Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.
Bu yöntemin amacı karmaşık biyolojik örneklerin proteolitik aktivite ölçmek etmektir. Örnekleri moleküler ağırlık kullanarak Elektroforez ile parçalanabilir bir substrat gömülü bir çözme jel ile ayrılır. Bu yöntem bir yüzeyi fluorogenic peptid kovalent jelatin veya kazein gibi tam uzunlukta proteinler yerine çözme jel içine dahil geleneksel jel zymography farklıdır. Fluorogenic peptidler proteolitik aktivite ek boyama adımları olmadan doğrudan algılama sağlar. Biyolojik örnekler içinde enzimler floresans içinde bir artış kaynaklanan çeliklerini fluorogenic peptid ayırmak. Jelleri floresan sinyalin sonra Standart Floresan jel tarayıcıyla görüntüsü ve Dansitometresi kullanarak sayılabilir. Parçalanabilir substrat olarak peptidler kullanımı büyük ölçüde zymographic teknikleri ile tespit mümkün proteaz genişletir.
Jel zymography biyolojik örnekleri, vücut sıvıları veya hücre kültür medya1,2,3gibi içinde proteolitik aktivite ölçmek için kullanılan biyolojik bir tekniktir. Örnekleri onların moleküler ağırlıkları aracılığıyla parçalanabilir bir substrat ile gömülü bir polyacrylamide jel elektroforez ile ayrılır. Jelatin, kazein, kolajen ve elastin, matriks metalloproteinazların (MMPs) -1, -2, -3 -7 -8, -9 ve cathepsins1,2 çeşitli ek -11 etkinliğini ölçmek için kullanılan ortak parçalanabilir yüzeylerde dahil , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. sonra Elektroforez, enzim renatured vardır ve jel içinde protein düşmesine izin. Geleneksel jel zymography, jel Coomassie mavi gibi bir protein boya lekeli ve proteaz aktivitesi Yani, beyaz şeritler (protein yıkımı) koyu mavi zemin üzerine sinyal, bir kaybı algılanır.
Burada, jel zymography parçalanabilir substrat kısa bir fluorogenic peptid kovalent polyacrylamide jel (Şekil 1) dahil olduğu, alternatif bir yöntem için bir protokol açıklayın. Sentetik peptidler ikame olarak parçalanabilir yüzeylerde proteaz geleneksel jel zymography yerli protein9ile karşılaştırıldığında daha geniş olarak algılanmasını sağlar. Fluorogenic peptid kovalent bağ peptid difüzyon ve geçiş sırasında jel elektroforez ile önceki yöntemleri9,10gözlenen engeller. Ayrıca, bir fluorogenic substrat kullanımı ek boyama ve de-boyama adımları proteaz aktivitesinin doğrudan algılama sağlar. Bu yöntem genel amacı fluorogenic peptidler zymogram jeller, kovalent Incorporation aracılığıyla biyolojik örneklerde proteaz aktivitesinin algılama olduğunu.
Geçerli zymographic teknikleri yerel yüzeylerde birleşme polyacrylamide jeller proteolizis tespiti için içine güveniyor. Bu teknikler yaygın kullanımı topladı sahip iken, onlar-ebilmek bulmak proteaz sayısında hala sınırlıdır. Burada, bir protokol hangi floresan, proteaz parçalanabilir peptidler jel çözme polyacrylamide dahil edilmiştir tanımlanmıştır. Kovalent kullanarak kaplin bir azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ayrılık ve proteaz daha çok tespiti ile yerel yüzeylerde Şu anda ula…
The authors have nothing to disclose.
Finansman Ohio Devlet Üniversitesi kolej Mühendisliği, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü ve kapsamlı Kanser Merkezi – Arthur G. James Kanser Hastanesi ve Richard J. Solove Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanmıştır.
1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |