Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para una técnica de zymographic modificada en la que se utilizan péptidos fluorescentes como el substrato degradable en lugar de proteínas nativas. Electroforesis de muestras biológicas en isoenzimáticos péptido fluorescente permite la detección de una gama más amplia de las proteasas que las anteriores técnicas de zymographic.
Abstract
El propósito de este método es medir la actividad proteolítica de muestras biológicas complejas. Las muestras están separadas por peso molecular mediante electroforesis a través de un gel de resolución con un sustrato degradable. Este método difiere zymography gel tradicional un péptido fluorógenos apagado se incorpora covalentemente en el gel de resolución en lugar de proteínas completas, como gelatina o caseína. Uso de los péptidos fluorógenos permite la detección directa de actividad proteolítica sin pasos adicionales de tinción. Las enzimas dentro de las muestras biológicas hienden el péptido fluorógenos apagado, dando por resultado un aumento en fluorescencia. La señal fluorescente en los geles es entonces reflejada con un escáner estándar gel fluorescente y cuantifica mediante densitometría. El uso de péptidos como el substrato degradable expande considerablemente las proteasas posible detectables con técnicas de zymographic.
Introduction
Zymography gel es una técnica biológica utilizada para medir la actividad proteolítica en las muestras biológicas, tales como fluidos corporales o células medios de cultivo1,2,3. Las muestras son separadas por sus pesos moleculares con electroforesis a través de un gel de poliacrilamida con un sustrato degradable. Los sustratos degradables comunes incluyen gelatina, caseína, colágeno y elastina, que se han utilizado para medir la actividad de metaloproteinasas de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 y -11, además de una variedad de catepsinas1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. después de la electroforesis, las enzimas son renatured y permitido degradar la proteína en el gel. En zymography tradicional gel, el gel se tiñe con un tinte de proteína, como el azul de Coomassie, y actividad de la proteasa se detecta como una pérdida de señal, bandas (degradación de la proteína) es decir, blanco sobre un fondo azul oscuro.
Aquí, describimos un protocolo para un método alternativo de zymography gel, en el que el sustrato degradable es un cortocircuito, péptido fluorógenos incorporada covalentemente en el gel de poliacrilamida (figura 1). La sustitución de péptidos sintéticos como el sustrato degradable permite la detección de una gama más amplia de las proteasas en comparación con el gel tradicional zymography con proteínas nativas9. Enlace covalente del péptido fluorógenos previene péptido difusión y migración durante la electroforesis en gel con anteriores métodos9,10. Además, el uso de un sustrato fluorógenos permite la detección directa de la actividad de las proteasas sin coloración adicional y pasos de tinción. El objetivo general de este método es la detección de actividad de la proteasa en muestras biológicas mediante la incorporación covalente de péptidos fluorógenos en geles de zymogram.
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Protocol
1. preparación de la capa de Gel de resolución
- Preparar una 10% de poliacrilamida resolver solución gel según la tabla 1. Añadir el Tetramethylethylenediamine (TEMED) y persulfato de amonio (APS) inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.
- Llene un casete de gel mini vacío 1,5 mm a mitad de camino (5 mL) con la solución 10% de gel de resolución.
- Añadir una capa delgada de isopropanol (~ 500 μl) a la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel nivel y evitar burbujas. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (40 min).
2. preparación de la molécula de vinculador de Azido-PEG3-maleimida
- Mientras que la primera capa de gel de resolución es polimerización, recuperar el azido-PEG3-maleimida kit de almacenamiento-20 ° C y deje que los componentes alcancen la temperatura ambiente. Hay dos componentes en cada kit. Frasco 1 contiene un éster de maleimida-NHS, un grisáceo a gris sólido. Frasco 2 contiene azido-PEG3-amina, un aceite ligeramente amarillo.
Nota: Los autores sugieren con el kit de azido-PEG3-maleimida 25 mg como sólo puede ser almacenado por periodos cortos de tiempo (1-2 horas) a-20 ° C después de ser preparado antes de que empiece a degradarse. 25 mg es suficiente para producir 10 geles de péptido. Usar geles dentro de 3 semanas de preparación. - Disolver los componentes de la ampolla 2 el fabricante recomendada volumen de dimetilsulfóxido (DMSO) y vortex por 30 s para los líquidos se han mezclado bien.
- Transferir el contenido de 1 frasco en un matraz de fondo redondo de 100 mL limpio y seco que contiene una barra de agitación.
Nota: Enjuague el frasco con acetona y secar completamente antes de usarlos para evitar que la humedad interfiere con la reacción. - Inmediatamente Inserte un tapón de septum de goma con un diafragma que se puede pinchar con una jeringa en la boca del matraz. Trabajar rápidamente para evitar que la humedad penetre en el matraz.
- Insertar dos 18 agujas de jeringa en el diafragma y conectar uno a un tanque de gas inerte (e.g. gas de argón). Que el gas inerte para llenar el matraz por 3 minutos mezcla los componentes de los frascos 1 y 2 bajo gas inerte para evitar que los productos de reacción indeseable.
PRECAUCIÓN: La segunda aguja de la jeringa es proporcionar una ventilación, lo que permite que el aire atmosférico contenido en el matraz a salir del frasco como llena con gas inerte. ¡No se olvide de incluir una aguja de ventilación! - Apague el gas inerte y separar de la aguja. Utilizando una jeringa, inyectar el contenido completo del Vial 2 al matraz.
- Saque las agujas y jeringas y los componentes de la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente mientras que revuelve.
- Quite el tapón de septum goma y transferir el contenido a un tubo de centrífuga limpio 5 mL. La solución de azido-PEG3-maleimida debe utilizarse dentro de 1 hora a temperatura ambiente.
3. preparación del péptido capa del Gel de resolución
- Una vez que la primera capa de gel de resolución ha polimerizado, retirar la capa de isopropanol. Enjuague la parte superior del gel por Pipetear 1 mL de agua desionizada en la parte superior del gel y luego Vierta el agua.
- Recuperar el péptido fluorescente funcionalizados tiol de almacenamiento de-80 ° C y deje que se descongele a temperatura ambiente.
Nota: El péptido funcionalizados tiol puede ser preparado como se describió anteriormente11,12. Péptidos disponibles en el mercado también se pueden utilizar pero requieren la adición de un residuo de cisteína terminales para permitir la maleimida-tiol, haga clic en la reacción. Disolver el péptido a una concentración stock de 10 mM y almacenar a-80 ° C en pequeñas alícuotas (30 uL) para limitar los ciclos repetidos de congelación y descongelación. - Preparar un 10% solución solución gel que contiene la molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador y el péptido fluorescente según tabla 1. Agregar el TEMED y el APS inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.
- Llene la mitad de la porción restante del cartucho (3 mL) de gel con el péptido resolver la solución en gel.
Nota: Un enfoque multi-capa de gel resolución reduce la cantidad de péptido y enlazador necesario para cada gel. El tamaño de la capa de gel de resolución péptido puede ajustarse para acomodar una gama más amplia de pesos moleculares según sea necesario. - Pipetear una fina capa de isopropanol (~ 500 μl) en la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel nivel y evitar burbujas. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (40 min).
Nota: El péptido fluorescente es sensible a la luz. Mantenga el gel cubierto con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo durante el desarrollo, electroforesis, lavado y preparación del gel. - Retirar la capa de isopropanol y enjuague la parte superior del péptido solución de gel con agua desionizada como en el paso 3.1.
- Si utilizar los geles inmediatamente, vaya al paso 4, de lo contrario, sumergir los geles preparados en 100 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C en una caja de plástico para evitar que el gel se seque. Envuelva la caja en papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo. Los geles pueden almacenarse en PBS durante 3 semanas antes de uso.
4. preparación del Gel de apilamiento
- Preparar una solución de gel de apilamiento 5% según la tabla 1. Agregar el TEMED y el APS inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.
- Llene la porción restante del vacíela de la cassette de gel (2 mL) con la solución de gel de apilamiento.
- Insertar rápidamente un peine del gel de 1,5 mm en la capa de gel de apilamiento, asegurándose de que no hay burbujas permanecen atrapadas debajo de los pozos. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (~ 10 min).
- Suavemente Retire el peine y la cinta de la parte posterior de los cassettes de gel.
5. preparación de muestras biológicas para electroforesis
- Preparar los medios condicionados de la célula, lysates de la célula, homogenados de tejido y estándares MMP como se describe en otros lugares bajo condiciones no reductoras2. No calentar las muestras.
- Por ejemplo, preparar los medios condicionados de la célula como sigue:
- Células en una placa de 6 pozos en 10% suero bovino fetal (FBS) medios de cultivo en placa 40.000 células/cm2 . Incubar las células en una cámara humidificada (5% CO2 a 37 ° C) durante 24 horas y que puedan llegar a 70-80% de confluencia.
Nota: Si las células han alcanzado la confluencia deseada después de 24 horas, permite que crezcan en medios de cultivo 10% FBS por 24 horas. - Lavan las células dos veces con PBS y añadir 2 mL de medio de cultivo libre de suero. Incubar las células en una cámara humidificada (5% CO2 a 37 ° C) por 24 horas.
- Con una pipeta serológica, recoger los medios condicionados de cada pozo. Los medios de comunicación a 1200 rpm durante 3 minutos eliminar cualquier residuo de células de la centrífuga. Tomar el sobrenadante y se concentran con un 15 mL, unidad de corte de filtro centrífugo de peso molecular de 10 kDa. Centrifugue las unidades de filtro a 4.000 x g durante 15 min en un rotor que hace pivotar del cubo o 5.000 x g durante 15 min en un rotor de ángulo fijo.
Nota: Este paso es opcional pero puede mejorar la intensidad de las bandas proteolíticas en los geles de zymography péptido. - Transfiera el concentrado filtrado a un tubo de centrífuga 1.5ml fresco. Alícuota y almacenar las muestras a-80 ° C durante un máximo de tres ciclos de congelación y descongelación.
- Células en una placa de 6 pozos en 10% suero bovino fetal (FBS) medios de cultivo en placa 40.000 células/cm2 . Incubar las células en una cámara humidificada (5% CO2 a 37 ° C) durante 24 horas y que puedan llegar a 70-80% de confluencia.
- Cuantificar el contenido de la proteína usando un análisis de cuantificación de proteína estándar (por ejemplo, BCA, ensayo de Bradford, etc.).
6. electroforesis de biológico muestras en péptido Zymography geles
- Disolver las muestras en solución tampón de muestras convencionales zymography (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, glicerol al 25%, 4% SDS, 0.01% azul de bromofenol). Para las muestras de células y tejidos, se recomienda 30 μg de proteínas totales por pozo y 50-100 ng de proteína para los estándares MMP.
- Añadir 400 mL de 1 x Tris glicina SDS ejecuta Buffer en el aparato del gel. Carga hasta 35 μl de muestra por pozo. Ejecutar las muestras de 120 V a 4 ° C por 1.5 horas o hasta que los estándares de peso molecular indican que las proteasas de interés disponibles dentro el péptido resolver capa de gel (que tiene un color naranja visible).
Nota: La mayoría de MMPs y sus variantes caen dentro del rango de 35-100 kDa. Cuando los estándares de peso molecular indican que los pesos son en el péptido resolver capa del gel, se puede detener la electroforesis. El mismo principio puede aplicarse a otras clases de proteasas con pesos moleculares conocidos. Si hay un interés en la detección de varias proteasas sobre una gama más amplia de pesos moleculares, reducir el tamaño de la capa de gel de resolución y aumentar el tamaño de la capa de gel de resolución de péptido. - Tras la electroforesis, los geles Retire el cartucho de plástico y lavar geles tres veces por 10 min a temperatura ambiente en agitación suave en renaturing buffer que contiene 2,5% Tritón X-100, 1 μm vivencias2y 5 mM CaCl2 en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
- Transferencia de geles para desarrollar solución amortiguadora que contiene 1% Tritón X-100, 1 μm vivencias2 y 5 mM CaCl2 en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, para reemplazar a 15 minutos con el desarrollo de la nueva solución tampón e incubar geles a 37 ° C en agitación suave durante 24 horas , asegurándose de que los geles son completamente sumergidos en la solución.
7. proyección de imagen del péptido Zymography geles
- Después de 24 horas, geles de imagen usando un fluorescente gel escáner/imager usando los filtros de excitación y de emisión adecuados. Por ejemplo, los geles de péptido se muestra en los resultados representativos son conjugados con fluoresceína y se reflejada utilizando un filtro de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 521 nm. Usar los filtros adecuados para el fluoróforo maximiza la detección de actividad proteolítica.
Nota: Imágenes también pueden ser tomadas con un formador de gel equipado con un transiluminador UV, a menudo utilizado para la proyección de imagen de geles de ADN teñidas con bromuro de etidio. Imagen de los geles con el transiluminador UV (365 nm) ajuste y un filtro de emisión de 590 nm. - Realizar evaluación densitométrica de las intensidades de la banda con ImageJ como se describe en otra parte13.
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Representative Results
Empleando el método descrito aquí, se incorporaron dos péptidos proteasa degradable fluorescentes en geles de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abreviado como QGIW en todo el texto y figuras) y GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abreviado como LACW en todo el texto y figuras). ↓ indica el sitio de la hendidura. QGIW es un colágeno-derivé secuencia diseñada para detectar colagenasas celular14. LACW es una secuencia que se ha optimizado para la detección de MMP-14 y MMP-1115. Los péptidos están marcados con dabcyl (quencher) y de la fluoresceína (fluoróforo) usando N-hydroxysuccinimide (NHS) - éster - amina química11. Puede ser difícil desarrollar nuevos péptidos fluorógenos fluorescencia adecuada Temple y son solubles en tampones estándar. Por lo tanto, adaptar secuencias de péptidos de los substratos de proteasa fluorescentes disponibles en el mercado para incluir una cisteina terminal C es a menudo una estrategia exitosa para el desarrollo de nuevos sensores fluorógenos. Para demostrar la capacidad del péptido zymography para separar mezclas complejas de la proteasa, media condicionada fue colectado de dos líneas celulares de cáncer diferentes. Las células de fibrosarcoma HT1080 y células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 fueron plateadas en los medios de comunicación FBS 10% durante 24 horas, después de que los medios de comunicación fue reemplazado con medios libres de suero por 24 horas. Media condicionada las muestras se recolectaron y concentraron usando 10 unidades de filtro centrífugo de corte de peso molecular de kDa. El contenido proteínico de los medios de comunicación se midió usando un análisis µBCA estándar. 30 μg de proteína de medios condicionados fueron electrophoresed. Como controles positivos, los pozos con el tipo la colagenasa bacteriana (100 μg) o purificada, activación de MMP-9 (125 ng) también fueron incluidos. Los geles fueron incubados por 24 h en el desarrollo de búfer para permitir que el escote MMP de los substratos degradables en los geles (figura 2) y luego reflejados. Proyección de imagen fluorescente reveló que numerosas bandas eran visibles dentro de los geles de péptido LACW (figura 2A14), mientras que sólo una única banda era evidente dentro de los geles QGIW (Figura 2D14). En comparación con gelatina zymography (2 de la figura14), fueron capaces de detectar más bandas proteolíticas, demostrando la capacidad del péptido zymography para detectar una gama más amplia de las proteasas presentes en muestras biológicas de LACW geles métodos tradicionales utilizando sustratos nativos.
Para verificar la identidad de las bandas visualizadas como MMPs, geles de zymography péptido se incubaron en tampón de desarrollo que contiene cada 20 μm GM6001, un amplio espectro inhibidor MMP o 10 μm E-64, un inhibidor de catepsina general. Geles de tratamiento del péptido LACW con GM6001 (figura 2B14) disminuyó la intensidad de las bandas, mientras que el tratamiento con E-64 (figura 214) no tuvo ningún efecto discernible. Tratamiento de los geles de péptido QGIW con GM6001 dio lugar a la ablación completa de los grupos vistos anteriormente (Figura 2E14). Como era de esperar, E-64 no tuvo ningún efecto (figura 2F14). En ambos geles de péptido, GM6001 inhibido purificada actividad de MMP-9 pero no afectó colagenasa bacteriana, además verificar que el visualizado aumento de fluorescencia fue consecuencia de la actividad proteolítica de MMPs presentes dentro de la prueba biológica muestras.
Para comparar la sensibilidad del péptido zymography al estándar de oro actual, gelatina zymography, se realizó un análisis de sensibilidad utilizando purificada, activado, MMP-9. Diluciones seriadas de MMP-9 (1-250 ng) fueron electrophoresed en LACW, QGIW y gelatina zymography geles (Figura 3A14). Desarrollo y la proyección de imagen fluorescente, intensidades de banda se cuantificaron con ImageJ y parcelas de la intensidad de banda normalizados fueron generados para calcular EC50 valores-la concentración que produce el 50% de la señal máxima (figura 3B 14). LACW péptido geles fueron capaces de detectar las más pequeñas concentraciones de MMP-9, con un valor de CE50 de 17.28 ng, en comparación con QGIW y gelatina isoenzimáticos con valores de 59.50 ng y 31,85 ng, respectivamente. Estos datos indican que el uso de péptido zymography puede coincidir con o excede los límites de sensibilidad de sustratos nativos como gelatina.
Figura 1: esquema del proceso zymography péptido fluorescente. (A) preparación de la poliacrilamida de múltiples capas solución de gel. Un estándar 10% resolución de la solución en gel se utiliza para formar la primera capa del gel zymography péptido. Una segunda solución 10% gel capa que contiene un péptido apagado, fluorescente y una molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador entonces se polimeriza sobre la primera capa. La capa superior del final es un gel de apilamiento 5%. Electroforesis estándar (B) en no reducir las condiciones se utiliza para separar las muestras que contienen proteasa en los geles de poliacrilamida funcionalizados. Los geles se lavan para eliminar el SDS y permitir que las proteínas de renature. Los geles se incuban entonces en un tampón de desarrollo de 24 h a 37 ° C, permitiendo que las proteasas que desdoblan los péptidos fluorógenos, resultando en aumento de la fluorescencia. Esta fluorescencia, correspondiente con la actividad de la proteasa, es capturada utilizando un toner de gel fluorescente en una excitación de 488 nm y emisión de 521 nm (adaptado con permiso del Biotechniques y futuro ciencia14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: detección de proteasas secretadas por la célula en líneas celulares de cáncer humano. Análisis de enzima colagenasa (100 μg), MMP-9 (125 ng) y los medios de comunicación celular de fibrosarcoma HT1080 (30 μg) y MDA-MB-231 líneas de células de cáncer (30 μg) adenocarcinoma mama en geles de péptido LACW y QGIW. Los geles fueron tratados con DMSO (control del vehículo) (A & D), tratados con GM6001 (B y E) o tratados con E-64 (C & F). (G) zymogram de gelatina de HT1080 y MDA-MB-231 acondicionado media célula (adaptado con permiso del Biotechniques y futuro ciencia14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: comparación de MMP-9 sensibilidad del péptido y gelatina isoenzimáticos. (A) QGIW (parte superior), LACW (medio) y gelatina (abajo) zymography geles fueron sometidos a diluciones seriadas de MMP-9. (B) normalizado banda intensidades fueron graficados contra la concentración de MMP-9 y ajuste a una curva de inclinación variable parámetro cuatro. Valores de CE50 indican concentración en medio de la señal máxima. Resultados se representan como n = 3, significa SD (adaptado con permiso del Biotechniques y futuro ciencia14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gel de resolución | ||||
| Stock Conc. | Concentrado final | 5 geles | 10 geles | |
| Acrilamida/Bis-acrilamida (19:1) | 40% | 10% | 10 mL | 20 mL |
| Tris-HCl, pH 8.7 | 1 M | 0,375 M | 15 mL | 30 mL |
| Sodio dodecil sulfato (SDS) | 20% | 0.10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Desionizada H2O | -- | -- | 14,4 mL | 28,7 mL |
| TEMED | -- | -- | 40 ΜL | 80 ΜL |
| APS | 10% | 0.10% | 400 ΜL | 800 ΜL |
| Volumen total | 40 mL | 80 mL | ||
| Gel de resolución de péptido | ||||
| Stock Conc. | Concentrado final | 5 geles | 10 geles | |
| Acrilamida/Bis-acrilamida (19:1) | 40% | 10% | 5 mL | 10 mL |
| Tris-HCl, pH 8.7 | 1 M | 0,375 M | 7,5 mL | 15 mL |
| Sodio dodecil sulfato (SDS) | 20% | 0.10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Desionizada H2O | -- | -- | ΜL DE 6.5 | 13 mL |
| Péptido fluorescente | 10 mM | 75 ΜM | 150 ΜL | 300 ΜL |
| Azido-PEG3-maleimida CrossLinker | 75 mM | 1,5 mM | 400 ΜL | 800 ΜL |
| TEMED | -- | -- | 20 ΜL | 40 uL |
| APS | 10 | 0.10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Volumen total | 20 mL | 40 mL | ||
| Gel de apilamiento | ||||
| Stock Conc. | Concentrado final | 5 geles | 10 geles | |
| Acrilamida/Bis-acrilamida (19:1) | 40% | 5% | 2,5 mL | 5 mL |
| Tris-HCl, pH 6.9 | 1 M | 0,125 M | 2,5 mL | 5 mL |
| Sodio dodecil sulfato (SDS) | 20% | 0.10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Desionizada H2O | -- | -- | mL 14,75 | 29,5 mL |
| TEMED | -- | -- | 50 ΜL | 100 ΜL |
| APS | 10% | 0.10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Volumen total | 20 mL | 40 mL | ||
Tabla 1: tabla de reactivo para la preparación de péptido fluorescente zymography geles. Concentraciones y volúmenes para la preparación del gel de zymography péptido de múltiples capas.
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Discussion
Zymographic las técnicas actuales se basan en la incorporación de sustratos nativos en geles de poliacrilamida para la detección de la proteólisis. Mientras que estas técnicas han ganado uso extenso, todavía están limitados en el número de proteasas que pueden detectar. Aquí, un protocolo fue descrito en que péptidos fluorescentes, proteasa degradable se incorporan a la solución de gel de poliacrilamida. Covalente acoplamiento usando una molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador permite la separación y la detección de una amplia variedad de proteasas que es actualmente alcanzable con sustratos nativos. La naturaleza altamente armoniosa de péptidos fluorescentes ofrece a los investigadores la capacidad de diseño de sustratos que pueden dirigirse sus proteasas de interés. Se han identificado numerosos sustratos de péptidos para una amplia variedad de proteasas péptido librerias, y hay un número creciente de fuentes comerciales, fabricación de péptidos personalizados. Puede ser difícil desarrollar nuevos péptidos fluorógenos fluorescencia adecuada Temple y son solubles en tampones estándar. Por lo tanto, adaptar secuencias de péptidos de comercialmente sustratos proteasa fluorescente disponible para incluir una cisteína C-terminal suele ser una estrategia exitosa para el desarrollo de nuevos sensores fluorógenos.
Al completar este protocolo, debe tenerse cuidado durante la manipulación de geles de péptido fluorescente para evitar una exposición excesiva a la luz, esto puede reducir significativamente la señal fluorescente detectada. Además, la actual concentración de péptidos utilizados en cada gel es 75 μm. Esto se puede ajustar para bajar las concentraciones de péptido, teniendo en cuenta que la solución de azido-PEG3-maleimida se debe agregar a la solución por lo menos un molar 20 exceso para el péptido de conservar. El kit de azido-PEG3-maleimida puede adquirirse en 3 tamaños (25, 100 y 1000 mg). Los autores recomiendan compra el kit de 25 mg de la solución preparada se puede almacenar sólo en cortos periodos de tiempo a-20 ° C. Además, un kit de 25 mg es suficiente para preparar 10 geles de péptido, que se deben utilizar dentro de 3 semanas de preparación.
Una de las limitaciones de zymography es la dificultad en discernir la identidad exacta de bandas visualizadas proteasa debido a una superposición significativa en los pesos moleculares. En el futuro los estudios, será fundamental para llevar a cabo un análisis secundario para determinar su identidad mediante técnicas como la espectrometría de masas16,17. Otra limitación de zymography es el refolding de proteínas a su conformación activa tras la desnaturalización parcial por SDS y electroforesis. Estos procesos pueden causar un cambio en la conformación activa de la proteasa, representación proteínas proteolytically inactivas, activo. Por ejemplo, pro-MMP-2 puede detectarse en isoenzimáticos de gelatina a pesar de tener inhibitorio Pro-dominio intacto debido a su renaturalización de una forma activa intermedia. Métodos complementarios como análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) o Western Blots puede utilizarse para determinar la identidad y la total presencia de una proteasa de interés.
Este artículo muestra el uso de sustratos de péptido fluorescente para mejorar la sensibilidad de las técnicas actuales de zymographic. Utilizando purificada MMP-9, se realizó un análisis de gradiente de concentración comparar geles zymography LACW, QGIW y gelatina. Actualmente, gelatina zymography es la técnica estándar de oro por el cual la matrilisina (MMP-2 y -9) se detectan en muestras biológicas. Comparando los valores de CE50 de los tres sustratos, LACW péptido geles tuvieron los valores más bajos, lo que indica la sensibilidad más alta. Utilizando secuencias de diversos péptidos diseñadas para la detección de proteasas específicas potencialmente puede mejorar aún más estas sensibilidades. Tratamiento de los geles con un agente que activa MMP como acetato de 4-aminophenylmercuric (APMA) o la heparina también puede utilizarse para impulsar una señal débil como se describió anteriormente18.
Además de la medición de actividad de la proteasa para estudios biológicos, degradables proteasa péptidos son también de uso frecuente para reticulación hidrogel sintético para aplicaciones de entrega de ingeniería y de la droga de tejido. Degradación controlada es fundamental para estas aplicaciones. Actualmente, la cinética de degradación de estos péptidos se caracterizan utilizando enzimas individuales, purificadas. Sin embargo, determinar que las enzimas las células realmente producirán y son responsables de la ruptura de estos péptidos ha sido difícil de determinar. El uso de péptido zymography cuantificar celular y liberación de enzimas específicas de tejido ayudará grandemente en el diseño racional de estas secuencias de reticulación de péptido.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Fondos provistos por el estado Universidad Facultad de ingeniería de la Ohio, Departamento de ingeniería biomédica y el centro integral del cáncer - Hospital de cáncer Arthur G. James y Richard J. Solove Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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