Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for en modifisert zymographic teknikk som brukes fluorescerende peptider som nedbrytbart underlaget i stedet for native proteiner. Geleelektroforese av biologiske prøver i fluorescerende peptid zymograms gjør påvisning av et bredere spekter av proteaser enn forrige zymographic teknikker.
Abstract
Formålet med denne metoden er å måle proteolytiske av komplekse biologiske prøver. Prøvene er atskilt med molekylvekt bruker geleelektroforese gjennom en retting gel innebygd med en nedbrytbar substrat. Denne metoden er forskjellig fra tradisjonell gel zymography i et let fluorogenic peptid bygges covalently inn løse gel i stedet for full lengde proteiner, som gelatin eller kasein. Bruk av fluorogenic peptider gjør direkte deteksjon av proteolytisk aktivitet uten flekker forholdsregler. Enzymer i de biologiske prøvene cleave Let fluorogenic peptid, resulterer i en økning i fluorescens. Fluorescerende signalet i geléer er da fotografert med en standard fluorescerende gel skanner og kvantifisert ved hjelp av densitometry. Bruk av peptider som nedbrytbart underlaget utvider mulig proteaser synlig med zymographic teknikker.
Introduction
Gel zymography er en biologisk teknikk som brukes til å måle proteolytisk aktivitet innen biologiske prøver, som kroppsvæsker eller celle kultur medier1,2,3. Prøvene er atskilt med deres molekylvekt med geleelektroforese gjennom en polyakrylamid gel innebygd med en nedbrytbar substrat. Vanlige nedbrytbart underlag inkluderer gelatin, kasein, kollagen og elastin, som har blitt brukt til å måle aktiviteten til matrise metalloproteinases (MMPs) -1 -2, -3, -7,-8,-9 og-11, i tillegg til en rekke cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. etter geleelektroforese, enzymer er rehabilitert og lov til å svekke protein i gel. I tradisjonell gel zymography, gel er farget med en protein fargestoff, for eksempel Coomassie blå, og protease-aktiviteten er registrert som tap av signal, dvs. hvite band (nedbrytning av protein) på en mørk blå bakgrunn.
Her beskriver vi en protokoll for en alternativ metode for gel zymography, der nedbrytbart underlaget er en kort, fluorogenic peptid covalently innlemmet i polyakrylamid gel (figur 1). Substitusjon av syntetiske peptider som nedbrytbart substrater gjør påvisning av et bredere spekter av proteaser sammenlignet med tradisjonelle gel zymography med innfødt proteiner9. Kovalente kombinasjon av fluorogenic peptid forhindrer peptid diffusjon og migrasjon ved gel geleelektroforese observert med tidligere metoder9,10. Videre gjør bruk av en fluorogenic substrat direkte deteksjon av protease aktivitet uten ekstra flekk og fjern flekker skritt. Det overordnede målet med denne metoden er oppdagelsen av protease aktivitet i biologiske prøver via kovalente inkorporering av fluorogenic peptider i zymogram gels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av løse Gel laget
- Forberede en 10% polyakrylamid løse gel løsningen som per tabell 1. Legg til Tetramethylethylenediamine (TEMED) og Ammonium Persulfate (APS) umiddelbart før strømme gel som tillegg starter polymerisasjon reaksjonen.
- Fylle en tom 1,5 mm mini gel kassett halvveis (5 mL) med 10% løse gel løsningen.
- Legg et tynt lag med isopropanol (~ 500 µL) til toppen av polyakrylamid gel å produsere en nivå gel og hindre bobler. Bruke leftover polyakrylamid løsningen for å spore fremdriften av polymerisasjon reaksjonen. Når polyakrylamid i røret har helt styrket, er reaksjonen fullført (~ 40 min).
2. forberedelse av Azido-PEG3-maleimide Linker molekyl
- Mens det første løse gel laget er polymerizing, henter pakken azido-PEG3-maleimide fra den 20 ° C og la komponentene til romtemperatur. Det er to komponenter i hver pakke. Medisinglass 1 inneholder en maleimide-NHS ester, et off-white til grey solid. Medisinglass 2 inneholder azido-PEG3-Amin, en litt gult olje.
Merk: Forfatterne foreslår bruke 25 mg azido-PEG3-maleimide kit som det kan bare lagres i korte perioder (1-2 timer) på 20 ° C etter forberedt før det begynner å svekkes. 25 mg er tilstrekkelig til å produsere 10 peptid gels. Bruk gels i 3 uker forberedelser. - Oppløse komponentene av ampullen 2 i produsenten anbefalte volumet av dimethyl sulfoxide (DMSO) og vortex for 30 å sikre væske er blandet godt.
- Overføre innholdet i hetteglass 1 til en ren, tørr 100 mL runde bunn kolbe som inneholder oppstuss bar.
Merk: Skyll kolbe med aceton og tørke før bruk for å forhindre fuktighet forstyrrer reaksjonen. - Umiddelbart sett en gummipropp septum med en membran som kan være punctured med en sprøyte i munnen på flasken. Arbeider raskt for å hindre fukt inn kolbe.
- Sett inn to 18 gauge sprøyte nåler i mellomgulvet og koble til en inert gass tank (f.eks argongass). Tillate inertgass fylle kolbe for 3 min. blanding komponentene i hetteglass 1 og 2 under inert gass for å hindre uønskede reaksjon produkter.
FORSIKTIG: Andre sprøytenålen er å gi en ventil, og dermed slik at atmosfæriske luften i kolbe strømme ut av flasken som fyller det med inert gass. Ikke glem å inkludere en ventil nål! - Slå av inert gass og ta det fra nålen. Bruker en sprøyte, injisere medisinglass 2 hele innholdet i flasken.
- Fjern både sprøytespisser og sprøyter og tillate komponentene å blande i 30 min ved romtemperatur under omrøring.
- Fjern septum gummipropp og overføre innholdet til en ren 5 mL sentrifuge rør. Azido-PEG3-maleimide løsningen må brukes innen 1 time i rom temperatur.
3. forberedelse av peptid løse Gel laget
- Når det første løse gel laget har polymerized, hell av isopropanol laget. Skyll toppen av gel av pipettering 1 mL av deionisert vann på gel og så helle av vannet.
- Henter den thiol-functionalized fluorescerende peptid fra-80 ° C og la det tine ved romtemperatur.
Merk: Thiol-functionalized-peptid kan tilberedes som beskrevet tidligere11,12. Kommersielt tilgjengelige peptider kan også brukes, men krever tillegg av en terminal cystein rester aktivere maleimide-thiol Klikk reaksjon. Oppløse peptid å en lager konsentrasjon av 10 mM og lagre den på-80 ° C i liten (30 uL) dele begrense gjentatte fryse-Tin sykluser. - Forberede 10% løse gel løsning som inneholder azido-PEG3-maleimide koblingsfunksjonalitet molekylet og fluorescerende peptid som tabell 1. Legg til TEMED og APS umiddelbart før strømme gel som tillegg starter polymerisasjon reaksjonen.
- Fylle halvparten av den gjenstående delen av gel kassetten (3 mL) med peptid løse gel løsning.
Merk: En flerlags løse gel tilnærming reduserer mengden peptid og koblingsfunksjonalitet nødvendig for hver gel. Størrelsen på peptid løse gel laget kan justeres for å imøtekomme et større utvalg av molekylære vekter etter behov. - Pipetter et tynt lag med isopropanol (~ 500 µL) til toppen av polyakrylamid gel å produsere en nivå gel og hindre bobler. Bruke leftover polyakrylamid løsningen for å spore fremdriften av polymerisasjon reaksjonen. Når polyakrylamid i røret har helt styrket, er reaksjonen fullført (~ 40 min).
Merk: Den fluorescerende peptid er lysfølsom. Holde geléer dekket med aluminiumsfolie å forhindre photobleaching under gel forberedelse, geleelektroforese, vask og utvikling. - Hell av isopropanol laget og skyll toppen av peptid løse gel med deionisert vann som i trinn 3.1.
- Hvis bruker geléer umiddelbart videre til trinn 4, ellers fordype forberedt geléer i 100 mL 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) i 4 ° C i en plast for å hindre geléer tørker. Pakk boksen i aluminiumsfolie å hindre photobleaching. Gels kan lagres i PBS 3 uker før bruk.
4. forberedelse av stabling Gel
- Forbered en 5% stabling gel løsningen som per tabell 1. Legg til TEMED og APS umiddelbart før strømme gel som tillegg starter polymerisasjon reaksjonen.
- Fyll den gjenværende tomme delen av gel kassetten (~ 2 mL) med stabling gel løsningen.
- Raskt inn en 1,5 mm gel kam stabling gel laget gjør at noen bobler er fortsatt fanget under brønnene. Bruke leftover polyakrylamid løsningen for å spore fremdriften av polymerisasjon reaksjonen. Når polyakrylamid i røret har helt styrket, er reaksjonen fullført (~ 10 min).
- Forsiktig fjerne kammen og tape fra baksiden av gel kassetten.
5. utarbeidelse av biologiske prøver for geleelektroforese
- Forberede betinget cellen media, celle lysates, vev homogenates og MMP standarder som beskrevet andre steder under ikke-reduserende forhold2. Ikke varme prøver.
- For eksempel Forbered betinget cellen media som følger:
- Plate 40.000 celler/cm2 celler i en 6-vel plate i 10% fosterets bovin serum (FBS) kultur medier. Inkuber celler i en fuktet kammer (5% CO2 på 37 ° C) i 24 timer og tillate dem å nå 70-80% samløpet.
Merk: Hvis cellene ikke har nådd ønsket confluency etter 24 timer, tillate dem å vokse i 10% FBS kultur medier i ytterligere 24 timer. - Vask cellene to ganger med PBS og legge 2 mL serum-fri kultur medier. Inkuber cellene i en fuktet kammer (5% CO2 på 37 ° C) for ytterligere 24 timer.
- Bruker en serologisk pipette, samle betinget media i hver brønn. Sentrifuge media på 1200 rpm til 3 minutter å fjern celle rusk. Ta nedbryting og konsentrere seg med en 15 mL, 10 kDa molekylvekt cutoff sentrifugal filter enhet. Virvel filter enheter på 4000 x g i 15 min i en svingende bøtte rotor eller 5000 x g i 15 min i en fast vinkel rotor.
Merk: Dette trinnet er valgfritt, men kan øke intensiteten av proteolytisk bandene i peptid zymography gels. - Overføre konsentrert filtratet slik frisk 1,5 mL sentrifuge. Aliquot og lager samples ved-80 ° C i opptil tre fryse-Tin sykluser.
- Plate 40.000 celler/cm2 celler i en 6-vel plate i 10% fosterets bovin serum (FBS) kultur medier. Inkuber celler i en fuktet kammer (5% CO2 på 37 ° C) i 24 timer og tillate dem å nå 70-80% samløpet.
- Kvantifisere proteininnhold ved hjelp av en standard protein kvantifisering analysen (f.eks BCA, Bradford analysen, etc.).
6. geleelektroforese av biologiske prøver i peptid Zymography Gels
- Oppløse prøver i konvensjonelle zymography eksempel buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% glyserol, 4% SDS, 0,01% bromophenol blå). For celler og vev prøver, anbefales ~ 30 µg totale protein per godt, og 50-100 ng protein for MMP standarder.
- Legge til 400 mL 1 x Tris-Glycine SDS kjører Buffer til gel apparatet. Laste opp til 35 µL av prøve per brønn. Kjøre prøver på 120 V ved 4 ° C i 1,5 timer eller til molekylvekt standarder angi at proteaser rundt er innenfor peptid løse gel lag (som har en synlig oransje farge).
Merk: De fleste MMPs og varianter faller innenfor den 35-100 kDa. Når molekylvekt standarder angir at de vektene er innenfor peptid løse gel laget, kan geleelektroforese stoppes. Det samme prinsippet kan brukes til andre klasser av proteaser med kjente molekylvekt. Hvis det er en interesse i å oppdage flere proteaser over et større utvalg av molekylære vekter, redusere størrelsen på løse gel laget og øke størrelsen på peptid løse gel laget. - Etter geleelektroforese, fjerne geléer fra plast kassetten og vask gels tre ganger i 10 min hver ved romtemperatur under mild agitasjon renaturing buffer med 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2og 5 mM CaCl2 i 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
- Overføre gels utvikle buffer løsninger som inneholder 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 og 5 mM CaCl2 i 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 for 15 min. Erstatt frisk utvikle buffer løsning og ruge gels på 37 ° C mild agitasjon i 24 timer , gjør at geléer er fullt uttrykk i løsningen.
7. avbilding av peptid Zymography Gels
- Etter 24 timer gel bilde gels med et fluorescerende skanner/imager bruke riktige eksitasjon og utslipp filtre. For eksempel de peptid som anvist i representant resultatene er konjugert med Fluorescein og ble fotografert med en eksitasjon filter av 488 nm og et utslipp filter av 521 nm. Bruke riktige filtrene for din fluorophore vil maksimere påvisning av proteolytisk aktivitet.
Merk: Bilder kan også tas med en gel imager utstyrt med en UV-transilluminator, ofte brukt for avbilding av DNA gels med ethidium bromide. Bilde geléer bruker UV-transilluminator (365 nm) innstilling og et utslipp filter 590 nm. - Utføre densitometric evaluering av bandet intensiteter bruker ImageJ som beskrevet andre steder13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med metoden beskrevet her to fluorescerende protease-nedbrytbar peptider ble innlemmet i polyakrylamid gels: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (forkortet til QGIW i tekst og tall) og GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (forkortet til LACW i hele teksten og tallene). ↓ angir området cleavage. QGIW er en kollagen-jeg avledet sekvens utviklet for å oppdage mobilnettet collagenases14. LACW er en sekvens som er optimalisert for påvisning av MMP-14 og MMP-1115. Peptidene er merket med dabcyl (slukkeren) og fluorescein (fluorophore) bruker N-hydroxysuccinimide (NHS) - ester - Amin kjemi11. Det kan være vanskelig å utvikle nye fluorogenic-peptider som har tilstrekkelig fluorescens slukke og er løselig i standard buffere. Derfor er tilpasse peptid sekvenser fra kommersielt tilgjengelige fluorescerende protease underlag med en C terminal cystein ofte en vellykket strategi for å utvikle nye fluorogenic sensorer. For å demonstrere evnen til peptid zymography skille komplekse protease blandinger, betinget media ble samlet inn fra to forskjellige kreftcelle linjer. HT1080 fibrosarcoma cellene og MDA-MB-231 bryst adenocarcinoma var belagt i 10% FBS media i 24 timer, hvoretter media ble erstattet med serum-frie medier for ytterligere 24 timer. Betinget media prøvene ble samlet og konsentrert 10 kDa molekylvekt cutoff sentrifugal filter enheter. Proteininnholdet i media ble målt ved hjelp av en standard µBCA analysen. 30 µg protein fra betinget media var electrophoresed. Positiv kontroller, brønner med type jeg bakteriell collagenase (100 µg) eller renset, aktivert MMP-9 (125 ng) ble også inkludert. Geléer ruges 24 h utvikle buffer tillate MMP spalting av nedbrytbart substrater innen geléer (figur 2) og deretter fotografert. Fluorescerende imaging avdekket mange band var synlig i LACW peptid geléer (figur 2A14), mens bare et enkelt band var tydelig innen QGIW gels (figur 2D14). I forhold til gelatin zymography (figur 2 g14) kunne LACW gels oppdage flere proteolytisk band, demonstrere evnen til peptid zymography å oppdage en rekke proteaser stede i biologiske prøver enn tradisjonelle metoder bruke native underlag.
For å bekrefte identiteten til visualisert bandene som MMPs, peptid zymography gels ble inkubert utvikling buffer som inneholder enten 20 µM GM6001, en bredspektret MMP hemmer eller 10 µM E-64, en generell katepsin hemmer. Behandling av LACW peptid gels med GM6001 (figur 2B14) redusert intensiteten av bandene, mens behandling med E-64 (figur 2C14) hadde ingen synlig effekt. Behandling av QGIW peptid gels med GM6001 resulterte i fullstendig ablasjon tidligere sett band (figur 2E14). Som forventet, har E-64 ikke noen effekt (figur 2F14). I begge peptid geleer, GM6001 hemmet renset MMP-9 aktivitet, men påvirke ikke bakteriell collagenase aktivitet, videre bekrefter at på visualisert fluorescens var et resultat av proteolytiske av MMPs stede i testet biologisk prøver.
Sammenligne sensitiviteten av peptid zymography til gjeldende gull standard, gelatin zymography, ble en sensitivitetsanalyse utført med renset, aktivert MMP-9. Seriell fortynninger av MMP-9 (1-250 ng) ble electrophoresed i LACW, QGIW og gelatin zymography gels (figur 3A14). Utvikling og fluorescerende tenkelig, bandet intensiteter kvantifisert med ImageJ og tomter av normalisert bandet ble generert for å beregne EF50 verdier-konsentrasjonen som produserer 50% av maksimal signal (figur 3B 14). LACW peptid gels kunne oppdage de minste konsentrasjonene av MMP-9, med EF50 verdien 17.28 ng, sammenlignet med QGIW og gelatin zymograms med verdier i 59.50 ng og andel på 31,85 ng, henholdsvis. Disse data indikerer at bruk av peptid zymography kan matche eller overgå følsomhet grensene av innfødte underlag som gelatin.
Figur 1: skjematisk av fluorescerende peptid zymography prosessen. (A) utarbeidelse av flerlags polyakrylamid løse gel. Standard 10% løse gel løsning brukes til det første laget av peptid zymography gel. En andre 10% løse gel laget som inneholder et let, fluorescerende peptid og en azido-PEG3-maleimide koblingsfunksjonalitet molekyl er deretter polymerized over det første laget. Det endelige øverste laget er en 5% stabling gel. (B) Standard geleelektroforese under ikke-reduserende betingelser brukes til å skille protease inneholder prøver functionalized polyakrylamid geléer. Geléer er vasket fjerne SDS og tillate proteiner til renature. Geléer er deretter ruges i en utvikling buffer for 24 h på 37 ° C, slik at proteaser deler fluorogenic peptidene, noe som resulterer i økt fluorescens. Denne fluorescens, samsvarer med protease aktivitet, er fanget med et fluorescerende gel imager excitation av 488 nm og utslipp av 521 nm (tilpasset med tillatelse fra Biotechniques og fremtiden vitenskap14). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: påvisning av celle-utskilles proteaser i menneskets kreftcelle linjer. Analyse av collagenase enzym (100 µg), MMP-9 (125 ng) og betinget cellen media fra HT1080 fibrosarcoma (30 µg) og MDA-MB-231 adenocarcinoma bryst kreft (30 µg) linjer i LACW og QGIW peptid gels. Gels ble behandlet med DMSO (kjøretøy kontroll) (A & D), behandles med GM6001 (B & E) eller behandlet med E-64 (C & F). (G) Gelatin zymogram HT1080 og MDA-MB-231 betinget cellen media (tilpasset med tillatelse fra Biotechniques og fremtiden vitenskap14). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sammenligning av MMP-9 følsomhet peptid og Gelatin Zymograms. (A) QGIW (øverst), LACW (midten) og gelatin (nederst) zymography gels ble utsatt for seriell fortynninger av MMP-9. (B) Normalized band intensiteter var plottet mot MMP-9-konsentrasjon og passer til en fire parameteren variabel skråningen kurve. EF50 verdiene indikerer konsentrasjonen på halv maksimal signalet. Resultater vises som n = 3, mener SD (tilpasset med tillatelse fra Biotechniques og fremtiden vitenskap14). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løse Gel | ||||
| Lager Conc. | Siste Conc. | 5 gels | 10 gels | |
| Akrylamid/Bis-akrylamid (19:1) | 40% | 10% | 10 mL | 20 mL |
| Tris-HCl pH 8,7 | 1 M | 0.375 M | 15 mL | 30 mL |
| Natrium Dodecyl Sulfate (SDS) | 20% | 0,10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Deionisert H2O | -- | -- | 14.4 mL | 28.7 mL |
| TEMED | -- | -- | 40 ΜL | 80 ΜL |
| APS | 10% | 0,10% | 400 ΜL | 800 ΜL |
| Totalt volum | 40 mL | 80 mL | ||
| Peptid løse Gel | ||||
| Lager Conc. | Siste Conc. | 5 gels | 10 gels | |
| Akrylamid/Bis-akrylamid (19:1) | 40% | 10% | 5 mL | 10 mL |
| Tris-HCl pH 8,7 | 1 M | 0.375 M | 7.5 mL | 15 mL |
| Natrium Dodecyl Sulfate (SDS) | 20% | 0,10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Deionisert H2O | -- | -- | 6.5 ΜL | 13 mL |
| Fluorescerende peptid | 10 mM | 75 ΜM | 150 ΜL | 300 ΜL |
| Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker | 75 mM | 1.5 mM | 400 ΜL | 800 ΜL |
| TEMED | -- | -- | 20 ΜL | 40 uL |
| APS | 10 | 0,10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Totalt volum | 20 mL | 40 mL | ||
| Stabling Gel | ||||
| Lager Conc. | Siste Conc. | 5 gels | 10 gels | |
| Akrylamid/Bis-akrylamid (19:1) | 40% | 5% | 2,5 mL | 5 mL |
| Tris-HCl pH 6,9 | 1 M | 0.125 M | 2,5 mL | 5 mL |
| Natrium Dodecyl Sulfate (SDS) | 20% | 0,10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Deionisert H2O | -- | -- | 14.75 mL | 29,5 mL |
| TEMED | -- | -- | 50 ΜL | 100 ΜL |
| APS | 10% | 0,10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Totalt volum | 20 mL | 40 mL | ||
Tabell 1: reagens tabellen for å forberede fluorescerende peptid zymography gels. Konsentrasjoner og volumer for utarbeidelse av flerlags peptid zymography gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gjeldende zymographic teknikker er avhengige av inkorporering av innfødte underlag polyakrylamid gels for påvisning av proteolyse. Mens disse teknikkene har fått utbredt bruk, er de fortsatt begrenset i antall proteaser de kan oppdage. Her, ble en protokoll som beskrevet i hvilke fluorescerende, protease-nedbrytbar peptider er innlemmet i polyakrylamid løse gel. Kovalente kopling med en azido-PEG3-maleimide koblingsfunksjonalitet molekyl aktiverer separasjon og påvisning av flere proteaser enn er for tiden oppnåelige med innfødt underlag. Svært tunable natur fluorescerende peptider gir forskere mulighet til å utforme underlag som kan målrette deres proteaser rundt. Mange peptid underlag har vært identifisert for en rekke proteaser bruke peptid biblioteker, og det er et økende antall kommersielle kilder produksjon egendefinerte peptider. Det kan være vanskelig å utvikle nye fluorogenic-peptider som har tilstrekkelig fluorescens slukke og er løselig i standard buffere. Derfor tilpasse peptid sekvenser fra kommersielt tilgjengelige fluorescerende protease underlag med en C-terminalen cystein er ofte en vellykket strategi for å utvikle nye fluorogenic sensorer.
Mens fullføre denne protokollen, bør forsiktighet utvises ved håndtering fluorescerende peptid gels å hindre overdreven eksponering for lys som dette kan redusere oppdaget fluorescerende signalet. I tillegg, er gjeldende konsentrasjonen av peptid brukes i hver gel 75 µM. Dette kan justeres for å redusere konsentrasjonene spare peptid, holde i tankene at azido-PEG3-maleimide løsningen må legges til løsningen i minst 20 molar overflødig til peptid. Azido-PEG3-maleimide kit kan kjøpes i 3 størrelser (25, 100 og 1000 mg). Forfatterne anbefaler kjøpe 25 mg kit som løsningen kan bare lagres på korte perioder på 20 ° C. Videre er en 25 mg kit tilstrekkelig til å forberede 10 peptid geler, som må brukes innen 3 uker forberedelser.
En av begrensningene for zymography er vanskeligheten i kresne nøyaktig identiteten visualisert protease band på grunn av betydelig overlapping i molekylvekt. I fremtidige studier, vil det være avgjørende å gjennomføre sekundære analyser for å avgjøre deres identitet ved hjelp av teknikker som massespektrometri16,17. En annen begrensning zymography er refolding av proteiner til deres aktive konformasjon etter delvis denaturing av SDS og geleelektroforese. Disse prosessene kan medføre en endring i aktive konformasjon av protease, rendering proteolytically inaktive proteiner, aktiv. For eksempel pro-MMP-2 kan påvises i gelatin zymograms til tross for at hemmende Pro domene intakt forfaller til sin renaturation til en mellomliggende aktiv form. Supplerende metoder som enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) eller Western blotter kan brukes til å bestemme identiteten og totale tilstedeværelsen av en protease rundt.
Denne artikkelen viser bruk av fluorescerende peptid underlag for å øke sensitiviteten av gjeldende zymographic teknikker. Bruker renset MMP-9, ble en konsentrasjon gradient analyse gjennomført sammenligne LACW, QGIW og gelatin zymography gels. Foreløpig gelatin zymography er gullstandarden teknikken som gelatinases (MMP-2 og-9) er oppdaget i biologiske prøver. Sammenligne EF50 verdiene av de tre underlag, hadde LACW peptid gels de laveste verdiene, indikerer høyeste følsomheten. Utnytte ulike peptid sekvenser utformet til å søke etter bestemte proteaser kan potensielt forbedre disse sensitiviteten ytterligere. Behandling av geléer med en MMP aktivering agent som 4-aminophenylmercuric acetate (materialet i Innleggssålene) eller heparin kan også brukes til å øke et svakt signal som beskrevet tidligere18.
I tillegg til måling av protease aktivitet for biologiske studier, er protease-nedbrytbar peptider også ofte brukt for crosslinking syntetisk hydrogels for tissue engineering og stoffet levering. Kontrollert degradering er avgjørende for disse programmene. Foreløpig fornedrelse kinetics av disse peptider kjennetegnes ved hjelp av enkle, renset enzymer. Imidlertid har bestemme hvilke enzymer celler faktisk produsere og er ansvarlig for spalting av disse peptider vært vanskelig å fastslå. Bruk av peptid zymography å kvantifisere celler og vev-spesifikke enzymet utgivelsen vil sterkt hjelpe i rasjonell utformingen av disse peptid crosslinking sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Midler gitt av The Ohio State University College of Engineering, biomedisinsk Engineering avdeling og Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James kreft sykehus og Richard J. Solove Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
