Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58971
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של התקנה ניסיונית עבור ניתוח של ההערכה של שלמות ה-DNA בתאי גזע לפני השתלת תא.

Abstract

גזע ותאי גזע-תא-derived יש פוטנציאל עצום כטיפול משובי למחלות ניווניות שונות. DNA למחסן של נתונים גנטיים בתאים כל, לרבות תאי גזע, והיא ושלמותה הוא היסוד הרגנרציה שלו. תאי גזע עוברים התפשטות מהירה במעבדות כדי להשיג את המספרים הדרושים עבור השתלת. גדילת התאים מואצת מוביל אובדן שלמות הדנ א על ידי מטבוליטים שהצטברו, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל קטלניים. משתילים תאים אלה היו מסתיימים engraftment המסכן והתחדשות של האיבר המידרדר. יתר על כן, משתילים הפניות תאים פגומים-DNA מוטציות, יציבות של ה-DNA, הזדקנות ביולוגית הסלולר, כנראה, סכנת מחלות כמו סרטן. לכן, יש צורך מיידי שיטה בקרת איכות להעריך את התאמתם של התא השתלת. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד ההערכה של שלמות הדנ א של תאי גזע לפני השתלת תא.

Introduction

הוכחה ניסויית וקלינית מדגים כי השתלת תא בינוני עשוי לשפר את ביצועי כויץ של החדר השמאלי של כשל לבבות1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. ההתקדמות האחרונה נפתחו עוד יותר מושך הזדמנויות עבור התחדשות לב וכלי דם; אלה כוללים את הביטוי כפויה של גורמים התיכנות בתאים סומטיים כדי לגרום pluripotency, להבדיל אלה בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) לתוך הלב שושלות שונות, חשוב cardiomyocyte (ס מ)10, 11 , 12 , 13. החומר התורשתי בכל תא, כולל iPSCs שנוצר באופן מלאכותי, נגזר iPSC ס"מ (iPS-ס"מ), הוא ה-DNA. ההוראות הגנטי האצור ב- DNA מכתיב את הצמיחה, ופיתוח פונקציה של תאים, רקמות, איברים אורגניזמים. הדנ א אינה אינרטי; תא מטבוליטים, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל חנקן מינים, ונזק קטלניים יכול לגרום DNA במבחנה, ויוו14,15,16,17. חשוב לציין, נזק לדנ א מתרחשת באופן אינטואיטיבי בכל תא, עם תדירות משמעותית. אם נזקים אלה לא מתוקנות, זה יוביל מוטציית דנ א, הזדקנות ביולוגית הסלולר, האובדן של ה-DNA של תאים שלמות, ואולי, מחלות, כולל סרטן סכנת חיים. לכן, שמירה על שלמות הדנ א הוא חיוני תא כלשהו, במיוחד iPSCs, בעל פוטנציאל עצום במרפאה.

להערכת את הכמות ואת היושרה של דנ א גנומי מבודד, ציוד יקר זמין על השוק. עם זאת, קיימות שיטות לא פשוטים וחסכוניים כדי להעריך את תקינות ה-DNA בתאים ללא בידוד התאים. יתר על כן, המשתמש-induced השפלה DNA במהלך בידוד ה-DNA הוא אחד החסרונות הגדולים בעוד בשיטות אלה. תא בודד ג'ל אלקטרופורזה (המכונה שביט assay)18,19 , γH2A.X immunolabeling8 הטכניקות הן גישות יסוד במעבדות מחקר להערכת נזק לדנ א. שתי שיטות אלו אינם דורשים ציוד יקר או מבודד הדנ א כדי לנתח DNA שלמות8,20,21. . מאז, טכניקות אלה בוצעו עם תאים שלמים; משתמש-induced השפלה DNA/RNA/חלבון במהלך הכנת המדגם לא ישפיעו על פרוטוקולים אלה. . כאן, כדי להעריך נזק לדנ א של DNA נזק תגובת גזע ותאי גזע-תא-נגזר, אנו מספקים פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי לבצע שני את כוכב השביט assay, γH2A.X immunolabeling. יתר על כן, שילוב שתי הגישות האלה, אנו מציעים הערכה תמים יכול לשמש כדי להעריך את התאמתם של התא השתלת.

כוכב השביט assay, או תא בודד ג'ל אלקטרופורזה, מודד את מעברי DNA בתאים. תאים בתוך התכה נמוכה agarose הם lysed כדי nucleoids טופס המכיל supercoiled DNA. על אלקטרופורזה, חתיכות קטנות של DNA מפוצלים ו גדילי DNA שבור נודדים דרך הנקבוביות agarose, ואילו ה-DNA ללא פגע, בשל גודלם העצום שלהם ההטיה עם החלבון מטריקס, תהיה העברה מוגבלת. תבנית ה-DNA מוכתם תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחקה כוכב שביט. בראש שביט מכיל דנ א ללא פגע, הזנב הוא מורכב שברים ושבר גדילי ה-DNA. השבר של נזק לדנ א נמדד על ידי קרינה פלואורסצנטית האינטנסיביות של הדנ א פגום (זנב השביט) יחסית העוצמה (ראש שביט) ה-DNA ללא פגע. לרגע הפרמטר הזנב ניתן לחשב כמוצג באיור1.

נזק לדנ א גורם זירחון של היסטון H2A. X (γH2A.X) בשעה Ser139 על-ידי kinases כספומט, ATR ו- DNA-PK. זרחון והגיוס של H2A. X-מעברי גדיל DNA נקרא DNA נזק התגובה (DDR) והוא קורה במהירות לאחר הדנ א פגום. בעקבות תהליך זה, בתיווך מחסום מחזור התא מעצר DNA מבוצעים תהליכים לתיקון. לאחר סיום מוצלח של תיקון ה-DNA, γH2A.X dephosphorylated, מומת על ידי phosphatases. ממושך, מספר מעברי גדיל DNA לגרום להצטברות של γH2A.X מוקדים ב- DNA. הדבר מעיד על חוסר היכולת של התא כדי לתקן את הנזק DNA ואובדן של שלמות הדנ א. מוקדים אלה γH2A.X בדנ א יכול להיות מזוהה על ידי, מספר מוקדים DDR ניתן לספור באמצעות הפרוטוקול בסעיף 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שביט Assay

  1. ריאגנט הכנה
    1. עבור נקודת ההיתוך הנמוכה agarose, מקום 500 מ"ג agarose התכה נמוכה ב- 100 מ של ה-DNA- / RNA ללא מים. מחממים את הבקבוק בתנור מיקרוגל עד agarose מתמוסס. הניחו את הבקבוק בתוך אמבט מים 37 ° C עד שהוא נדרש.
      הערה: לקריאה נוספת ראה Azqueta et al., שלמד את ההשפעות של ריכוז agarose על הזמן רגיעה-DNA ו אלקטרופורזה מספר גורמים23.
    2. לדלל לצבוע דנ א SYBR ירוק במאגר טריס-EDTA (TE) ביחס 1:10,000 כדי לקבל 1 x עובד פתרון מלאי צבע. זה דיי רגישים לאור, אז לאחסן אותו במקום חשוך.
    3. עבור מאגר פירוק תא, התמוססות 100 מ של פירוק מאגר (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 מ מ טריס, 1% טריטון X-100) במים יונים (DI H2O). לאחר מכן, להוסיף 10 NaOH M כדי להתאים את ה-pH עד 10.0. מגניב המאגר כדי 4 ° C.
    4. עבור מאגר אלקליין פועל הדנ א-רגיעה/אלקטרופורזה, להמיס 1 ליטר של פתרון אלקליין (0.3 M NaOH, 1 מ"מ EDTA) DI H2O. מגניב המאגר כדי 4 ° C. ודא כי ה-pH > 13.
    5. עבור שקופיות precoated שביט, מניחים כמה טיפות agarose 0.5% על זכוכית. באופן מיידי, באמצעות משטח שטוח של שקופית אחרת, להפיץ את agarose כדי ליצור שכבה דקה של ציפוי agarose.
      הערה: יבש את השקופיות לפני השימוש.
    6. עבור כתובות ה-Ip תרבית תאים, בקצרה תאי iPS תרבות המרתף-ממברנה-מטריקס-מצופה (ראה טבלה של חומרים) תרבות צלחות mTESR1 תרבות בינוני עד confluency.
      הערה: תאי iPS האדם-הלב-פיברובלסט-נגזר שימשו פרוטוקול זה. התכנות iPS תא נגזרת ותנאי תרבות מתואר במאמרים אחרונים שלנו מחקר קבוצה12,13,21.
  2. הכנת הדוגמא
    1. ביטול המדיום תרבות ולשטוף את התאים. מביצועם התאים באמצעות ניתוק פתרון (ראה טבלה של חומרים). רוחצים בגדר תא בתמיסת באגירה פוספט (PBS) את resuspend את התאים ב- PBS בעונה 1 פרק 105 תאים/מ ל....
  3. הכנת הדוגמא שקופיות
    הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים תאורה כדי למנוע נזק לתאים על-סגול-אור-induced.
    1. מיקס 10 μL של הבולם תא, μL 90 agarose פתרון (1:10 יחס) בצינור. מניחים את הצינורית בתוך אמבט מים 37 ° C כדי למנוע את agarose שהשרף מתהווה.
    2. לערבב את הפתרונות ללא היכרות עם בועות אוויר, פיפטה 70 μL במקום על גבי השקופית שביט precoated. באמצעות טיפ פיפטה, ומשטחים את התערובת agarose תא כדי ליצור שכבה דקה. מקם את השקופית 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    3. במיכל, לגמרי להטביע את השקופית במאגר פירוק קר. הכנס את המיכל בחושך ב 4 ° C עבור 1 h.
    4. החלף את המאגר פירוק פתרון אלקליין קר. ודא שהשקופיות לחלוטין טובע. הכנס את המיכל בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. אלקטרופורזה
    1. מקם את השקופית במיכל אלקטרופורזה אופקית. למלא את המיכל מאגר אלקטרופורזה אלקליין קר עד השקופיות לחלוטין טובע. החל מתח ב 1 V ס למשך 15 עד 30 דקות.
      הערה: סה כ מתח = המרחק בין האלקטרודות x 1 V
    2. במיכל, לגמרי להטביע את השקופית קר DI H2O. לאחר 2 דקות, להסיר את DI H2O ולהוסיף טריים DI H2O. חזור על שלב זה.
    3. החלף את DI H2O אתנול 70% קר. המתן 5 דק בעדינות להסיר את השקופית, לא להטות את זה, ולתת לזה מילה נהדרת...
    4. ברגע מיובש, להוסיף 100 μL של צבע מדולל DNA בכל מקום. לחכות 15 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מסנן FITC במיקרוסקופ epifluorescence, לקחת תמונות של 50 עד 100 שביטים סה עבור דגימה.
  5. ניתוח תמונות וחישוב של תוצאות
    1. עבור ניקוד השביטים, השתמש מכוני הבריאות הלאומיים של (NIH) ImageJ עם תוסף assay שביט (להוריד ImageJ כאן: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; להוריד את התוסף כאן: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      הערה: התוסף מגיע עם הוראה PDF אשר מכיל את כל הפרטים כדי לבצע את הניתוח. בנוסף, מוצגים צילומי מסך של ניתוח שביט איור 2A-C. שביט נציג תמונות של שליטה דוקסורוביצין (Doxo)-תאי iPS שטופלו כימות של השביטים מוצגים באיור 3 א -ג'.

2. DNA נזק תגובה

  1. לדוגמה, ריאגנט הכנה
    1. על תרבות תאי iPS-ס"מ, תרבות שב ס ס מ תאים בתוך מרתף-ממברנה-מטריקס-מצופה (ראה טבלה של חומרים) תרבות צלחות בינוני RPMI בתוספת B-27 (CMM) עד confluency.
      הערה: האדם-iPS-תא-נגזר cardiomyocytes שימשו פרוטוקול זה. הפרוטוקול עבור שב"ס תאית התמיינות לתוך cardiomyocytes ניתן למצוא במאמרים האחרונים שלנו מחקר קבוצה12,13,21.
    2. זרע iPS-CMs בשקופיות קאמרית.
      1. למחוק את המדיום תרבות מן הבארות iPS-ס"מ. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
      2. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין לכל טוב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק סימון הלוח תחת מיקרוסקופ על ניתוק התא. להוסיף 1 מ"ל של CMM לעצור את טריפסין.
      3. למקם את תא השעיה שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 4 ° C ו- x 200 גרם. למחוק את המדיום, להוסיף 1 מ"ל של CMM, resuspend את התאים. לספור את התאים ולהתאים את ספירת התאים כדי להשיג 20 x 105 תאים מ 1.6 ל CMM.
      4. זרעי µL 200 של השעיה תא לכל טוב של תא 8-ובכן שקופית (ראה טבלה של חומרים). הקש על השקופית בעדינות כדי להפיץ את התאים סביב הבאר, דגירה ב 37 º C.
    3. לטיפול דוקסורוביצין iPS-ס"מ, למחוק את המדיום תרבות מן הבארות iPS-ס"מ. לשטוף את התאים עם PBS. לטיפול תאי עם דוקסורוביצין μM 1, CMM עבור 4 h תשאף המדיום ולשטוף את התאים עם PBS.
    4. עבור מאגר חסימה, להכין 10 מ"ל של אלבומין שור (BSA) לאודנום BSA 3% ל- 0.05% טריטון X-100. כדי להכין 10 מ"ל של מאגר חסימה, להוסיף 1 מ"ל של החמור נורמלית בסרום 9 מ של פתרון BSA מוכן.
    5. הפתרון נוגדן ראשוני, הוסיפו 1 μL של אנטי-הארנב פוספו-היסטון H2A. X (Ser139) נוגדן ל 200 μL מאגר חסימה.
    6. עבור מיקס נוגדנים משניים, להוסיף 1 μL כל אחד של ארנב אנטי fluorochrome מצומדת משני נוגדן, דאפי phalloidin מצומדת fluorochrome μL 200 מאגר חסימה.
  2. Immunolabeling
    1. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 200 μL של 4% טריות paraformaldehyde (PFA) כל טוב. לתקן את התאים עבור 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם PBS.
    2. להסיר את PBS ולהוסיף 200 μL מאגר חסימה לכל טוב, בלוק למשך 30 דקות בחדר humidified בטמפרטורת החדר. להסיר את המאגר חסימה ולהוסיף 200 μL של נוגדן ראשוני פתרון. תקופת דגירה של 45 דקות בחדר חשוך, humidified בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף הבארות שלוש פעמים עם PBS.
    3. להסיר את PBS ולהוסיף 200 μL של נוגדנים משניים מיקס. תקופת דגירה של 45 דקות בחדר חשוך, humidified בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף הבארות שלוש פעמים עם PBS. לשטוף עם DI H2O לפני הרכבה אותם עם antifade. מקום coverglass ולאחסן את השקופיות בחושך ב 4 º C.
    4. שימוש במיקרוסקופ epifluorescence, לקחת חמש תמונות של שדות אקראי לכל לדוגמה, כפי שמוצג באיור 4A, והמשך ניתוח תמונות.
  3. ספירת מוקדים DDR
    1. הורד והתקן CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
    2. הערה: עיבוד במחקר זה תמונה בוצעה באמצעות CellProfiler גירסה 2.1.1. הדרכות CellProfiler ששימשו ניתן למצוא במקום אחר (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & רשימת = PL7CC87670239B4D10). אם גירסה חדשה יותר של CellProfiler נמצא בשימוש, הצינור עשוי לדרוש עיבודים קלים.
    3. הורד את צינור punctae_gH2AX.cpipe. בחר קובץ > ייבוא > צינור מקובץ ובחר punctae_gH2AX.cpipe.
    4. גרור-ושחרר התיקייה המכילה את תמונות נרכשות של מוקדים γH2A.X אל חלון רשימת קבצים במדור מודולי קלט/תמונות לניתוח (איור 5A). לאחר מכן, בצע את ההוראות כפי שמוצג באיור 5A-L.
    5. להגדיר את הפרמטרים הבאים לתמונות:
      1. גרור את התמונה הרצויה עבור ניתוח רשימת הקבצים. תחת מודולי קלט, בחר תמונות (ראה איור 5A עבור מודול הגדרות). מודולי קלט, בחר מטא-נתונים (ראה איור 5B עבור מודול הגדרות). מודולי קלט, בחר NamesAndTypes (ראה איור 5C עבור מודול הגדרות).
      2. עבור קבוצות, בחר לא. ניתוח מודולים, בחר ColorToGray (ראה איור 5D עבור מודול הגדרות).
    6. ניתוח מודולים, בחר חלקה (ראה איור 5E עבור מודול הגדרות).
      הערה: ערך זה ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים, בהתאם רזולוציית התמונה.
    7. ניתוח מודולים, בחר IdentifyPrimaryObjects (ראה איור 5F עבור מודול הגדרות).
      הערה: מיטוב ערכים אלה כדי לוודא שהגרעין כולו נבחרה. לאחר שלב זה, המחשב עלול לפגר.
    8. ניתוח מודולים, בחר חלקה (ראה איור 5G עבור מודול הגדרות).
      הערה: ערך זה ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים, בהתאם רזולוציית התמונה.
    9. ניתוח מודולים, בחר EnhanceOrSuppressFeatures (ראה איור 5 H עבור מודול הגדרות).
    10. ניתוח מודולים, בחר IdentifyPrimaryObjects (ראה איור 5I עבור מודול הגדרות).
      הערה: למטב את הערכים האלה כדי לוודא punctae נבחרו. לאחר שלב זה, המחשב עשוי בעומר שוב.
      1. ניתוח מודולים, בחר RelateObjects (ראה איור 5J עבור מודול הגדרות). ניתוח מודולים, בחר ClassifyObjects (ראה איור 5 K עבור מודול הגדרות). ניתוח מודולים, בחר ExportToSpreadsheet (ראה איור 5 L עבור מודול הגדרות).
      2. לחץ על תמונות לנתח בלוח השמאלי התחתון כדי לבצע ניתוח תמונות. לאחר סיום מוצלח של הניתוח, נוצרות מספר תמונות (איור 6A-F).
        הערה: המשתמשים צריכים לשמור תמונות אלה לשימוש עתידי.
      3. הערה את הקובץ. csv המכיל את הנתונים הכמותיים לצורך ניתוח נוסף שנוצר ושמרת במיקום המתאים במחשב. בגיליון האלקטרוני הנקרא MyExpt_Image, בעמודות B ו- D יהיו מספר גרעינים זה להכיל עד חמישה ויותר punctae, בהתאמה. להוסיף עמודות B ו- D כדי לקבל את המספר הכולל של גרעין האטום.
    11. חזור על שלב 2.3.3 - 2.3.8 לכל התמונות (לשנות את שם הקובץ MyExpt_ לפני כל ניתוח). חלקות יכולה להיעשות לשם הערכת שלמות הדנ א, כפי שמוצג באיור 4C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי גזע pluripotent המושרה האנושי היו תרבותי, לנזק לדנ א ו ברגע הזנב, אשר שימשו כאמצעי של שלמות הדנ א, נותחו על ידי שביט וזמינותו. תאי iPS היו בתוך נקודת ההיתוך הנמוכה agarose והניח על משטח זכוכית. התאים, לאחר מכן, טופלו באמצעות מאגר פירוק, ואחריו פתרון אלקליין, להשיג supercoiled DNA. Nucleoids היו electrophoresed, שביטים היו דמיינו ידי לצבוע דנ א (איור 1 א'-D). השביטים, ואז, נותחו עם ImageJ, באמצעות התוסף assay שביט (איור 2 א-ג).

תאי iPS האנושי טופלו Doxo לגרום נזק לדנ א, שישמש כפקד חיובי. Micrographs נציג של שביטים מתאי iPS Doxo- ובא nontreated מוצגים באיור 3 א. כמות הבזליים של נזק לדנ א נמצא בתאי iPS, המבוטא כשבר של ה-DNA נזק וזנב הרגע. עם זאת, Doxo הטיפול גדל הנזק ה-DNA בתאי iPS כמו צפוי (איור 3Bג). זה מראה כי וזמינותו שביט ניתן להשתמש כדי להעריך את תקינות ה-DNA לא רק תאים סומטיים18,19 , אלא גם תאי גזע pluripotent21.

טרי הבדיל iPS cardiomyocytes (iPS-CMs), שב ס-CMs בתרבית במשך 6 חודשים (ממושך תרבות [PC]), ו- iPS-CMs שטופלו Doxo היו נתונים γH2A.X immunolabeling. Micrographs נציג של γH2A.X immunolabelling מוצגים באיור 4A (התחתונה-הגדלה), דמות 4B (גבוה יותר ההגדלה). מספר מוקדים γH2A.X (DDR foci) (punctae) בגרעין כל הם לכמת, באמצעות CellProfiler עם צינור מותאם אישית מודולים (איור 5A-L). אחוז תאים שהם חיוביים עבור γH2A.X מסווגים לתוך גרעינים עם אפס חמש punctae גרעינים עם punctae יותר מ- 10. הבקרה iPS-בס ' מ, למעלה מ-90% של התאים פחות מחמישה מוקדים DDR לכל הגרעינים, והיו סך של פחות מ-10% מכלל התאים יותר משישה מוקדים DDR לכל הגרעינים (איור 4C, שליטה [Ctrl]). שב ס-CMs תרבותי במשך 6 חודשים היה פחות מ 90% תאים עם פחות מחמישה מוקדים DDR לכל הגרעינים, וסכום כולל של יותר מ-13% מהתאים היה יותר משישה מוקדים DDR לכל הגרעינים (איור 4C, PC), ואילו שטופלו Doxo שב ס ס מ הראו פחות מ- 80% של התאים עם לס s מאשר חמישה מוקדים DDR לכל הגרעינים, סך של-24% של התאים היו יותר משישה מוקדים DDR לכל הגרעינים (איור 4C, Doxo). נתונים אלה מראה בבירור כי תרבית תאים ממושך וטיפול Doxo לגרום נזק משמעותי DNA ב iPS-CMs, אינם מתאימים השתלת תא.

Figure 1
איור 1: סכימטי של שביט וזמינותו. (א) לערבב התליה תא עם נקודת ההיתוך הנמוכה agarose ו- (B) למקם אותו על משטח זכוכית. (ג) לטפל בזה עם מאגר פירוק התא, ואחריו פתרון אלקליין, כדי לקבל המכיל supercoiled DNA nucleoids. (ד) Electrophorese כתם הדנ א באמצעות DNA SYBR ירוק צבע. תיאור סכמטי של שלמה (משמאל) ועל דנ"א פגום (נכון, צורה שביט) (E). (F) הנוסחה לחישוב שבריר של ה-DNA נזק וזנב הרגע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ה-DNA נזק וזנב רגע כימות מאת ImageJ. (א-ג) צילומי מסך של ImageJ, עם תוסף ניתוח שביט מציג מבחר של שביט בראש וזנב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דוקסורוביצין גורם נזק לדנ א בתאי iPS אנושי. (א) ה-DNA נזק שטופלו דוקסורוביצין (Doxo), nontreated (בקרה) תאי iPS, נותחה באמצעות וזמינותו שביט. (B) שבר של נזק לדנ א (n = 3) ו- (ג) זנב ברגע (n = שביטים 63) לכמת באמצעות וזמינותו שביט. טיפול עם דוקסורוביצין, סוכן ה-DNA-intercalating, גדל באופן משמעותי את השבר של ה-DNA נזק וזנב הרגע בתאי iPS. הנתונים הם אמצעי ± ב- SEM *P < 0.05, תלמיד של אינטראקצית t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: DNA נזק התגובה cardiomyocytes נגזר שב ס. (א) ה-DNA נזק תגובה סמן γH2A.X המזוהה על-ידי immunofluorescence שטופלו דוקסורוביצין (Doxo), nontreated (בקרה) שב ס-cardiomyocytes, כמו גם ממושך תרבות iPS-cardiomyocytes (PC). (B) גבוה יותר ההגדלה של γH2A.X (punctae ירוק) תיוג באתרים של נזק לדנ א ב iPS-מוקדים CMs. (ג) כימות של DDR, נותחה באמצעות CellProfiler עם מודולי צינור מותאם אישית. הנתונים הם אמצעי ± SD; n = 3 עד 4. P < 0.05, תלמיד של אינטראקצית t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אוטומטית ניתוח התגובה נזק הדנ א מאת CellProfiler. (A-L) צילומי מסך של CellProfiler עם ההגדרות שצוינו עבור ייבוא התמונות, ואת הזיהוי האוטומטי כימות של γH2A.X punctae ב iPS-CMs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: אוטומטית ניתוח התגובה נזק הדנ א מאת CellProfiler. (A-F) תמונות נתונים שנוצר על ידי CellProfiler, בסיומו של ניתוח תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלמות הדנ א מציגה שלמות התא. תאים עם דנ"א פגום הם לעתים קרובות בלחץ, בסופו של דבר מאבד את היושר שלהם. השלמות של גזע, תאי גזע-תא-נגזר להיות מופצים לצורך השתלת הוא עיקרי עבור התאים לביצוע תפקידם הרצוי. משתילים תאים עם דנ"א פגום יגרום קצב engraftment המסכן ובביצועים של8,תא20. לפיכך, בחינת שלמות הדנ א לפני השתלת תא הוא פרוטוקול בקרת איכות הכרחי. כאן אנו מתארים שתי גישות חסכונית, כלומר כוכב השביט assay, γH2A.X immunofluorescence תיוג, כדי להעריך את נזק לדנ א ואיכות גזע ותאי גזע-תא-נגזר.

הגורם העיקרי הזדקנות תאית נחשב ההצטברות של נזק לדנ א בתאים. באמצעות וזמינותו שביט, אל-בכר ואח ניתח לנזק לדנ א fibroblasts עורי אדם צעיר, senescent22. בעבר, אנחנו הראו את השתלה DNA ללא לב ובתאים מבודדים מן עכבר p53 הגדילו את שיעור engraftment האיבר מארח8. לאחרונה, אנחנו הראו את התפקיד של התחום transactivation p53, מנגנוני תיקון נזק DNA תאי iPS האנושי21. שני מחקרים, יש לנו עובדים שניהם שביט assay, γH2A.X immunofluorescence תיוג מתודולוגיות כדי להעריך את הנזק ה-DNA בתאי גזע. שתי השיטות האלה הינם חסכוניים, ניתן לבצע באמצעות ציוד מעבדה בסיסית. בעיה קריטית מעצבן זה לעיתים קרובות שחווינו הוא agarose שהשרף מתהווה פיפטה, צינורות. לנו להתגבר על בעיה זו על-ידי prewarming כל צינורות, טיפים לפני pipetting agarose. בעוד וזמינותו שביט לוקח עד 2 ימים כדי להשלים, אופטימיזציה γH2A.X immunofluorescence תיוג הפרוצדורה יכולה להסתיים במתחת לגיל 4 h.

תרביות תאים אנושיים iPS עם יותר מ-10% נזק לדנ א, נמדדת וזמינותו שביט, לא ביעילות להתמיין cardiomyocytes (נתונים לא מוצג) במבחנה. וזמינותו שביט הוא רגיש ודינמי בהערכת נזק לדנ א בתאי גזע. עם זאת, הערכות שלמות הדנ א בתאים מסוימים, כגון iPS-derived cardiomyocytes, הם מסורבלת מאת שביט assay בשל אופיו של התאים. Cardiomyocytes מועשרים עם טרופונין, חלבונים sarcomeric את החלבונים על ידי מטריצה חוץ-תאית. Denaturing אלה מבנים מורכבים כדי להפוך supercoiled הדנ א שלה הפארמצבטית נמצאים בספק. והכי חשוב, 25%-40% של האדם cardiomyocytes binucleated25, האחוזים הללו נבדלים cardiomyocytes נגזר iPS. מאז קיר התא מופרת ב וזמינותו שביט, ההערכה מדויקת של אחוז תאים פגומים-DNA בלתי אפשרי. לכן, במקרה של שב ס-CMs, γH2A.X immunofluorescence תיוג ההליך כדי להעריך נזק לדנ א היא חלופה פשטני עבור וזמינותו שביט.

בהתבסס על תוצאות אלה ואלה מפרסומים קודמים על-ידי שלנו קבוצה8,20,21, אנו ממליצים כי, אם יש יותר מ-10% נזק לדנ א, מוערך על ידי שביט assay, או פחות מ- 90% של התאים יש אפס חמש DDR צריך להיות פסול מוקדים, ולאחר מכן את התרבות השתלת תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי הלאומי ללב, ריאות, דם המכון מענקים RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 ו UO1-HL-134764 (כדי ג'יי ג'אנג) ועל -ידי האמריקאי הלב איגוד מדעי מענק פיתוח 17SDG33670677 (ל Kannappan ר).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		 Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  2. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  3. Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
  4. Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
  5. Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
  6. Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
  7. Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
  8. Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
  9. Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
  10. Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
  11. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  12. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  13. Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
  14. Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
  15. Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
  16. Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
  17. Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
  18. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  19. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  20. Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
  21. Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
  22. Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
  23. Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
  24. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
  25. Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 143 שלמות הדנ א נזק לדנ א תאי iPS שביט assay γH2A.X cardiomyocytes השתלת תא
הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, J. M., Mardhekar, N. M.,… More

Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter