Summary
Ici, nous fournir une description détaillée d’un montage expérimental pour une analyse de l’évaluation de l’intégrité de l’ADN dans les cellules avant la transplantation de cellules souches.
Abstract
Tige et cellules cellules souches dérivées ont un potentiel immense comme une thérapie régénératrice pour diverses maladies dégénératives. L’ADN est l’entrepôt de données génétiques dans toutes les cellules, y compris les cellules souches, et son intégrité est fondamentale pour sa capacité régénératrice. Cellules souches subissent une propagation rapide dans les laboratoires pour obtenir les numéros nécessaires à la transplantation. La croissance cellulaire accélérée conduit à la perte d’intégrité de l’ADN par des métabolites accumulés, comme réactives de l’oxygène, carbonyle et des agents alkylants. La transplantation de ces cellules se traduirait par la mauvaise prise de greffe et régénération de l’orgue de détérioration. Repiquage en outre, les cellules endommagées par ADN conduit à des mutations, l’instabilité de l’ADN, la sénescence cellulaire et éventuellement mortelles maladies comme le cancer. Par conséquent, il y a un besoin immédiat d’une méthode de contrôle de la qualité évaluer les qualités de la cellule à la transplantation. Ici, nous fournissons des protocoles étape par étape pour l’évaluation de l’intégrité de l’ADN des cellules souches avant la transplantation de cellules.
Introduction
Les preuves expérimentales et cliniques montrent que les cellules hématopoïétiques peut améliorer modérément la performance contractile du ventricule gauche n’a pas de coeurs1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Les progrès récents ont ouvert davantage attrayant de possibilités pour la regénération cardiovasculaire ; citons l’expression forcée des facteurs de reprogrammation de cellules somatiques pour induire la pluripotence et différencier ces des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en différentes lignées cardiaques, ce qui est important cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. le matériel héréditaire dans chaque cellule, y compris le CISP artificiellement généré et dérivés iPSC CM (iPS-CM), est l’ADN. Les instructions génétiques stockées dans ADN dicte la croissance, le développement et la fonction des cellules, tissus, organes et organismes. L’ADN n’est pas inerte ; métabolites, comme réactives de l’oxygène carbonyle et azotés, de cellules et des agents alkylants ADN cause endommager in vitro et in vivo14,15,16,17. Ce qui est important, les dommages à l’ADN se produisent intuitivement dans chaque cellule, avec une fréquence significative. Si ces dommages ne sont pas corrigées, il conduira à la mutation de l’ADN, la sénescence cellulaire, la perte d’intégrité de l’ADN et de cellules et éventuellement, des maladies, y compris les cancers mortels. Conserver l’intégrité de l’ADN est donc essentielle pour n’importe quelle cellule, en particulier la CISP, qui a un potentiel énorme dans la clinique.
Pour évaluer la quantité et l’intégrité de l’ADN génomique isolé, un matériel onéreux est disponible sur le marché. Cependant, il n’y a aucune méthode simple et économique pour évaluer l’intégrité de l’ADN dans les cellules sans isoler les cellules. En outre, dégradation de l’ADN induite par l’utilisateur lors de l’isolation de l’ADN est l’un des inconvénients majeurs dans l’utilisation de ces méthodes. Les unicellulaires gel électrophorèse (connu comme le test des comètes)18,19 et γH2A.X immunomarquage8 techniques sont des approches fondamentales dans les laboratoires de recherche pour évaluer les dommages à l’ADN. Ces deux méthodes ne nécessitent pas de matériel coûteux ou ADN génomique isolé pour analyser l’ADN intégrité8,20,21. Depuis, ces techniques ont été réalisées avec des cellules entières ; dégradation de l’ADN/ARN/protéines induite par l’utilisateur lors de la préparation de l’échantillon n’affectera pas ces protocoles. Ici, pour évaluer les dommages à l’ADN et la réponse aux dommages de l’ADN dans les souches et les cellules de tige-cellule-dérivé, nous fournissons des protocoles étape par étape pour effectuer les deux la comète dosage et γH2A.X immunomarquage. En outre, combinant ces deux approches, nous vous proposons une évaluation naïve qui peut être utilisée pour évaluer les qualités de la cellule à la transplantation.
Le test des comètes ou unicellulaires électrophorèse sur gel, mesure les cassures de l’ADN dans les cellules. Incorporé dans l’agarose à bas point de fusion des cellules sont lysées à nucléoïdes formulaire contenant de l’ADN surenroulé. Lors de l’électrophorèse, petits morceaux de fragments d’ADN et des brins d’ADN cassés migre à travers les pores du gel d’agarose, alors que l’ADN intact, en raison de leur taille énorme et leur conjugaison avec la protéine de la matrice, aura une migration restreinte. Le modèle de l’ADN tachée sous un microscope à fluorescence imite une comète. La tête de la comète contient l’ADN intact et la queue est composée de fragments et cassée brins d’ADN. La fraction des dommages à l’ADN peut être mesurée par l’intensité de la fluorescence de l’ADN endommagé (queue de comète) par rapport à l’intensité de (tête de la comète) ADN intacte. Le moment de queue de paramètre peut être calculé comme indiqué à la Figure 1.
Dommages à l’ADN induit la phosphorylation de l’histone H2A. X (γH2A.X) sur le Ser139 par les kinases ATM, ATR et ADN-PK. La phosphorylation et le recrutement de H2A. X à ruptures de brins d’ADN est appelée réponse aux dommages de l’ADN (DDR) et arrive rapidement après que l’ADN est endommagé. Suite à ce processus, l’arrestation d’induite par le point de contrôle de cycle de cellules et l’ADN, processus de réparation sont initiées. Après l’achèvement de la réparation de l’ADN, γH2A.X est déphosphorylée et inactivé par les phosphatases. Prolongée et plusieurs brins d’ADN conduisent à l’accumulation de foyers γH2A.X dans l’ADN. Cela indique l’incapacité de la cellule pour réparer les lésions de l’ADN et la perte d’intégrité de l’ADN. Ces foyers γH2A.X dans l’ADN peuvent être identifiés par et le nombre de foyers DDR peut être compté en utilisant le protocole à l’article 2.
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Protocol
1. essai de comet
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Préparation du réactif
- D’agarose de la bas-fondre-point, lieu 500 mg de bas point de fusion d’agarose dans 100 mL d’ADN- / eau exempte de RNA. Faire chauffer la bouteille dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose se dissout. Placer la bouteille dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
Remarque : Pour en savoir plus, voir Azqueta et al., qui a étudié les effets de la concentration d’agarose sur le temps de déroulement d’ADN et plusieurs électrophorèse facteurs23. - Diluer le colorant SYBR green ADN dans un tampon Tris-EDTA (TE) à un ratio de 1/10 000 pour obtenir un 1 x solution de colorant stock de travail. Ce colorant est sensible à la lumière, donc stockez-la dans un endroit sombre.
- Pour le tampon de lyse cellulaire, dissoudre 100 mL de tampon de lyse (2,5 M NaCl, EDTA de 0,1 M, 10 mM Tris, 1 % Triton X-100) dans l’eau désionisée (DI H2O). Ensuite, ajoutez 10 M de NaOH pour ajuster le pH à 10.0. Cool le tampon à 4 ° C.
- Pour le tampon déroulement/électrophorèse d’ADN en cours d’exécution alcalin, dissoudre 1 L de solution alcaline (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) dans DI H2O. Cool le tampon à 4 ° C. S’assurer que le pH > 13.
- Pour les lames d’un préenduisage comète, versez quelques gouttes de 0,5 % d’agarose sur une lame de verre. Immédiatement, en utilisant la surface plane d’une autre diapositive, étaler sur l’agarose pour former une fine couche d’enduit de gel d’agarose.
Remarque : Sécher les lames avant d’utiliser. - Brièvement pour culture de cellules iPS, cellules iPS culture basement-membrane-matrice-enduit (voir Table des matières) culture plaques en milieu de culture de mTESR1 jusqu'à la confluence est atteint.
Remarque : Cardiaque-fibroblaste-anthropique CSPI ont été utilisés dans le présent protocole. La reprogrammation de la dérivation de cellules iPS et les conditions de culture est décrites dans les articles récents de notre groupe de recherche12,13,21.
- D’agarose de la bas-fondre-point, lieu 500 mg de bas point de fusion d’agarose dans 100 mL d’ADN- / eau exempte de RNA. Faire chauffer la bouteille dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose se dissout. Placer la bouteille dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
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Préparation des échantillons
- Jeter le milieu de culture et laver les cellules. Dissocier les cellules à l’aide de la solution de détachement (voir Table des matières). Laver le culot cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remettre en suspension les cellules dans du PBS 1 x 105 cellules/ml.
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Préparation des échantillons diapositive
Remarque : Effectuez les opérations suivantes dans des conditions de faible luminosité pour éviter les dommages cellulaires induites par la lumière ultraviolette.- Mix 10 μl de suspension cellulaire et 90 μL de solution d’agarose (01:10 ratio) dans un tube. Placer le tube dans un bain d’eau de 37 ° C pour empêcher l’agarose de solidification.
- Mélanger les solutions sans introduire des bulles d’air et pipeter 70 μL/spot sur le toboggan de la comète prêtes à l’emploi. À l’aide d’un embout de la pipette, étendre le mélange de gel d’agarose de cellules pour former une couche mince. Placez la lame à 4 ° C pendant 15 minutes.
- Dans un récipient, submerger complètement la lame dans le tampon de lyse froid. Placer le récipient dans l’obscurité à 4 ° C pendant 1 h.
- Remplacer le tampon de lyse par une solution alcaline froide. Assurez-vous que les lames sont complètement immergés. Placer le récipient dans l’obscurité à 4 ° C pendant 30 min.
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Électrophorèse
- Placer la diapositive dans une cuve d’électrophorèse horizontale. Remplissez le réservoir avec le tampon d’électrophorèse alcalin froid jusqu'à ce que les lames sont complètement immergés. Appliquer la tension de 1 V/cm pour 15 à 30 min.
Remarque : Total de tension = distance entre les électrodes x 1 V - Dans un récipient, submerger complètement la lame dans le froid DI H2O. Après 2 min, retirer le DI H2O et ajouter frais DI H2O. répéter cette étape.
- Remplacez le DI H2O froid éthanol à 70 %. Attendre 5 min. délicatement enlever la culasse, ne pas incliner et laissez-le sécher à l’air.
- Une fois sec, ajouter 100 μL de colorant dilué de l’ADN à chaque endroit. Attendre 15 min à température ambiante. À l’aide d’un filtre FITC dans un microscope à épifluorescence, prendre des photos de 50 à 100 comètes au total par échantillon.
- Placer la diapositive dans une cuve d’électrophorèse horizontale. Remplissez le réservoir avec le tampon d’électrophorèse alcalin froid jusqu'à ce que les lames sont complètement immergés. Appliquer la tension de 1 V/cm pour 15 à 30 min.
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Analyse d’images et de calcul des résultats
- Pour marquer les comètes, utiliser les instituts nationaux de la santé (NIH) ImageJ avec plugin test comète (télécharger ImageJ ici : https://imagej.nih.gov/ij/download.html; télécharger le plugin ici : https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
Remarque : Le plugin est fourni avec une instruction de PDF qui contient tous les détails pour effectuer l’analyse. En outre, captures d’écran de l’analyse de la comète sont indiquées dans la Figure 2 a-C. Images de la comète représentatif de contrôle et de la doxorubicine (Doxo)-CSPI traitée et la quantification des comètes sont indiquées dans la Figure 3 a-C.
- Pour marquer les comètes, utiliser les instituts nationaux de la santé (NIH) ImageJ avec plugin test comète (télécharger ImageJ ici : https://imagej.nih.gov/ij/download.html; télécharger le plugin ici : https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
2. réponse aux dommages de l’ADN
- Préparation d’échantillons et de réactifs
- Pour une culture de cellules iPS-CM, culture iPS-CM cellules basement-membrane-matrice-enduit (voir Table des matières) plaques de culture dans un milieu RPMI additionné de B-27 (CMM) jusqu'à la confluence est atteint.
Remarque : IPS-cellule-anthropique cardiomyocytes ont été utilisés dans le présent protocole. Le protocole pour la différenciation des cellules iPS dans les cardiomyocytes se trouvent dans les articles récents de notre groupe de recherche12,13,21. - IPS-CMs dans les diapositives de la chambre de graines.
- Jeter le milieu de culture des puits iPS-CM. Laver les cellules trois fois avec du PBS.
- Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 5 min. vérifier la plaque sous un microscope pour le détachement cellulaire. Ajouter 1 mL de CMM pour arrêter la trypsine.
- Placer suspension de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 4 ° C et 200 x g. Jeter le médium, ajouter 1 mL de CMM et remettre les cellules en suspension. Compter les cellules et d’ajuster le nombre de cellules pour obtenir 20 x 105 cellules en 1,6 mL de CMM.
- Graine de 200 µL de la suspension de cellules / puits de la chambre de 8 puits glisser (voir Table des matières). Cliquez sur la diapositive doucement pour répandre les cellules autour du puits et incuber à 37 ° C.
- Pour le traitement de doxorubicine iPS-CM, jeter le milieu de culture des puits iPS-CM. Laver les cellules avec du PBS. Traiter les cellules avec 1 doxorubicine μM et CMM pour 4 h. aspirer le milieu et laver les cellules avec du PBS.
- Pour le tampon de blocage, préparer 10 mL de solution d’albumine sérique bovine (BSA) contenant 3 % de BSA et 0,05 % X-100 Triton. Pour préparer 10 mL de tampon de blocage, ajouter 1 mL de sérum normal âne dans 9 mL de solution de BSA préparée.
- Pour la solution d’anticorps primaire, ajouter 1 μL de anti-lapin phospho-histone H2A. X (Ser139) anticorps à 200 μl de tampon de blocage.
- Pour le dosage des anticorps secondaire, ajouter 1 μL de fluorochrome-conjuguées anti-lapin anticorps secondaire, DAPI et phalloïdine fluorochrome-conjuguées à 200 μl de tampon de blocage.
- Pour une culture de cellules iPS-CM, culture iPS-CM cellules basement-membrane-matrice-enduit (voir Table des matières) plaques de culture dans un milieu RPMI additionné de B-27 (CMM) jusqu'à la confluence est atteint.
- Immunomarquage
- Laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter 200 μl de paraformaldéhyde fraîchement préparés à 4 % (PFA) dans chaque puits. Fixer les cellules pendant 20 min à l’obscurité à température ambiante. Laver les cellules avec du PBS.
- Supprimez le PBS et 200 μL de tampon de blocage par puits et bloc pendant 30 min dans une chambre humide à température ambiante. Retirer le tampon bloquant et ajouter 200 μl de solution d’anticorps primaire. Incuber pendant 45 min dans une chambre sombre et humide à température ambiante. Ensuite, laver les puits trois fois avec du PBS.
- Retirer le PBS et ajouter 200 μL du mélange de l’anticorps secondaire. Incuber pendant 45 min dans une chambre sombre et humide à température ambiante. Ensuite, laver les puits trois fois avec du PBS. Laver avec DI H2O avant de les monter avec antifade. Placez une lamelle et stocker les lames dans l’obscurité à 4 ° C.
- À l’aide d’un microscope à épifluorescence, prendre trois à cinq images de champs aléatoires par échantillon, comme indiqué dans la Figure 4 aet procéder à l’analyse de l’image.
- Comptage des foyers DDR
- Téléchargez et installez CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
- Remarque : Image processing dans cette étude a été réalisée à l’aide de CellProfiler version 2.1.1. Tutoriels pour CellProfiler qui ont été utilisés peut être trouvé ailleurs (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & list = PL7CC87670239B4D10). Si une nouvelle version de CellProfiler est utilisée, le pipeline peut nécessiter des adaptations mineures.
- Télécharger le pipeline punctae_gH2AX.cpipe. Sélectionnez fichier > importer > Pipeline à partir du fichier et choisissez punctae_gH2AX.cpipe.
- Glisser-déplacer le dossier contenant les images acquises des foyers γH2A.X à la fenêtre de liste de fichiers dans la section Input modules/Images pour analyse (Figure 5 a). Puis, suivez les instructions comme indiqué dans la Figure 5 a-L.
- Définissez les paramètres suivants pour les images :
- Glisser l’image souhaitée pour l’analyse dans la liste de fichiers. Sous modules de saisie, sélectionnez Images (voir Figure 5 a pour les paramètres de module). Dans les modules d’entrée, sélectionnez les métadonnées (voir Figure 5 b pour les paramètres de module). Dans les modules d’entrée, sélectionnez NamesAndTypes (voir Figure 5 paramètres de module).
- Pour les groupes, sélectionnez aucun. Dans les modules d’analyse, sélectionnez ColorToGray (voir Figure 5 paramètres de module).
- Dans les modules d’analyse, sélectionnez lisse (voir Figure 5E pour les paramètres de module).
Remarque : Cette valeur peut doivent être optimisées, selon la résolution de l’image. - Dans les modules d’analyse, sélectionnez IdentifyPrimaryObjects (voir Figure 5F pour les paramètres de module).
Remarque : Optimiser ces valeurs pour s’assurer que le noyau entier est sélectionné. Après cette étape, l’ordinateur peut rester. - Dans les modules d’analyse, sélectionnez lisse (voir Figure 5 paramètres de module).
Remarque : Cette valeur peut doivent être optimisées, selon la résolution de l’image. - Dans les modules d’analyse, sélectionnez EnhanceOrSuppressFeatures (voir la Figure 5 H pour les paramètres de module).
- Dans les modules d’analyse, sélectionnez IdentifyPrimaryObjects (voir Figure 5I pour les paramètres de module).
Remarque : Optimiser ces valeurs pour s’assurer que le punctae sont sélectionnés. Après cette étape, l’ordinateur peut rester encore une fois.- Dans les modules d’analyse, sélectionnez RelateObjects (voir Figure 5J pour les paramètres de module). Dans les modules d’analyse, sélectionnez ClassifyObjects (voir la Figure 5 K pour les paramètres de module). Dans les modules d’analyse, sélectionnez ExportToSpreadsheet (voir la Figure 5 L pour les paramètres de module).
- Cliquez sur Analyser les Images dans le panneau de gauche de fond à effectuer une analyse de l’image. À la fin de l’analyse, plusieurs images sont générés (Figure 6 a-F).
Remarque : Les utilisateurs doivent enregistrer ces images pour un usage ultérieur. - Noter le fichier .csv contenant les données quantitatives pour l’analyse approfondie qui est générée et enregistrée à l’emplacement approprié sur l’ordinateur. Dans la feuille de calcul appelée MyExpt_Image, les colonnes B et D auront le nombre de noyaux qui ont jusqu'à cinq et plus punctae, respectivement. Ajouter des colonnes B et D pour obtenir le nombre total de noyaux.
- Répétez l’étape 2.3.3 - 2.3.8 pour toutes les images (changer le nom du fichier MyExpt_ avant chaque analyse). Emplacements sont possibles pour évaluer l’intégrité de l’ADN, comme le montre la Figure 4.
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Representative Results
Cellules souches humaines pluripotentes induites ont été cultivés, et les dommages à l’ADN et le moment de la queue, qui ont été utilisés comme mesure d’intégrité de l’ADN, ont été analysées par le test des comètes. CSPI ont été intégrés dans l’agarose de la bas-fondre-point et placé sur une lame de verre. Les cellules ont, ensuite, traitées avec tampon de lyse, suivie par une solution alcaline, à obtenir l’ADN surenroulé. Nucléoïdes étaient grande et comètes ont été visualisées par le colorant de l’ADN (Figure 1 a-D). Les comètes étaient, alors, analysés avec ImageJ, en utilisant le plugin de test comète (Figure 2 a-C).
Les cellules iPS humaines ont été traités avec Doxo d’induire des dommages à l’ADN et à être utilisé comme témoin positif. Micrographies représentatifs des comètes de cellules iPS Doxo-traités et non traités sont présentés dans la Figure 3 a. Une basale quantité de dommages à l’ADN a été trouvée dans les cellules iPS, exprimées comme une fraction de moment dommages et queue d’ADN. Cependant, le Doxo traitement augmente les dommages à l’ADN dans les cellules iPS comme prévu (Figure 3 bC). Cela montre que le test des comètes peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de l’ADN non seulement dans les cellules somatiques18,19 , mais aussi de cellules souches pluripotentes21.
Fraîchement dissociés iPS cardiomyocytes (iPS-CMs), iPS-CMs cultivées pour 6 mois (culture prolongée [PC]) et iPS-CMs traités par Doxo ont été soumis à γH2A.X immunomarquage. Micrographies représentatifs d’immunomarquage γH2A.X figurent dans la Figure 4 a (faible grossissement) et Figure 4 b (grossissement). Le nombre des foyers γH2A.X (foyers DDR) (punctae) dans chacun des noyaux sont quantifiées, à l’aide de CellProfiler avec les modules de pipeline personnalisé (Figure 5 a-L). Le pourcentage de cellules qui sont positifs pour γH2A.X sont classées en noyaux avec zéro à cinq punctae et de noyaux avec plus de 10 punctae. Dans le contrôle iPS-CM, plus de 90 % des cellules avaient moins de cinq foyers DDR par noyaux, et un total de moins de 10 % des cellules avait plus de six foyers DDR par noyaux (Figure 4, control [Ctrl]). iPS-CMs cultivés pendant 6 mois avaient moins de 90 % des cellules avec moins de cinq foyers DDR par noyaux et un total de plus de 13 % des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux (Figure 4, PC), tandis que l’iPS-CM Doxo-traités ont montré moins de 80 % des cellules avec les s que cinq foyers DDR par noyaux et un total d’environ 24 % des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux (Figure 4, Doxo). Ces données montrent clairement que la culture cellulaire prolongé et traitement Doxo importants dommages à leur ADN iPS-CMs et ne conviennent pas pour la transplantation de cellules.
Figure 1 : schéma de l’essai de comet. Mix la suspension cellulaire avec l’agarose de la bas-fondre-point de la (A) et (B) déposer sur une lame de verre. (C) traiter avec tampon de lyse cellulaire, suivie d’une solution alcaline, d’obtenir des nucléoïdes contenant de l’ADN surenroulé. (D) électrophorèse et tacher l’ADN à l’aide de colorant SYBR green ADN. (E) schéma d’intact (gauche) et l’ADN endommagé (droit, forme de comète). (F) la formule pour calculer une fraction du moment l’ADN des dommages et la queue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : quantification de moment des dommages et la queue de l’ADN par ImageJ. (A-C) Screenshots de ImageJ, avec le plugin d’analyse comète présentant une sélection de la tête de la comète et la queue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : doxorubicine induit des lésions de l’ADN dans les cellules iPS humaines. (A) l’ADN des dommages dans les traités à la doxorubicine (Doxo) et les cellules iPS non traités (contrôle), analysés par le test des comètes. (B) Fraction des dommages à l’ADN (n = 3) et (C) queue moment (n = 63 comètes) quantifiées à l’aide du test des comètes. Le traitement avec la doxorubicine, un agent intercalant de l’ADN, a significativement augmenté la fraction de moment dommages et queue d’ADN dans les cellules iPS. Les données sont des moyens ± SEM. *P < 0,05, étudiant de non appariés t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : réponse aux dommages de l’ADN dans les cardiomyocytes dérivés iPS. Marqueur de réponse (A) ADN dommages γH2A.X identifié par immunofluorescence dans les traités à la doxorubicine (Doxo) et non traités (contrôle) iPS-cardiomyocytes ainsi que prolonge la culture iPS-cardiomyocytes (PC). (B) un grossissement supérieur de γH2A.X (punctae vert) étiquetage sur les sites des lésions de l’ADN dans iPS-foyers CMs. (C) Quantification de DDR, analysés par CellProfiler avec modules de pipeline personnalisé. Les données sont moyen ± SD ; n = 3 à 4. P < 0,05, étudiant de non appariés t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : automatisée d’analyse de réponse dommage ADN de CellProfiler. (A-L) Captures d’écran de CellProfiler avec les paramètres spécifiés pour importer les images et l’identification automatisée et la quantification des γH2A.X punctae dans iPS-CMs. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : automatisée d’analyse de réponse dommage ADN de CellProfiler. (A-F) Images de données générées par CellProfiler à la fin de l’analyse d’image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Intégrité de l’ADN dépeint l’intégrité cellulaire. Cellules avec ADN endommagé sont souvent stress et finissent par perdent leur intégrité. L’intégrité des souches et de cellules de tige-cellule-dérivé étant propagés aux fins de transplantation est principale pour les cellules de remplir leur fonction désirée. La transplantation de cellules avec de l’ADN endommagé se traduirait par un taux de mauvaise prise de greffe et de la performance de la cellule8,20. Par conséquent, examiner l’intégrité de l’ADN avant la transplantation de cellules est un protocole de contrôle de la qualité nécessaire. Nous décrivons ici deux approches rentables, à savoir la comète dosage et γH2A.X immunofluorescence d’étiquetage, afin d’évaluer les dommages à l’ADN et la qualité des souches et de cellules de tige-cellule-dérivé.
Des principales causes du vieillissement cellulaire sont censé être l’accumulation de dommages à l’ADN dans les cellules. Le test des comètes, Al-Baker et al. analyser les lésions de l’ADN dans des fibroblastes dermiques humains jeunes et sénescent22. Auparavant, nous avons montré que cardiaque transplantation de sans dommage l’ADN des cellules souches isolées de souris transgéniques p53 augmente le taux de prise de greffe dans l’hôte orgue8. Récemment, nous avons montré le rôle de la domaine de transactivation de p53 dans des mécanismes de réparation des dommages de l’ADN de cellules iPS humaines21. Dans les deux études, nous avons employé tous les deux l’immunofluorescence assay et γH2A.X de comète étiquetage des méthodologies pour évaluer les dommages de l’ADN dans les cellules souches. Ces deux méthodes sont rentables et peuvent être effectuées avec le matériel de laboratoire de base. Un problème gênant et critique que nous avions vécu souvent est d’agarose solidifier dans la pipette et les tubes. Cette question nous avons surmonté de chauffement tous les tubes et les conseils avant d’agarose pipetage. Alors que le test des comètes dure jusqu'à 2 jours, la procédure de marquage d’immunofluorescence γH2A.X optimisée peut être complétée en moins de 4 h.
Les cultures de cellules iPS humaines avec plus de 10 % dommages à l’ADN, mesuré par le test des comètes, ne pas efficacement se différencient en cardiomyocytes (données non présentées) in vitro. Le test des comètes est sensible et dynamique dans l’évaluation des dommages à l’ADN dans les cellules souches. Cependant, quotes-parts de l’intégrité de l’ADN dans certaines cellules, comme les cardiomyocytes dérivés iPS, sont lourdes de test des comètes en raison de la nature des cellules. Les cardiomyocytes sont enrichies avec la troponine, protéines du sarcomère et les protéines de la matrice extracellulaire sécrétée. La dénaturation de ces structures complexes de faire supercoiled ADN et sa reproductibilité sont discutables. Plus important encore, 25 % à 40 % des cardiomyocytes humaines sont binucléées25, et ces pourcentages varient dans les cardiomyocytes dérivés iPS. La paroi cellulaire est perturbée dans le test des comètes, l’évaluation précise du pourcentage des cellules endommagées de l’ADN est impossible. Par conséquent, dans le cas des iPS-CMs, la procédure de marquage d’immunofluorescence γH2A.X pour évaluer les dommages à l’ADN est une alternative simpliste pour le test des comètes.
Basé sur ces résultats et ceux des précédentes publications de notre groupe8,20,21, nous suggérons que, s’il n’y a plus de 10 % dommages à l’ADN, évalué par le test des comètes, ou moins de 90 % des cellules ont zéro à cinq DDR foyers, puis la culture doit être disqualifiés pour la transplantation de cellules.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par le National Heart, Lung, and Blood Institute subventions RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 et UO1-HL-134764 (à J. Zhang) et par l’American Heart Association scientifique Development Grant 17SDG33670677 (de Gigi R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
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