Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Identifisere Cell Surface markører for primær neural Stem og stamceller ved metabolsk merking av Sialoglycan

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/58945
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Brain and Spinal Cord Innovative Research Center of Tongji Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University and Frontier Science Research Center for Stem Cells of Ministry of Education, 2College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Synthetic and Functional Biomolecules Center, and Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en protokoll som kombinerer en in vitro neural-endothelial co-kultur system og metabolsk innlemmelse av sialoglycan med bioorthogonal funksjonelle grupper for å utvide primære nevrale stammen og stamceller og merke deres overflate sialoglycoproteins for bildebehandling eller masse-massespektrometri analyse av celleoverflaten markører.

Abstract

Neural Stem og stamceller (NSPCs) er det cellulære grunnlaget for de komplekse strukturene og funksjonene i hjernen. De er plassert i spesialiserte nisjer in vivo og kan isoleres og utvides in vitro, tjene som en viktig ressurs for celle transplantasjon å reparere hjerneskade. Men NSPCs er heterogene og ikke klart definert på molekylnivå eller renset på grunn av mangel på spesifikke celleoverflaten markører. Protokollen presentert, som tidligere har blitt rapportert, kombinerer en neural-endothelial co-kultur system med en metabolsk glycan merkingsteknikker metode for å identifisere overflaten sialoglycoproteome av primære NSPCs. Den NSPC-endothelial co-kultur systemet tillater selv-fornyelse og utvidelse av primære NSPCs in vitro, genererer et tilstrekkelig antall NSPCs. Sialoglycans i kultivert NSPCs er merket med en unaturlig Sialic acid metabolske reporter med bioorthogonal funksjonelle grupper. Ved å sammenligne sialoglycoproteome fra selv fornyelse NSPCs utvidet i en endothelial co-kultur med differensiering neural kultur, identifiserer vi en liste over membran proteiner som er beriket i NSPCs. I detalj, innebærer protokollen: 1) oppsett av en NSPC-endothelial co-kultur og NSPC differensiering kultur; 2) merking med azidosugar per-O-acetylert N-azidoacetylmannosamine (AC4ManNAz); og 3) biotin Bøyning til modifiserte sialoglycan for Imaging etter fiksering av Neural kultur eller protein utvinning fra neural kultur for masse massespektrometri analyse. Deretter blir NSPC-beriket overflate markør kandidater valgt av sammenlignende analyse av masse massespektrometri data fra både den utvidede NSPC og differensiert nevrale kulturer. Denne protokollen er svært følsom for å identifisere membran proteiner av lav overflod i Start materialene, og det kan brukes til markør oppdagelse i andre systemer med hensiktsmessige modifikasjoner

Introduction

Neural stamceller er definert som en Multipotent celle befolkning som kan selv fornye å opprettholde en stilk cellen bassenget og differensiere til neurons og glia. De er de store celletyper i nervesystemet og kan tilby store terapeutiske potensialet i regenererende medisin gjennom celle transplantasjon i syke og skadde hjerner1,2. Som utvikling provenyet, blir nevrale stilk cellen befolkning heterogene3,4, og andelen av nevrale stamceller i hjernen avtar gradvis5. Generelt, embryonale nevrale stamceller og andre nevrale stamceller, kollektivt kalt neural Stem og stamceller (NSPCs), ligger i Germinal soner, ventrikkel sonen, og subventricular sone i mus6. I den embryonale hjernen genererer nevrale stamceller neurons direkte eller indirekte gjennom mellomliggende stamceller (IPK), og i noen arter gjennom ytre subventricular sone forfedre (organisasjoner)7,8. Den spesifikke molekylær signatur, morfologi, plassering i stilk cellen nisje, og differensiering potensialet alle bestemme hvilken rolle hver under type i hjernen organogenesen og kliniske anvendelser9. De tilgjengelige celle overflate markørene kan imidlertid ikke utvetydig diskriminere og rense ulike under typer av NSPCs, som begrenser forståelsen og utnyttelsen av disse undertypene.

Identifikasjonen av primær NSPCs overflate markører er begrenset av tre store hekk. Den første er den begrensede celle antall NSPCs i vevet, noe som gjør det vanskelig å forberede celle overflate protein prøver for felles masse massespektrometri analyse. Den andre begrensningen er vanskeligheten med å produsere ren celle under typer for generering av under type spesifikke membran protein data. Til slutt, den tredje utfordringen er det lave forholdet mellom celle overflate proteiner i hele celle proteiner, som hemmer deres deteksjon følsomhet ved masse massespektrometri analyse.

For å overvinne disse problemene, utviklet vi en chemoproteomic tilnærming for selektivt å berike og identifisere celle overflate proteiner i primære NSPCs ved metabolically merking av sialoglycoproteins10. For å generere et tilstrekkelig antall NSPCs, tok vi fordel av en etablert protokoll for å utvide og vedlikeholde primære embryonale NSPCs i udifferensierte stater in vitro, av co-dyrking NSPCs med musen hjernen endothelial cellelinjer ved hjelp av en gjennomtrengelig støtte (f.eks. transwell) system11. I kontrast genererer NPSCs kultivert alene uten endothelial celler differensiert avkom11,12. Dermed kan protein prøver fra disse to kultur systemer være forholdsvis analysert for å identifisere proteiner som er differensielt uttrykt i NSPCs og differensiert neurons. Som de fleste celleoverflaten proteiner er modifisert av Sialic acid13, unaturlig Sialic syre forløper analog N-azidoacetylmannosamine-Tetraacylated (AC4ManNAz) ble brukt til å kapre den iboende metabolske veien slik at endogene, nylig syntetisert sialoglycans er merket med azido grupper, genererer et kjemisk håndtak14. Gjennom azido-alkyne-mediert bioorthogonal reaksjoner, som bøye biotin mot sialoglycans, kan celleoverflaten proteiner bli visualisere og beriket for Proteomikk identifisering gjennom en streptavidin-kombinert fluoroforen eller matrise14.

Her utfører vi farging av SDS-PAGE gel analyse av overflaten sialoglycoproteome fra NSPCs utvidet i en endothelial co-kultur og differensiering celler i et ikke-co-kultur system. Vi har også selektivt rense overflate sialoglycoproteome i de to kultur systemer for Proteomikk sammenligning. Vår protokoll, sammenlignet med den tradisjonelle sentrifugering celleoverflaten rensing protokoller15, øker utvinnings effekt ved å redusere overflate protein utvinning prosedyrer gjennom spesifikke tag bøyning og affinitet Rensing. I mellomtiden øker det utvinningen renheten av celleoverflaten proteiner basert på premisset om at sialylation skjer det meste på celleoverflaten proteiner. Selv om endothelial faktorer ikke kan helt blokkere differensiering av utvidet NSPCs, den komparative studien mellom en co-kultur og differensiert kultur gir en praktisk metode for å finne Stamcelle-beriket overflate proteiner uten behov for å analysere proteiner fra NPCer renset av FACS16. Vi mener at denne tilnærmingen kan anvendes på studier av overflate proteiner i andre systemer med passende modifikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyre protokollene som ble brukt i denne studien, ble godkjent av IACUC (institusjonell dyre pleie og bruks komité) for Tsinghua-universitetet og utført i samsvar med retningslinjene for IACUC. Laboratoriet dyret anlegget ved Tsinghua universitet har blitt akkreditert av AAALAC (Association for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care International). For staging av embryo, midt på dagen av vaginal pluggen identifisert ble beregnet som embryonale dagen 0,5 (E 0.5).

Merk: Alle celler er kultivert i celle inkubator under forhold på 37 ° c og 5% CO2.

1. utarbeidelse av Mouse endothelial kultur i gjennomtrengelig støtte inserts

Merk: BEND3 celler opprettholdes i henhold til produsentens instruksjoner.

  1. Klargjør BEND3 celle medium (BM) ved å legge til 50 mL FBS og 5 mL penicillin-Streptomycin i 500 mL DMEM og bland godt.
  2. Aspirer mediet fra fatet og vask BEND3 celler kultur med 1 mL PBS gang. Tilsett 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA inn i cellene og ruge cellene i 4 min ved 37 ° c.
  3. Tilsett 1 mL BM i cellene for å nøytralisere Trypsin-EDTA og pipette opp og ned forsiktig for å helt distansere cellene. Overfør celle fjæringen til en ny 15 mL konisk slange og pellet ved sentrifugering ved romtemperatur (RT) i 5 min ved 400 x g.
  4. Aspirer supernatanten fra røret og resuspend cellene med 9 mL fersk BM, legg deretter til 1 mL celle fjæring i én gjennomtrengelig støtte innsats. Tilsett ytterligere 2 mL fersk BM per brønn på bunnen kammer av matrisen. Fortsett å kultur cellene for en dag.

2. utarbeidelse av Mouse primær kortikale NSPCs kultur

  1. Utarbeidelse av kultur tallerken, Papain fordøyelsen medium, og kortikale tilhenger kultur medium (AM)
    1. Coat 6-brønn plater med Poly-L-lysin (PLL) ved å legge 1 mL av PLL løsning per brønn i 6-brønn plater. Deretter ruge platene på RT i 30 minutter.
    2. Overfør PLL-løsningen til et 15 mL konisk rør. Vask platene 3 ganger med dobbelt destillert vann. Airdry platene og sette dem til side til bruk.
    3. Klargjør Papain fordøyelsen ved å tilsette 50 U av Papain, 50 μL av L-glutamin og 50 μL av 100 mg/mL acetyl-L-cystein i 5 mL DMEM. Bland mediet kort og varm det til 37 ° c i 30 min for aktivering av enzymet.
    4. Klargjør kortikale celle tilhenger kultur medium (er): tilsett 500 μL av L-glutamin, 500 μL av natrium pyruvat, 500 μL av 100 mg/mL N-acetyl-L-cystein, 500 μL av N2, 1 mL B27 og 5 μL av 100 μg/mL bFGF i 50 mL DMEM. Bland mediet godt og varm det til 37 ° c før bruk.
  2. Utarbeidelse av primære cerebral kortikale celler og påfølgende plating
    1. Ofre en E 10.5 timet gravid mus ved cervical forvridning.
      Merk: Ved E 10.5, et flertall av cellene er voksende NSPCs i hjernebarken, noe som gir opphav til store kloner av avkom in vitro.
    2. Sterilisere magen med 75% etanol. Bruk fine saks og mikro-taggete tang for å åpne magen ved å kutte huden og underliggende muskelen langs høyre side av den midterste linjen. Fjern livmoren fra bukhulen forsiktig med taggete tang og skjær den ut fra bukhulen med fin saks.
    3. Vask livmoren med 40 mL pre-kjølt HBSS i 10 cm Petri parabolen. Deretter overfører livmoren til en ny 10 cm Petri parabolen og vask den igjen med 40 mL pre-kjølt HBSS.
    4. Overfør livmoren til en ny 10 cm Petri parabolen med 40 mL pre-kjølt HBSS. Fjern embryo fra livmoren og fostervann membran, og skjær hodene på embryo av fra stammene med Jewelers microforceps.
    5. Vask hodene med 40 mL pre-kjølt HBSS og overføre hodene til en ny 10 cm Petri parabolen med 40 mL pre-kjølt HBSS. Bruk Jewelers microforceps å skrelle bort hud og brusk som dekker hjernen, og deretter kutte cerebral Barken av og samle dem i en 15 mL konisk rør med pre-kjølt HBSS.
    6. Pellet Barken av sentrifugering i 3 min ved 4 ° c og 300 x g. Aspirer supernatanten fra røret, legg deretter til aktivert Papain fordøyelse medium og 15 μL av 4 mg/mL DNase jeg inn i vevet pellet.
    7. Resuspend vevs pellet kort av milde virvlingen. Ruge vevet ved 37 ° c i 30 min. I løpet av denne tiden, løsne vevet ved kort virvlingen hver 10 min.
      Merk: På slutten av fordøyelsen, bør det ikke være synlig vev brikker i røret.
    8. Pellet kortikale celler ved sentrifugering i 10 min ved 4 ° c og 450 x g. Aspirer supernatanten fra røret og vask cellen pellet med pre-kjølt DMEM. Gjenta dette trinnet én gang.
      Merk: Under fordøyelsen og vasking, ta forsiktighet for ikke å pipette vev og celle pellet omtrent for å unngå å skade cellene med en sterk skjærkraft.
    9. Aspirer supernatanten fra røret og legg deretter til 1,5 mL pre-kjølt HBSS inn i røret. Distansere kortikale celle pellet i enkeltceller med milde pipettering. Tell celle nummeret med en hemocytometer.
    10. Tilsett 2 mL AM og 2 x 104 kortikale celler per brønn i 6-brønn plater. Ruge platen ved 37 ° c og 5% CO2 for 3 h for å la cellene feste til platen.

3. oppsett av Neural-endothelial co-kultur og AC4ManNAz merking system

  1. En dag etter plating BEND3 celler i inserts, forsiktig aspirer mediet i bunnen kammeret først, deretter setter inn. Vask enface av innsatsene 3 ganger med pre-varmet DMEM. Vask den ytre overflaten av innsatsene ved skylling med forvarmet DMEM.
  2. Tilsett 1 mL pre-varmet AM i ett sett, deretter overføre innsettinger inn i brønnene med primær kortikale celler. Ruge co-kulturen ved 37 ° c og 5% CO2 for 12 h.
  3. Oppløse AC4MANNAZ i DMSO for å oppnå en lager konsentrasjon på 200 mm. 12 h etter å ha satt opp den nevrale-endothelial co-kultur, tilsett 1 μL av AC4ManNAz lager per bunn kammer og 0,5 μL av aksjer per sette inn i co-kulturen. Rist platene umiddelbart og forsiktig for å blande mediet godt. For kontroll celler, legge til like volum av DMSO.
  4. Kultur cellene for ytterligere 5 dager ved 37 ° c og 5% CO2. Klargjør AM med 10x bFGF som refeeding medium (RM). I løpet av denne tiden, tilsett 100 μL av RM per INSERT og 200 μL av RM per bunn kammer for å refeed endothelial og nevrale celler annenhver dag. Under refeeding, ikke forsyne AC4MANNAZ eller DMSO inn i kulturen.

4. Immunofluorescent farging av Sialoglycoproteins i utvidet primær NSPCs og differensiert neurons

  1. Forbered BTTAA-CuSO4 Complex 1 30x lager inneholdende 1,5 mm CuSO4 og 9 mm BTTAA i dobbelt destillert vann. Tilbered fersk biotin-bøyd buffer 1 som inneholder 50 μM biotin-alkyne, 2,5 mM natrium-ascorbate og 1x BTTAA-CuSO4 -kompleks i PBS.
  2. Fjern innsatsene fra co-kultur platene. Aspirer kulturen medium fra bunnen brønner og vaske nevrale celler en gang med pre-varmet PBS.
  3. Aspirer PBS fra brønnene. Tilsett 1 mL pre-kjølt 4% paraformaldehyde PBS løsning per brønn inn i cellene og fikse cellene ved RT i 10 min. Deretter vaskes cellene 3 ganger med pre-kjølt PBS.
  4. Aspirer PBS fra brønnene og tilsett 1 mL ferskt forberedt biotin-bøyd buffer 1 per brønn i cellene. Ruge cellene ved RT i 10 min.
  5. Aspirer reaksjons bufferen fra brønnene. Vask cellene 3 ganger med PBS. Klargjør farge bufferen som inneholder 1% FBS og 1 μg/mL Alexa fluor 647-streptavidin. Tilsett 1 mL farge buffer per brønn inn i cellene og ruge cellene ved RT i 30 minutter.
  6. Aspirer farge buffer fra brønnene og vasket celler 3 ganger med pre-kjølt PBS. Klargjør blokkerings bufferen som inneholder 5% BSA og 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel-100 i PBS. Tilsett 1 mL blokkerings buffer per brønn inn i cellene og ruge ved RT i 10 minutter.
  7. Klargjør en primær antistoff løsning ved å fortynne anti-nestin og anti-β-tubulin III-antistoffer sammen til blokkerings bufferen i størrelsesforholdet 1:20 og 1:1000, henholdsvis. Fjern blokkerings bufferen fra brønnene og tilsett 1 mL primær antistoff løsning per brønn i cellene. Ruge cellene ved 4 ° c over natten.
  8. Fjern den primære antistoff løsningen fra brønnene. Vask cellene 3 ganger med pre-kjølt PBS. Forbered en sekundær antistoff løsning ved å fortynne Alexa fluor 488 geit anti-mus IgG1, Alexa fluor 546 geit anti-mus IgG2b, og DAPI sammen til blokkering buffer ved en fortynning av 1:1000. Aspirer PBS fra brønnene og tilsett 1 mL sekundær antistoff løsning per brønn i celler. Ruge cellene ved RT for 2 t.
  9. Aspirer antistoff løsningen fra brønnene og vask cellene 3 ganger med pre-kjølt PBS. Etterpå er cellene klare for bildeopptak.

5. rensing av Sialoglycoproteins fra utvidet primær NSPCs og differensiert neurons

  1. Forbered BTTAA-CuSO4 kompleks 2 1,5-lager inneholdende mm CuSO4 og 3 mm BTTAA i dobbelt destillert vann. Forbered protein blanding buffer A inneholdende 4% SDS og 10 mM EDTA i dobbelt destillert vann; protein blanding buffer B inneholdende 150 mM NaCl, 50 mM trietanolamin og 1% polyoksyetylensorbitanmonooleat Oleyl Eter (f.eks. Brij97) i dobbelt destillert vann med pH 7,4. Før bruk, bland buffer A:buffer B = 1:8 (Vol/Vol) for å forberede full protein blanding buffer. Forbered protein vaskebuffer 1 inneholdende 2% SDS i PBS; protein vaskebuffer 2 inneholdende 8 M urea i 250 mM ammonium bikarbonat (ABC); og protein vaskebuffer 3 inneholder 2,5 M NaCl i PBS.
  2. Fjern innsatsene fra co-kultur platene. Aspirer kulturen medium fra bunnen brønner og vaske nevrale celler en gang med pre-kjølt PBS.
  3. Aspirer PBS fra brønnene og tilsett 200 μL av pre-kjølt RIPA buffer per brønn inn i platene. Ruge platene på isen i 5 min. samle proteinet lyse i 1,5 mL rør. Pellet cellen rusk av sentrifugering i 10 min ved 4 ° c og 12 000 x g.
  4. Overfør supernatanten til nye 1,5 mL rør. Bestem proteinkonsentrasjon med BCA-settet i henhold til produsentens instruksjoner. Juster protein konsentrasjonen til 1 mg/mL.
  5. Tilsett 100 μM alkyne-biotin, 2,5 mM natrium ascorbate og 1x BTTAA-CuSO4 kompleks 2 til 1 ml protein lyse og bland løsningen godt. Ruge blandingen på RT for 1 time.
  6. Overfør reaksjons løsningen til 20 mL pre-kjølt metanol i et 50 mL konisk rør. Bland godt og ruge ved-30 ° c over natten for å fremskynde proteinene.
  7. Pellet proteinet precipitates av sentrifugering i 15 min ved 4 ° c og 4 500 x g. Vask protein pellet to ganger med 20 mL pre-kjølt metanol. Aspirer supernatanten fra røret. Resuspend protein pellet med 4 mL protein blanding buffer og overføre proteinet blanding til en ny 15 mL konisk rør.
  8. Ta 50 μL av streptavidin perler og vask dem 3 ganger med PBS. Tilsett de vasket perlene i proteinet blanding. Ruge løsningen ved 4 ° c i 3 timer på en vertikal Rotator ved en rotasjonshastighet på 20 RPM.
  9. Vask perlene sekvensielt med 6 typer buffere: protein vaskebuffer 1, protein vaskebuffer 2, protein vaskebuffer 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC og 0,05 M ABC.
  10. Etter vask resuspend perlene med 20 μL av PBS og overfører perlene til et nytt 1,5 mL rør. Tilsett 20 μL av 2x protein lasting buffer i perlene og behandle ved 95 ° c i 10 min. Protein prøvene skal da utsettes for SDS-side og beiset med Coomassie strålende blå R-250 i henhold til produsentens anvisninger. Skjær proteiner i gel som indikert av Coomassie strålende blå R-250 for masse massespektrometri analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele prosedyren for in vitro ekspansjon og metabolsk merking av primære embryonale NSPCs tar 6 dager (figur 1a). Kvaliteten på BEND3 cellelinje og fersk isolert primære NSPCs er nøkkelen til et vellykket eksperiment. BEND3 celler er kilden til oppløselige faktorer som stimulerer selv fornyelse og spredning av NSPCs. Det bør sikres at BEND3 cellene er fri for forurensning og dividere aktivt med minimal celle død før co-dyrking med nevrale celler. Den primære NSPCs må være nøye forberedt for å unngå overflødig skade under dissosiasjon. Skadede NSPCs kan fortsatt vokse og differensiere; men de er ikke i stand til å svare på endothelial stimuli godt å opprettholde stemness og utvide. Det bør utvises ekstra forsiktighet for å være aseptisk under celle dyrking, da protokollen ikke foreslår tilsetning av antibiotika til det primære kultur mediet.

Vellykket endothelial co-kulturen vil føre NSPCs å danne store, Sheet-lignende kloner. Slike kjennetegnet klone figurer blir tydelig på dag 4 og er veldig typisk på dag 6. Innenfor kloner, cellene opprettholde nær kontakt med hverandre. Immunostaining med antistoffer mot NSPC markør Nestin og neuronal markør β-tubulin III skal avsløre at i klone, de fleste av cellene er Nestin+ NSPCs og svært få er β-tubulin III+ neuronal celler. I kontrast, prosentandelen av Nestin + celler og β-tubulin III+ neuronal celler i klone dannet i ikke-co-kultur systemet er nesten det samme (figur 1B, 1d, og 1e).

Den kjemiske reporter, AC4ManNAz, er en metabolsk analog og kan innlemmes i iboende protein sialylation veien. Høye doser av AC4ManNAz er giftig for cellene. For hver bestemt type celle, bør merkingen konsentrasjonen av AC4ManNAz være pre-testet for å oppnå den høyeste merking effektivitet uten betydelige cytotoksisitet. Her er den optimaliserte merkings konsentrasjonen av AC4ManNAz for primær NSPC 100 ΜM. Kombinatorisk evaluering av celle død indikert av mobilnettet og kjerner morfologi antyder denne merkingen konsentrasjonen ikke forårsaker åpenbare cytotoksisk effekter og er kunne effektivt merke NSPCs (figur 1C og 1d). Den klonal morfologi, selv fornyelse, og differensiering potensialet i NSPCs i både endothelial co-kultur og ikke-co-kultur systemet er ikke berørt (figur 1C, 1d, og 1e).

Den vellykkede merking av NSPCs av AC4ManNAz kan undersøkes etter bøye biotin til en kultur formidlet av en bioorthogonal reaksjon mellom Natriumazid og alkyne. Hver celle i AC4ManNAz-merket kulturen er beiset og visualisere med Alexa fluor 647-streptavidin. Ingen celle er positiv for Alexa fluor 647-streptavidin farging i DMSO kontrollgruppen. I tillegg, protein prøver utarbeidet fra AC4ManNAz-merket kultur ved biotin bøyning og streptavidin perler rensing viser sterke Coomassie strålende blå farging signal i SDS-Page gels. I mellomtiden var det bare flekker bakgrunn og uspesifisert bindende signaler i banene lastet med protein prøver fra DMSO kontrollgruppen. Dette indikerer også effektiv merking av NSPCs av AC4ManNAz (figur 1F).

Figure 1
Figur 1 : Identifisering av celle overflate markører for primær NSPCs assistert av endothelial co-kultur system og metabolsk sialoglycan merking. (A) skjematisk av arbeidsflyten for protokollen. Dette tallet har blitt modifisert fra Bai et al. 10. The BEND3 cellene er sådd i matrisen setter på D0. Utarbeidelse av primære kortikale NSPCs og satt opp av co-kultur systemet er utført på D1. Metabolsk merking av kultur varer fra D2 til D6. Kultur refeeding er gjennomført på D3 og D5. (B) den immunofluorescent bilder for kloner dannet av primære NSPCs etter 5-dagers kultur med eller uten endothelial celler. Scale linjen indikerer 20 μm. (C) Bright-feltet bilder for kloner dannet av primære NSPCs etter en 5-dagers kultur med AC4MANNAZ eller DMSO. Kjernene ble counterstained av DAPI. Skala linjen viser 20 μm. Feil linjen indikerer SEM (n.s. = ikke signifikant). (D) den immunofluorescent bilder for NSPC dannet kloner i endothelial co-kultur med AC4MANNAZ eller DMSO. Stiplet sirkel demarcates en enkelt nevrale klone. Skalaen linjen indikerer 50 μm. (E) kvantifisering av NSPCs og differensiert neurons i kloner dannet av NSPCs i endothelial co-kultur og ikke-co-kultur system med AC4ManNAz merking eller DMSO-kontroll. Feil linjen indikerer SEM (* * * p < 0,0005; n.s. = ikke signifikant). (F) Coomassie brilliant blå farging av proteiner renset ved streptavidin perler fra nevrale celler merket med AC4MANNAZ eller DMSO i endothelial co-kultur og nonco-kultur system. 55 kD-båndet i kontroll merkings grupper representerer ikke-spesifikke bindende proteiner. (B, C, E og F) som svarer til denne protokollen er tilpasset fra Bai et al. 10. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Overflate markører brukes ofte til å merke og rense spesifikke celletyper in vitro og in vivo17,18. Oppdagelsen av overflaten markører bidrar sterkt til regenererende medisin og stamcelleforskning ved å gi molekylær verktøy for å selektivt berike en stilk cellen befolkning fra normal eller patologisk vev og kultur retter, og tilbyr en renset celle ressurs for klinisk bruk eller studie av biologiske egenskaper. Men fremgang i å utvikle overflaten markører for nevrale stilk cellen forskning har vært treg på grunn av vanskeligheter med å isolere stamceller fra primære vev. Protokollen som beskrives her, er basert på en forenklet in vitro-plattform. Ved å sammenligne primære NSPCs utvidet med en endothelial co-kultur til en differensiering neural kultur, proteiner differensielt uttrykt i utvidet NSPCs er uthevet og gir mulighet for videre identifisering. Vår protokoll gir også en alternativ strategi for å rense celleoverflaten proteiner ved å kapre den iboende metabolske veien å merke sialoglycan med bioorthogonal grupper. Sammenlignet med tradisjonelle protokoller for rensing av celle overflate proteiner, er fordelene med denne protokollen understøttet av to spesifikke funksjoner: 1) utbredelsen av sialylation på celleoverflaten proteiner sikrer maksimal dekning av celleoverflaten proteom, og 2) reaksjonen spesifisitet mellom bioorthogonal gruppen og dens ligander tilskudd renhet av ervervet overflaten proteom. Dermed vår protokoll resulterer i en mer følsom Proteomikk analyse i tilfelle av mindre Start materialer. Vi har vist muligheten for denne protokollen i primær NSPCs overflate markører. Med de nødvendige modifikasjoner på å utvide stamceller in vitro, denne chemoproteomic tilnærmingen kan være forenlig med å identifisere overflaten markører for andre stilk cellen typer. Det er bemerkelsesverdig at som Ac4ManNAz er per-O-acetylert det kan føre til kunstige S-glykosylering. Bruk av unacetylated unaturlig sukker kan unngå gjenstand formasjon og forbedre spesifisitet og gyldigheten av metabolsk glycan merking i levende celler19.

Utarbeidelse av primære kortikale nevrale stamceller og endothelial celler er kritiske trinn i protokollen. Først, når fordøye embryonale kortikale vev, fordøyelsen tid, mengde enzym, og styrkehåndtering må være nøye kontrollert. Overdreven fordøyelse og mekaniske skjærkrefter vil skade integriteten til plasma membran og celleoverflaten reseptorer som megle signal Transduction for celle overlevelse og vekst, og de vil også forstyrre responsen av NSPCs til stimulering av endothelial celler og deres selv-fornyelse evne. For å oppnå riktig fordøyelse, må forskere aktivere Papain fullt og stoppe fordøyelsen så snart vev blokkene forsvinne. For det andre må BEND3 celler opprettholdes i en sunn tilstand for å støtte utskillelsen. Det anbefales å bruke BEND3 celle partier med færre passasjer og passasje cellene før de når 100% samløpet. Dette vil hindre celle syklus arrestasjon og senescence forårsaket av DNA skade akkumulert under passaging eller av overfylte kontakt mellom celler.

Høy gjennomstrømming sekvensering teknologi øker identifisering av celleoverflaten markører gjennom analysere RNA-uttrykk, spesielt for celletyper inkludert vev stamceller, som ofte er til stede i vivo i mengder for liten til å utføre proteom analyse av masse massespektrometri. Selv om RNA-SEQ analyse kan identifisere gener spesielt uttrykt i NSPCs, kan det ikke virkelig reflekterer protein uttrykk nivåer, fordi RNA-uttrykket er ikke alltid i samsvar med protein uttrykk20. I tillegg, ikke-protein biomolekyler som kan fungere som overflate markører er ikke i stand til å bli oppdaget av transcriptomic studier. For eksempel er Oligosaccharide Lewis X en velkjent overflate Maker mye brukt til å merke menneskelige embryonale stamceller og NSPCs, selv om det kan være forbundet med flere proteiner21. Derfor er direkte masse massespektrometri analyse ennå ikke variabelt, og utvikling av metoder som kan gjøre masse massespektrometri analyse mer gjennomførbart og praktisk er av stor interesse for fremtidige studier.

I tillegg til sialylation, andre typer post-translational protein modifikasjoner spiller en viktig rolle i å regulere funksjoner av modifiserte proteiner. Disse endringene påvirker protein egenskaper som konformasjon, halveringstid, og subcellulære lokalisering22,23. Flere protein modifikasjoner har celle type spesifisitet24,25,26. Med det voksende innholdet i den kjemiske verktøykassen, mer modifikasjon typer er mottagelig for metabolsk merking med kjemiske journalister27. Derfor kan den kjemiske tilnærmingen som beskrives her, brukes til å studere andre forskjeller i protein modifikasjon mellom stamceller og differensiert celler, som illustrerer de molekylære mekanismene bak vedlikehold av Stamcelle egenskaper og differensiering Regulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløring.

Acknowledgments

Figur 1B, 1C, 1e og 1F er gjengitt fra Bai et al . 10 andre med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Vi takker Yi Hao i X. C. ' s Lab for figur redigering. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation i Kina (nr. 91753206 til Q. S. og X. C., nr. 31371093 til Q. S. og NOS 21425204 og 21672013 til X. C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BEND3 ATCC CRL-229
DMEM Gibco 11960044
L-glutamine Gibco 25030081 1%
Sodium pyruvate Sigma P5280 1%
N2 supplement Gibco 17502048 1 to 100
N-acetyl-L-cysteine Sigma A7250 1 mM
Papain Worthington LS003726 10 U/mL
B27 supplement Gibco 17504044 1 to 50
Poly-L-lysine Sigma P4707
Basic Fibroblast growth factor Gibco PHG0261 10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 1%
Fetal bovine serum Gibco 10099141 10%
HBSS Gibco 14175095
Tripsin-EDTA, 0.25% Gibco 25200056
DPBS Gibco 14190094
Transwell Corning 3450
Paraformaldehyde Sigma 158127 4%
Sucrose Sangon A100335
DAPI Gibco 62248
RIPA buffer Thermo Scientific 89900
SDS-PAGE loading buffer 2x Solarbio P1018
6-well plate Corning 3335
Tris-Glycine protein gel invitrogen xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin Developmental Study Hybridoma Bank Rat-401 1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III Sigma T8860 1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 invitrogen A-21121 1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b invitrogen A-21143 1 to 1,000
Albumin Bovine V Amresco 0332
Triton X-100 Amresco 0694
BCA assay kit Thermo Scientific 23225
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Brij97 Aladdin B129088
CuSO4 Sigma 209198
Alkyne-biotin Click Chemistry Tools TA105
BTTAA Click Chemistry Tools 1236
Ac4ManNAz Click Chemistry Tools 1084 100 µM
9AzSia synthesized in lab
Sodium ascorbate Sigma A4034
Methanol Sigma 34860
EDTA Sangon A100322
NaCl Sangon A100241
SDS Sangon A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin invitrogen S21374 1 to 1,000
Triethanolamine Sigma V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  invitrogen 60210
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Scientific 20278
Isoflurane RWD Life Science Co. 970-00026-00
DNase I Sigma DN25 12 µg/mL
Urea Sigma U5378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  3. Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
  4. Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
  5. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
  6. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
  7. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  8. Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
  9. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  10. Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
  11. Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  12. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
  13. Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
  14. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  15. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  16. Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
  17. Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
  18. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
  19. Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
  20. Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
  21. Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
  22. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
  23. O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
  24. Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
  25. Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
  26. Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
  27. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).

Tags

Nevrovitenskap metabolsk glycan merking Sialic syrer bioorthogonal reaksjon nevrale stamceller stamceller overflate markører endothelial celler proteom kjemisk merking cerebral cortex
Identifisere Cell Surface markører for primær neural Stem og stamceller ved metabolsk merking av Sialoglycan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q.… More

Bai, Q. R., Dong, L., Shen, Q. Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan. J. Vis. Exp. (151), e58945, doi:10.3791/58945 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter