlendirmek için alternatif bir yöntem daha önce Hasselbach vd tarafından tanımlanmıştır 20. Bu yöntem bu protokolündeki 3D hücre kümeleri yeterli özel dağıtım etkinleştirmek özel adımlar içermez. Ayrıca kültür, passaging ve uzun süreli depolama için buz gibi NS için bir yöntem açıklar. Bu yöntem aynı zamanda toplamak, düzeltmek ve 3D yapı (Şekil 2) değiştirmeden NS katıştırmak verilmektedir.
NS hastalar ve tümörü hayvan modelleri elde gliyom dokusundan üretilen beri bu tekniği farklı tümörü suptypes ifadede biyomarker analiz ve özgün modeller doğrulamak için kullanılan güçlü bir araç teşkil etmektedir. Burada teknik SB transposase sistemi (Şekil 1) kullanarak genetik fareler kökenli NS ile açıklamak. Ancak, bu teknik aynı zamanda hücre kültür koşulları dışında Protokolü ' nün değişiklik olmadan 3D kültürler olarak büyümek insan gliyom parafin gömülü hücrelerdeki protein analiz etmek için kullanılabilir. Yani, bu yöntem 3D kültürler transplantable hayvan modelleri, insan PDX modelleri ve genetiği diğer modeller elde de uygulanabilir. Son olarak, bu yöntem diğer tür kanser, fare modelleri ve insan kanserleri gliomas ek olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser ulusal kurumları, Sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar & kontur (NIH/NINDS) hibe R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 için M.G.C. tarafından desteklenen; NIH/NINDS verir R01-NS076991, R01-NS082311 ve R01-NS096756 P.R.L. için; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Nörocerrahi bölümü; Leah'ın mutlu Kalpler M.G.C. ve P.R.L.; ve RNA Biyomedikal Grant F046166 M.G.C. F.M.M. için bir F31 NIH/NINDS-F31NS103500 tarafından desteklenir. J.P. bir Fulbright-Arjantinli Bakanlığı spor ve eğitim bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
