Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Identifiera cell ytan markörer av primära neurala stamceller och stamceller genom metabolisk märkning av Sialoglycan

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/58945
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras här är ett protokoll som kombinerar en in vitro -neural-endotelial Co-Culture system och metabolisk inkorporering av sialoglycan med bioorthogonal funktionella grupper för att expandera primära neurala stamceller och stamceller och märka deras yta sialoglykoproteiner för avbildning eller masspektrometri analys av cell ytan markörer.

Abstract

Neurala stamceller och progenitorceller (NSPCs) är den cellulära grunden för komplexa strukturer och funktioner i hjärnan. De är belägna i specialiserade nischer in vivo och kan isoleras och utvidgas in vitro, som fungerar som en viktig resurs för celltransplantation för att reparera hjärnskador. Emellertid, NSPCs är heterogena och inte klart definierade på molekylär nivå eller renas på grund av brist på specifika cell ytan markörer. Det protokoll som presenteras, som tidigare har rapporterats, kombinerar en neural-endotelial Co-Culture system med en metabolisk glykananalys märkningsmetod för att identifiera ytan sialoglykoproteome av primära nspcs. NSPC-endotelial Co-Culture-systemet möjliggör självförnyelse och expansion av primära NSPCs in vitro, vilket genererar ett tillräckligt antal nspcs. Sialoglycans i odlade nspcs är märkta med en onaturlig sialic Acid metabolisk reporter med bioortogonala funktionella grupper. Genom att jämföra sialoglykoproteome från självförnyande NSPCs expanderat i en endotelial Co-kultur med differentierande neural kultur, identifierar vi en lista över membranproteiner som är berikade i NSPCs. Protokollet omfattar i detalj: 1) uppsättning av en NSPC-endotelial samkultur och NSPC-differentierande kultur. 2) märkning med azidosugar per-O-acetylerade N-azidoacetylmannosamin (AC4mannaz); och 3) biotin konjugation till modifierad sialoglycan för avbildning efter fixering av neurala kulturen eller protein utvinning från neurala kulturen för masspektrometri analys. Sedan, den NSPC-berikad yta markör kandidater väljs genom jämförande analys av masspektrometri data från både den expanderade NSPC och differentierade neurala kulturer. Detta protokoll är mycket känsligt för att identifiera membranproteiner med låg förekomst i utgångsmaterialen, och det kan appliceras på markör identifiering i andra system med lämpliga modifieringar

Introduction

Neurala stamceller definieras som en multipotenta cellpopulation som kan förnyas för att bibehålla en stamcellspool och differentieras till nervceller och glia. De är de stora celltyperna i nervsystemet och kan erbjuda stor terapeutisk potential i regenerativ medicin genom celltransplantation till sjuka och skadade hjärnor1,2. Som utveckling fortsätter, den neurala stamceller befolkningen blir heterogena3,4, och andelen av neurala stamceller i hjärnan minskar gradvis5. Generellt sett, embryonala neurala stamceller och andra neurala stamceller, kallas kollektivt neurala stamceller och stamceller (NSPCs), finns i de embryon zoner, ventrikulär zon, och subventrikulär zon i möss6. I den embryonala hjärnan, neurala stamceller generera nervceller direkt eller indirekt genom mellanliggande stamceller (IPCS), och i vissa arter genom den yttre subventrikulär zon progenitorer (oRGs)7,8. Den specifika molekylära signatur, morfologi, lokalisering i stamceller nisch, och differentiering potential alla bestämma vilken roll varje subtyp i hjärnans organogenes och kliniska tillämpningar9. De tillgängliga cell ytmarkörerna kan dock inte entydigt diskriminera och rena olika undertyper av NSPCs, vilket begränsar förståelsen och utnyttjandet av dessa undertyper.

Identifieringen av primära NSPCs-ytmarkörer begränsas av tre stora hinder. Den första är den begränsade cellantal NSPCs i vävnaden, vilket gör det svårt att förbereda cell ytan protein prover för vanliga masspektrometri analys. Den andra begränsningen är svårigheten att producera rena cell undertyper för att generera subtypspecifika membranprotein data. Slutligen är den tredje utmaningen den låga kvoten av cellytproteiner i hela cellproteiner, vilket hämmar deras detektionskänslighet genom masspektrometrianalys.

För att övervinna dessa problem, utvecklade vi en chemoproteomic metod för att selektivt berika och identifiera cellyta proteiner i primära NSPCs genom metaboliskt märkning av sialoglykoproteiner10. För att generera ett tillräckligt antal nspcs, drog vi fördel av ett etablerat protokoll för att expandera och underhålla primära embryonala nspcs i odifferentierade tillstånd in vitro, genom Co-culturing nspcs med mus hjärnan endotelcelllinjer med hjälp av en genomsläpplig stöd Matrix INSERT (t. ex. transwell) system11. I motsats, npscs odlade ensam utan endotelceller generera differentierade avkomma11,12. Sålunda, protein prover från dessa två kultur system kan vara jämförelsevis analyseras för att identifiera proteiner som är differentially uttrycks i NSPCs och differentierade nervceller. Eftersom de flesta cell ytan proteiner modifieras av sialic Acid13, onaturliga sialic Acid föregångare analog N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC4mannaz) användes för att kapa den inneboende metaboliska vägen så att endogena, nyligen syntetiserade sialoglycans är märkta med azid grupper, generera ett kemiskt handtag14. Genom azido-alkyne-medierade biologiska ortogonala reaktioner, som konjugera biotin till sialoglycans, kan cellytproteiner visualiseras och berikas för proteomisk identifiering genom en streptavidin-kopplad fluorophore eller Matrix14.

Här utför vi färgning av SDS-PAGE gel analys av ytan sialoglykoproteome från NSPCs expanderat i en endotelial samodling och differentiera celler i en icke-Co-kultur system. Vi rengör också selektivt ytan sialoglykoproteome i de två kultur system för proteomisk jämförelse. Vårt protokoll, jämfört med den traditionella centrifugering-baserade cell ytan renings protokoll15, ökar utvinning effektivitet genom att minska ytan protein utvinning förfaranden genom specifika tagg konjugering och samhörighet Rening. Samtidigt ökar det utvinning renhet cell ytan proteiner bygger på förutsättningen att sialylation sker mestadels på cellytan proteiner. Även om endoteliala faktorer inte helt kan blockera differentiering av expanderade NSPCs, är den jämförande studien mellan en samkultur och differentierad kultur en praktisk metod för att lokalisera stamceller-berikade ytproteiner utan att behöva analysera proteiner från NPCs renade av FACS16. Vi anser att detta tillvägagångssätt kan tillämpas på studier av ytproteiner i andra system med lämpliga modifieringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur protokoll som används i denna studie godkändes av IACUC (institutionella djuromsorg och användning kommittén) av Tsinghua University och utförs i enlighet med riktlinjer för IACUC. Laboratorie djuret anläggningen vid Tsinghua University har ackrediterats av AAALAC (Association för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International). För iscensättning av embryon, mitt på dagen av vaginalpluggen identifierats beräknades som embryonala dag 0,5 (E 0.5).

Anmärkning: Alla celler odlas i cellinkubatorn under betingelser 37 ° c och 5% CO2.

1. beredning av mus endotelial kultur i permeable stöd skär

Anmärkning: BEND3-celler upprätthålls enligt tillverkarens anvisningar.

  1. Bered BEND3 cell medium (BM) genom att tillsätta 50 mL FBS och 5 mL penicillin-streptomycin i 500 mL DMEM och blanda väl.
  2. Aspirera mediet från skålen och tvätta BEND3 cells kulturen med 1 mL PBS en gång. Tillsätt 1 mL 0,25% trypsin-EDTA i cellerna och inkubera cellerna i 4 min vid 37 ° c.
  3. Tillsätt 1 mL BM i cellerna för att neutralisera trypsin-EDTA och Pipettera upp och ner försiktigt för att helt separera cellerna. Överför cellsuspensionen till ett nytt 15 mL koniskt rör och pellet genom centrifugering vid rumstemperatur (RT) i 5 min vid 400 x g.
  4. Aspirera supernatanten från röret och Omsuspendera cellerna med 9 mL färsk BM, tillsätt sedan 1 mL cellsuspension till en permeabel stödinsats. Tillsätt ytterligare 2 mL färsk BM per brunn i matrisens botten kammare. Fortsätt att odla cellerna under en dag.

2. beredning av mus primär kortikal NSPCs kultur

  1. Beredning av odlingsplattan, papain matsmältningen medium, och kortikala anhängare kultur medium (AM)
    1. Coat 6-väl plattor med poly-L-lysin (PLL) genom att tillsätta 1 mL PLL lösning per brunn in i 6-brunn plattor. Inkubera sedan plattorna vid RT i 30 minuter.
    2. Överför PLL-lösningen till ett 15 mL koniskt rör. Tvätta plattorna 3 gånger med dubbelt destillerat vatten. Lufttorka plattorna och Lägg dem åt sidan tills de används.
    3. Förbered papain matsmältningen mediet genom att tillsätta 50 U papain, 50 μL av L-glutamin, och 50 μL av 100 mg/mL acetyl-L-cystein i 5 mL av DMEM. Blanda mediet kort och värm det till 37 ° c i 30 minuter för enzym aktivering.
    4. Förbered kortikal cell anhängare kultur medium (AM): Tillsätt 500 μL av L-glutamin, 500 μL av natriumpyruvat, 500 μL av 100 mg/mL N-acetyl-L-cystein, 500 μL av N2, 1 mL B27, och 5 μL av 100 μg/mL bFGF i 50 mL DMEM. Blanda mediet väl och värm det till 37 ° c före användning.
  2. Beredning av primära cerebral kortikala celler och efterföljande plätering
    1. Offra en E 10.5 Timed gravid mus genom livmoderhalscancer dislokation.
      Anmärkning: Vid E 10.5, en majoritet av cellerna sprider sig NSPCs i hjärnbarken, vilket ger upphov till stora kloner av avkomma in vitro-.
    2. Sterilisera buken med 75% etanol. Använd fin sax och mikro-tandade pinken för att öppna buken genom att skära huden och underliggande muskler längs den högra sidan av mittlinjen. Ta bort livmodern från bukhålan försiktigt med tandad tång och skär ut den från bukhålan med fin sax.
    3. Tvätta livmodern med 40 mL förkyld HBSS i 10 cm petriskål. Överför sedan livmodern till en ny 10 cm petriskål och tvätta den igen med 40 mL förkyld HBSS.
    4. Överför livmodern till en ny 10 cm petriskål med 40 mL förkyld HBSS. Ta bort embryon från livmodern och fosterhinnan, sedan klippa huvuden av embryon från stammar med juvelerare microforceps.
    5. Tvätta huvudena med 40 mL förkyld HBSS och överför huvudena till en ny 10 cm petriskål med 40 mL förkyld HBSS. Använd juvelerare microforceps att skala bort hud och brosk som täcker hjärnor, sedan klippa hjärn cortices bort och samla dem i en 15 mL koniskt rör med pre-kyld HBSS.
    6. Pelleten cortices genom centrifugering för 3 min vid 4 ° c och 300 x g. Aspirera supernatanten från röret, tillsätt sedan aktiverat papain digestionsmedium och 15 μL 4 mg/mL DNase I i vävnadpelleten.
    7. Omsuspendera vävnaden pelleten kort genom mild vortexing. Inkubera vävnaden vid 37 ° c i 30 min. Under denna tid, lossa vävnaden med kort vortexa varje 10 min.
      Anmärkning: I slutet av matsmältningen bör det inte finnas några synliga Vävnadsdelar i röret.
    8. Pelleten kortikala celler genom centrifugering i 10 min vid 4 ° c och 450 x g. Aspirera supernatanten från röret och tvätta cellpelleten med förkyld DMEM. Upprepa detta steg en gång.
      Anmärkning: Under matsmältningen och tvättning, ta försiktighet att inte Pipettera vävnader och cellpelleten ungefär för att undvika att skada cellerna med en stark skjuvning kraft.
    9. Aspirera supernatanten från röret tillsätt sedan 1,5 mL förkyld HBSS i röret. Separera kortikala cellpelleten i enstaka celler med skonsam pipettering. Räkna cellnumret med en hemocytometer.
    10. Tillsätt 2 mL AM och 2 x 104 kortikala celler per brunn i 6-brunn plattor. Inkubera plattan vid 37 ° c och 5% CO2 för 3 h för att låta cellerna fästa på plattan.

3. Set-up av neural-endothelial Co-kultur och AC4Mannaz märknings system

  1. En dag efter plätering BEND3 celler i skär, försiktigt aspirera mediet i botten kammaren först, sedan skären. Tvätta enface av skären 3 gånger med förvärmda DMEM. Tvätta skärens yttre yta genom att skölja med förvärmd DMEM.
  2. Tillsätt 1 mL förvärmda AM i ett skär och överför sedan insatserna till brunnarna med primära kortikala celler. Inkubera samkulturen vid 37 ° c och 5% CO2 för 12 h.
  3. Lös upp AC4mannaz i DMSO för att uppnå en lager koncentration på 200 mm. 12 h efter inrättandet av neural-endothelial Co-kultur, tillsätt 1 μL AC4mannaz lager per botten kammare och 0,5 μl av beståndet per insats i medkulturen. Skaka plattorna omedelbart och försiktigt för att blanda mediet väl. För kontroll cellerna lägger du till samma volym av DMSO.
  4. Odla cellerna i ytterligare 5 dagar vid 37 ° c och 5% CO2. Förbered am med 10X bFGF som påfyllning medium (RM). Under denna tid, tillsätt 100 μl av RM per insats och 200 μl RM per botten kammare för att föda upp endotelceller och neurala celler varannan dag. Under Refeeding, inte leverera AC4mannaz eller DMSO in i kulturen.

4. Immunofluorescerande färgning av Sialoglykoproteiner i expanderade primära NSPCs och differentierade neuroner

  1. Förbered BTTAA-CuSO4 Complex 1 30x lager som innehåller 1,5 mm CuSO4 och 9 mm bttaa i dubbeldestillerat vatten. Förbered nyligen biotin-konjugerad buffert 1 innehållande 50 μM biotin-alkyne, 2,5 mM natriumaskorbat och 1x BTTAA-CuSO4 -komplex i PBS.
  2. Ta bort skären från samkulturplattorna. Aspirera kultur mediet från botten brunnar och tvätta neurala celler en gång med förvärmda PBS.
  3. Sug upp PBS från brunnarna. Tillsätt 1 mL förkyld 4% PARAFORMALDEHYD PBS-lösning per brunn in i cellerna och fixera cellerna vid RT i 10 min. Sedan, tvätta cellerna 3 gånger med pre-kyld PBS.
  4. Aspirera PBS från brunnarna och tillsätt 1 mL nyberedd biotinkonjugerad buffert 1 per brunn in i cellerna. Inkubera cellerna vid RT i 10 minuter.
  5. Aspirera reaktionsbufferten från brunnarna. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS. Förbered färgbufferten som innehåller 1% FBS och 1 μg/mL Alexa fluor 647-streptavidin. Tillsätt 1 mL färgbuffert per brunn in i cellerna och inkubera cellerna vid RT i 30 minuter.
  6. Aspirera färgbufferten från brunnarna och de tvättade cellerna 3 gånger med förkyld PBS. Bered blockeringsbufferten med 5% BSA och 0,3% nonjondisk medel-100 i PBS. Tillsätt 1 mL blockerande buffert per brunn i cellerna och inkubera vid RT i 10 minuter.
  7. Bered en primär antikropps lösning genom att späda anti-nestin-och anti-β-tubulin III-antikropparna tillsammans i blockeringsbufferten vid förhållandet 1:20 respektive 1:1000. Ta bort blockeringsbufferten från brunnarna och tillsätt 1 mL primär antikropps lösning per brunn in i cellerna. Inkubera cellerna vid 4 ° c över natten.
  8. Ta bort den primära antikroppslösningen från brunnarna. Tvätta cellerna 3 gånger med förkyld PBS. Förbered en sekundär antikropps lösning genom att späda Alexa fluor 488 Goat anti-mus IgG1, Alexa fluor 546 Goat anti-Mouse IgG2b, och DAPI tillsammans till blockerande buffert vid en utspädning av 1:1000. Aspirera PBS från brunnarna och tillsätt 1 mL sekundär antikropps lösning per brunn in i cellerna. Inkubera cellerna vid RT för 2 h.
  9. Aspirera antikroppslösningen från brunnarna och tvätta cellerna 3 gånger med förkyld PBS. Efteråt är cellerna redo för bildfångst.

5. rening av Sialoglykoproteiner från expanderade primära NSPCs och differentierade neuroner

  1. Förbered BTTAA-CuSO4 Complex 2 15x lager som innehåller 1,5 mm CuSO4 och 3 mm bttaa i dubbelt destillerat vatten. Bered proteinresuspension buffert A som innehåller 4% SDS och 10 mM EDTA i dubbelt destillerat vatten; protein resuspension buffert B som innehåller 150 mM NaCl, 50 mM trietanolamin, och 1% polyoxyetylenoleyl eter (t. ex. Brij97) i dubbeldestillerat vatten med pH 7,4. Före användning, blanda buffert A:buffert B = 1:8 (VOL/VOL) för att förbereda hela proteinet resuspension buffert. Förbered proteintvättbuffert 1 som innehåller 2% SDS i PBS; protein tvätt buffert 2 som innehåller 8 M urea i 250 mM ammoniumbikarbonat (ABC); och protein tvätt buffert 3 som innehåller 2,5 M NaCl i PBS.
  2. Ta bort skären från samkulturplattorna. Aspirera kulturen mediet från botten brunnar och tvätta neurala celler en gång med pre-kyld PBS.
  3. Aspirera PBS från brunnarna och tillsätt 200 μL förkyld RIPA buffert per brunn i plattorna. Inkubera plattorna på isen i 5 min. samla proteinlys i 1,5 mL rör. Pelleten Cellrester genom centrifugering i 10 min vid 4 ° c och 12 000 x g.
  4. Överför supernatanten till nya 1,5 mL-rör. Bestäm protein koncentrationen med BCA-satsen enligt tillverkarens anvisningar. Justera protein koncentrationen till 1 mg/mL.
  5. Tillsätt 100 μM alkyne-biotin, 2,5 mM natriumaskorbat och 1x BTTAA-CuSO4 Complex 2 till 1 ml protein Lys och blanda lösningen väl. Inkubera blandningen vid RT för 1 h.
  6. Överför reaktions lösningen till 20 mL förkyld metanol i ett 50 mL koniskt rör. Blanda väl och inkubera vid-30 ° c över natten för att fälla ut proteinerna.
  7. Pellets proteinet fälls genom centrifugering i 15 min vid 4 ° c och 4 500 x g. Tvätta proteinpelleten två gånger med 20 mL förkyld metanol. Aspirera supernatanten från röret. Återsuspendera proteinpelleten med 4 mL proteinresuspension-buffert och överför proteinhalten till ett nytt 15 mL koniskt rör.
  8. Ta 50 μl av konjugerat pärlor och tvätta dem 3 gånger med PBS. Tillsätt de tvättade pärlorna i proteinet resuspension. Inkubera lösningen vid 4 ° c i 3 timmar på en vertikal Rotator med en rotationshastighet på 20 varv/min.
  9. Tvätta pärlorna sekventiellt med 6 typer av buffertar: protein tvätt buffert 1, protein tvätt buffert 2, protein tvätt buffert 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC och 0,05 M ABC.
  10. Efter tvättning, Omsuspendera pärlorna med 20 μL PBS och överför pärlorna till ett nytt 1,5 mL-rör. Tillsätt 20 μL 2x proteininlastningsbuffert i pärlorna och behandla vid 95 ° c i 10 min. Proteinet proverna skulle då bli utsätta för till SDS-sida och fläckade med Coomassie glänsande blå R-250 Alt efter fabrikanten ' instruktionerna. Skär proteiner i gel som indikeras av Coomassie lysande blå R-250 för masspektrometri analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hela förfarandet för in vitro-expansion och metabolisk märkning av primära embryonala NSPCs tar 6 dagar (figur 1a). Kvaliteten på BEND3-celllinjen och nyligen isolerade primära NSPCs är nyckeln till ett lyckat experiment. BEND3 celler är källan till lösliga faktorer som stimulerar självförnyelse och spridning av NSPCs. Det bör säkerställas att de BEND3 cellerna är fria från kontaminering och dela aktivt med minimal celldöd innan Co-odling med neurala celler. De primära NSPCs måste förberedas noggrant för att undvika överskotts skador under dissociation. Skadade NSPCs kan fortfarande växa och differentiera; emellertid, de kan inte svara på endoteliala stimuli väl för att bibehålla stemness och expandera. Extra försiktighet bör iakttas för att vara aseptisk under cellodling, eftersom protokollet inte tyder på tillsats av antibiotika till det primära odlingsmediet.

Framgångsrik endotelial Co-kultur kommer att leda NSPCs att bilda stora, blad-liknande kloner. Sådan skisserat klon formerna bli tydlig på dag 4 och är mycket typisk på dag 6. Inom klonerna upprätthåller cellerna nära kontakt med varandra. Immunofärgning med antikroppar mot NSPC-markören Nestin och den neuronala markören β-tubulin III bör avslöja att i klonen, de flesta av cellerna är Nestin+ nspcs och mycket få är β-tubulin III+ neuronala celler. Däremot är andelen Nestin +-celler och β-tubulin III+ neuronala celler i klon som bildas i icke-medkultursystem nästan desamma (figur 1b, 1doch 1e).

Den kemiska reporter, AC4mannaz, är en metabolisk analog och kan införlivas i den inneboende proteinet sialylation väg. Höga doser av AC4mannaz är giftiga för celler. För varje specifik typ av cell, märkning koncentrationen av AC4mannaz bör förtestas för att uppnå högsta märkning effektivitet utan betydande cytotoxicitet. Här är den optimerade märknings koncentrationen av AC4mannaz för primär nspc 100 μm. kombinatorisk utvärdering av celldöd indikerat av cell-och kärnor morfologi antyder denna märkning koncentration orsakar inte uppenbara cytotoxiska effekter och är effektivt kunna märka NSPCs (figur 1c och 1d). Den klonala morfologin, självförnyelse, och differentiering potential nspcs i både endotelceller Co-kultur och icke-Co-kultur-systemet påverkas inte (figur 1c, 1d, och 1e).

Den framgångsrika märkningen av NSPCs av AC4mannaz kan undersökas efter konjugating biotin till en kultur som medieras av en bioortogonal reaktion mellan azid och alkyne. Varje cell i AC4mannaz-märkta kulturen är fläckig och visualiseras med Alexa fluor 647-streptavidin. Ingen cell är positiv för Alexa fluor 647-streptavidin färgning i DMSO kontrollgruppen. Dessutom, protein prover som framställts från AC4mannaz-märkta kulturen genom biotin konjugation och konjugerat pärlor rening visar stark Coomassie lysande Blåfärgning signal i SDS-Page Gels. Under tiden fanns det bara färgning bakgrund och icke-specifika bindande signaler i banorna laddade med protein prover från DMSO kontrollgruppen. Detta indikerar också effektiv märkning av NSPCs av AC4mannaz (figur 1f).

Figure 1
Figur 1 : Identifiering av cellytmarkörer för primära NSPCs assisterad av endotelial Co-Culture system och metabolisk sialoglycan-märkning. (A) schematiskt av arbetsflödet för protokollet. Denna siffra har modifierats från Bai et al. 10. de BEND3 cellerna är seedade i Matrix infogar på D0. Beredningen av primära kortikala NSPCs och uppsättning av co-Culture system utförs på D1. Metabolisk märkning av kulturen varar från D2 till D6. Kultur återmatning sker på D3 och D5. B) Immunofluorescerande bilder för kloner som bildas av primär NSPCs efter 5-dagarskultur med eller utan endotelceller. Skalstapeln indikerar 20 μm. (C) ljusa fält bilder för kloner som bildas av primära NSPCs efter en 5-dagars kultur med AC4mannaz eller DMSO. Kärvar var motmålat av DAPI. Skalstapeln indikerar 20 μm. Fel fältet indikerar SEM (NS = inte signifikant). D) de Immunofluorescerande bilderna för NSPC bildade kloner i den endoteliala medkulturen med AC4mannaz eller DMSO. Streckad cirkel avgräntar en enda neural klon. Skalstapeln indikerar 50 μm. (E) kvantifiering av NSPCs och differentierade nervceller i kloner som bildas av NSPCs i endotelial Co-Culture och icke-Co-Culture system med AC4mannaz märkning eller DMSO kontroll. Fel fältet indikerar SEM (* * * p < 0,0005; ns = inte signifikant). (F) Coomassie lysande Blåfärgning av proteiner renas genom konjugerat pärlor från neurala celler märkta med AC4mannaz eller DMSO i endotelceller Co-kultur och nonco-kultur system. 55 kD-bandet i kontroll märknings grupper representerar icke-specifika bindande proteiner. (B, C, E och F) som motsvarar detta protokoll har anpassats från Bai et al. 10. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ytmarkörer används ofta för att märka och rena specifika celltyper in vitro och in vivo17,18. Upptäckten av ytmarkörer bidrar i hög grad till regenerativ medicin och stamcells forskning genom att tillhandahålla molekylära verktyg för att selektivt berika en stamcells population från normala eller patologiska vävnader och kultur rätter, som erbjuder en renad cell resurs för klinisk användning eller studiet av biologiska egenskaper. Framstegen med att utveckla ytmarkörer för neurala stamcells forskning har dock varit långsamma på grund av svårigheten att isolera stamceller från primär vävnad. Det protokoll som beskrivs här bygger på en förenklad in vitro-plattform. Genom att jämföra primära NSPCs expanderat med en endotelial Co-kultur till en differentierande neurala kulturen, proteiner differentially uttrycks i utökade NSPCs markeras och möjliggöra ytterligare identifiering. Vårt protokoll ger också en alternativ strategi för att rena cellytan proteiner genom kapning den inneboende metaboliska vägen till etiketten sialoglycan med bioorthogonal grupper. Jämfört med traditionella protokoll för rening av cellytan proteiner, fördelarna med detta protokoll stöds av två specifika egenskaper: 1) prevalensen av sialylering på cellytan proteiner säkerställer maximal täckning av cellytan Proteome, och 2) reaktionen specificitet mellan den bioortogonala gruppen och dess ligander beviljar renhet av den förvärvade ytan Proteome. Därför resulterar vårt protokoll i en känsligare proteomisk analys när det gäller mindre utgångsmaterial. Vi har visat att detta protokoll är genomförbart i primära NSPCs-ytmarkörer. Med lämpliga modifieringar på expanderande stamceller in vitro kan detta kemoproteomiska tillvägagångssätt vara förenligt med att identifiera ytmarkörer av andra stamcells typer. Det är anmärkningsvärt att som Ac4ManNAz är per-O-acetylated det kan leda till konstgjorda S-glykosylering. Användningen av unacetylated onaturliga sockerarter kan undvika artefakt bildandet och förbättra specificitet och giltighet av metabolisk glykananalys märkning i levande celler19.

Beredning av primära kortikala neurala progenitorceller och endotelceller är kritiska steg i protokollet. Först, när smälta embryonala kortikala vävnader, digestionstid, mängd enzym, och styrkan i hanteringen måste kontrolleras noggrant. Överdriven matsmältning och mekaniska skjuvning krafter kommer att skada integriteten av plasmamembran och cellytan receptorer som förmedlar signaltransduktion för cellöverlevnad och tillväxt, och de kommer också att störa lyhördhet av NSPCs till stimulering av endotelceller och deras självförnyelse förmåga. För att uppnå ordentlig matsmältning, måste försöksledaren aktivera papain helt och stoppa matsmältningen så snart vävnads blocken försvinner. För det andra, BEND3 celler måste upprätthållas i ett hälsosamt tillstånd att stödja utsöndringen. Det rekommenderas att använda BEND3 cell partier med färre passager och passage cellerna innan de når 100% Confluence. Detta kommer att förhindra cellcykeln gripande och åldras orsakas av DNA-skador ackumulerade under passaging eller genom överfulla kontakt mellan celler.

Sekvenseringsteknik med högt dataflöde ökar identifieringen av cellytmarkörer genom att analysera RNA-uttryck, särskilt för celltyper, inklusive vävnads stamceller, som ofta förekommer in vivo i mängder för små för att utföra proteomet-analys genom masspektrometri. Även om RNA-SEQ-analys kan identifiera gener som uttryckligen uttrycks i NSPCs, kan det inte riktigt återspegla protein uttrycks nivåer, eftersom RNA-uttrycket inte alltid överensstämmer med protein uttrycket20. Dessutom är icke-proteinbiomolecules som kan fungera som ytmarkörer inte kan upptäckas genom transkriptomiska studier. Till exempel är oligosackarid Lewis X en välkänd yta Maker används ofta för att märka mänskliga embryonala stamceller och NSPCs, även om det kan associeras med flera proteiner21. Därför är direkt masspektrometri analys ännu inte utbytbar, och utvecklingen av metoder som kan göra masspektrometri analys mer genomförbart och bekvämt är av stort intresse för framtida studier.

Förutom sialylering, andra typer av post-translationella proteinmodifieringar spelar en viktig roll i att reglera funktioner av modifierade proteiner. Dessa modifieringar påverkar protein egenskaper såsom konformation, halveringstid, och subcellulär lokalisering22,23. Flera proteinmodifieringar har celltyp specificitet24,25,26. Med det växande innehållet i den kemiska verktygslådan kan fler modifieringstyper vara mottagliga för metabolisk märkning med kemiska reportrar27. Därför kan den kemiska metod som beskrivs här användas för att studera andra skillnader i proteinmodifiering mellan stamceller och differentierade celler, vilket illustrerar de molekylära mekanismerna bakom upprätthållandet av stamcells egenskaper och differentiering Förordning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Figur 1b, 1c, 1e och 1f återges från Bai et al . 10 med tillstånd från Kungliga kemi förbundet. Vi tackar Yi Hao i X. C. ' s Lab för figur redigering. Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation i Kina (nr 91753206 till Q. S. och X. C., nr 31371093 till Q. S., och nr 21425204 och 21672013 till X. C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
Basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2x Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1,000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
Alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
Sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1,000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
Urea Sigma U5378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Tags

Neurovetenskap metabolisk glykananalys märkning sialic syror bioorthogonal reaktion neurala stamceller stamceller ytmarkörer endotelceller Proteome kemisk märkning hjärnbarken
Identifiera cell ytan markörer av primära neurala stamceller och stamceller genom metabolisk märkning av Sialoglycan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q.… More

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter