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Genetics

कार्डियक सेल थेरेपी के लिए स्टेम सेल डीएनए अखंडता का आकलन

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58971
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम स्टेम सेल में डीएनए अखंडता के आकलन के एक विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप के एक विस्तृत विवरण प्रदान करने से पहले कोशिका प्रत्यारोपण ।

Abstract

स्टेम और स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोशिकाओं को विभिन्न अपक्षयी रोगों के लिए एक पुनः अपक्षय चिकित्सा के रूप में अपार क्षमता है । डीएनए, स्टेम सेल सहित सभी कोशिकाओं में आनुवंशिक डेटा की गोदाम है, और इसकी अखंडता अपनी अपक्षयी क्षमता के लिए मौलिक है । स्टेम सेल प्रयोगशालाओं में तेजी से प्रसार के लिए प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक संख्या को प्राप्त करने के लिए गुजरना । त्वरित कोशिका वृद्धि संचित चयापचयों, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन, carbonyl, और alkylating एजेंटों द्वारा डीएनए अखंडता की हानि की ओर जाता है । इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण गरीब engraftment और बिगड़ती अंग के उत्थान में परिणाम होगा । इसके अलावा, डीएनए प्रत्यारोपण क्षतिग्रस्त कोशिकाओं उत्परिवर्तनों की ओर जाता है, डीएनए अस्थिरता, सेलुलर वार्धक्य, और संभवतः, जीवन की धमकी रोगों जैसे कैंसर । इसलिए, प्रत्यारोपण के लिए सेल की उपयुक्तता का मूल्यांकन करने के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण विधि के लिए एक तत्काल की जरूरत है । यहां, हम कोशिका प्रत्यारोपण से पहले स्टेम सेल के डीएनए अखंडता के आकलन के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

Introduction

प्रयोगात्मक और नैदानिक सबूत दर्शाता है कि कोशिका प्रत्यारोपण मामूली असफल दिल1,2,3,4,5 के वाम निलय सिकुड़ा प्रदर्शन में सुधार कर सकते हैं ,6,7,8,9. हाल के अग्रिमों हृदय पुनर्जनन के लिए आगे अपील के अवसर खुल गए हैं; ये दैहिक कोशिकाओं में reprogramminging कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति के लिए pluripotency प्रेरित और इन प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं अलग कार्डियक वंश में (iPSC) अंतर शामिल हैं, महत्वपूर्ण बात cardiomyocyte (मुख्यमंत्री)10, 11 , 12 , 13. हर कोशिका में वंशानुगत सामग्री, जिसमें कृत्रिम रूप से सृजित iPSCs और iPSC-व्युत्पन्न मुख्यमंत्री (आईपीएस-cm) शामिल हैं, डीएनए है । डीएनए में संग्रहित आनुवंशिक निर्देश वृद्धि, विकास, और कोशिकाओं, ऊतकों, अंगों, और जीवों के समारोह हुक्म । डीएनए निष्क्रिय नहीं है; सेल चयापचयों, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन, carbonyl, और नाइट्रोजन प्रजातियों, और alkylating एजेंटों डीएनए नुकसान इन विट्रो में और vivo14,15,16,17में पैदा कर सकता है । महत्वपूर्ण बात, डीएनए क्षति हर कोशिका में सहज रूप से होता है, एक महत्वपूर्ण आवृत्ति के साथ. इन नुकसानों को सही नहीं कर रहे हैं, यह डीएनए उत्परिवर्तन, सेलुलर वार्धक्य, डीएनए और सेल अखंडता की हानि, और संभवतः, जीवन धमकी कैंसर सहित रोगों, के लिए नेतृत्व करेंगे । इसलिए, डीएनए अखंडता को बनाए रखने के किसी भी कोशिका के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से iPSCs, कि क्लिनिक में भारी क्षमता है ।

मात्रा और अलग जीनोमिक डीएनए की अखंडता का आकलन करने के लिए, महंगे उपकरण बाजार पर उपलब्ध है । हालांकि, कोशिकाओं को अलग करने के बिना कोशिकाओं में डीएनए अखंडता का आकलन करने के लिए कोई सरल और लागत प्रभावी तरीके हैं । इसके अलावा, डीएनए अलगाव के दौरान उपयोगकर्ता प्रेरित डीएनए क्षरण इन तरीकों का उपयोग करने में प्रमुख खामियों में से एक है । एकल सेल जेल ट्रो (धूमकेतु परख के रूप में जाना जाता है)18,19 और γH2A. X immunolabeling8 तकनीक डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं में मौलिक दृष्टिकोण हैं । इन दो तरीकों महंगा उपकरण या पृथक जीनोमिक डीएनए डीएनए अखंडता8,20,21का विश्लेषण करने की आवश्यकता नहीं है । के बाद से, इन तकनीकों पूरे कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया है; उपयोगकर्ता प्रेरित डीएनए/आरएनए/नमूना तैयारी के दौरान प्रोटीन क्षरण इन प्रोटोकॉल को प्रभावित नहीं करेगा । यहां, डीएनए क्षति और स्टेम में डीएनए क्षति की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए सेल व्युत्पंन कोशिकाओं, हम कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए दोनों धूमकेतु परख और γH2A. X immunolabeling प्रदर्शन करते हैं । इसके अलावा, इन दो तरीकों के संयोजन, हम एक भोली आकलन है कि प्रत्यारोपण के लिए सेल की उपयुक्तता का मूल्यांकन किया जा सकता है का प्रस्ताव ।

धूमकेतु परख, या एकल सेल जेल ट्रो, कोशिकाओं में डीएनए टूटता उपाय । कम पिघलने agarose में एंबेडेड कोशिकाओं supercoiled डीएनए युक्त nucleoids फार्म करने के लिए लीजड ड हैं । ट्रो पर, खंडित डीएनए के छोटे टुकड़े और टूट डीएनए किस्में agarose pores के माध्यम से विस्थापित, जबकि बरकरार डीएनए, उनके विशाल आकार और मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ उनके विकार के कारण, एक सीमित प्रवास होगा । एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत सना हुआ डीएनए का पैटर्न एक धूमकेतु की नकल । धूमकेतु सिर बरकरार डीएनए है और पूंछ टुकड़े और टूटे डीएनए किस्में से बना है । डीएनए क्षति के अंश क्षतिग्रस्त डीएनए (धूमकेतु पूंछ) के सापेक्ष बरकरार डीएनए (धूमकेतु सिर) की तीव्रता के प्रतिदीप्ति तीव्रता से मापा जा सकता है. पैरामीटर पूंछ पल चित्रा 1में दिखाया गया के रूप में गणना की जा सकती है ।

डीएनए क्षति हिस्टोन H2A के फास्फारिलीकरण लाती है । एटीएम, एटीआर, और डीएनए-पीके kinases द्वारा Ser139 पर एक्स (γH2A. x) । फास्फारिलीकरण और H2A की भर्ती । डीएनए किनारा टूटता में एक्स डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR) कहा जाता है और डीएनए क्षतिग्रस्त होने के बाद तेजी से होता है । इस प्रक्रिया के बाद, चौकी-मध्यस्थता सेल चक्र गिरफ्तारी और डीएनए मरंमत प्रक्रियाओं शुरू कर रहे हैं । डीएनए की मरंमत के सफल समापन के बाद, γH2A. X dephosphorylated और phosphatases द्वारा निष्क्रिय है । लंबे समय तक और कई डीएनए किनारा टूट जाता है डीएनए में γH2A. X घावों के संचय के लिए सीसा । इससे डीएनए की क्षति और डीएनए अखंडता की क्षति की मरम्मत करने में कोशिका की अक्षमता का संकेत मिलता है । डीएनए में इन γH2A. X घावों की पहचान की जा सकती है और DDR घावों की संख्या खंड 2 में प्रोटोकॉल का उपयोग करके गिना जा सकता है ।

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Protocol

1. धूमकेतु परख

  1. एजेंट तैयारी
    1. कम पिघलने बिंदु agarose के लिए, जगह ५०० मिलीग्राम कम पिघलने agarose के १०० मिलीलीटर में डीएनए-/RNA-free पानी । एक माइक्रोवेव ओवन में बोतल गर्मी जब तक agarose घुल । एक ३७ ° c पानी स्नान में बोतल की जरूरत है जब तक प्लेस ।
      नोट: आगे पढ़ने के लिए, देखें Azqueta एट अल., जो डीएनए पर agarose एकाग्रता के प्रभावों का अध्ययन-unwind समय और कई ट्रो कारकों23।
    2. Tris में SYBR ग्रीन डीएनए डाई पतला-EDTA (ते) बफर एक 1:10000 अनुपात में एक 1x काम स्टॉक डाई समाधान प्राप्त करने के लिए । यह डाई प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, इसलिए इसे एक अंधेरी जगह पर स्टोर करें ।
    3. सेल lysis बफर के लिए, lysis बफर (२.५ एम NaCl, ०.१ मीटर EDTA, 10 मिमी Tris, 1% ट्राइटन एक्स-१००) के १०० मिलीलीटर भंग पानी में (DI एच2ओ) । उसके बाद, १०.० करने के लिए पीएच समायोजित करने के लिए 10 मीटर NaOH जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस के लिए बफर ठंडा ।
    4. क्षारीय डीएनए के लिए-unwind/ट्रो चल रहे बफर, 1 एल भंग क्षारीय समाधान (०.३ मीटर NaOH, 1 mM EDTA) में DI H2O. 4 ° c करने के लिए बफ़र शांत । 13 > पीएच सुनिश्चित करें ।
    5. कोट धूमकेतु स्लाइड के लिए, एक ग्लास स्लाइड पर ०.५% agarose की कुछ बूंदें रखें । तुरंत, एक और स्लाइड के सपाट सतह का उपयोग कर, agarose कोटिंग की एक पतली परत बनाने के लिए agarose फैला ।
      नोट: उपयोग करने से पहले स्लाइड को सुखाएं ।
    6. आईपीएस सेल संस्कृति के लिए, संक्षेप में संस्कृति आईपीएस कोशिकाओं तहखाने में झिल्ली-मैट्रिक्स-लेपित ( सामग्री की तालिकादेखें) mTESR1 संस्कृति के माध्यम में संस्कृति प्लेटें जब तक प्रवाह तक पहुंच जाता है ।
      नोट: मानव-हृदय-fibroblast-व्युत्पंन आईपीएस कोशिकाओं इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया । आईपीएस सेल व्युत्पत्ति और संस्कृति शर्तों के reprogramminging हमारे अनुसंधान समूह12,13,21से हाल के लेख में वर्णित है ।
  2. नमूना तैयारी
    1. संस्कृति माध्यम को त्यागें और कोशिकाओं को धोएं । अलग कर देना ( सामग्री की तालिकादेखें) टुकड़ी समाधान का उपयोग कर कोशिकाओं को देखते हैं । फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ सेल गोली धोने और 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल में पंजाब में कोशिकाओं resuspend ।
  3. नमूना स्लाइड तैयारी
    नोट: पराबैंगनी प्रकाश प्रेरित सेल क्षति से बचने के लिए कम प्रकाश शर्तों के तहत निंनलिखित चरणों का पालन करें ।
    1. एक ट्यूब में सेल सस्पेंशन और ९० μL ऑफ agarose सॉल्यूशन (1:10 रेश्यो) के 10 μL को मिक्स करें । agarose को जमना से रोकने के लिए ३७ ° c वॉटर बाथ में ट्यूब लगाएं ।
    2. मिश्रित धूमकेतु स्लाइड पर हवाई बुलबुले और पिपेट ७० μL/स्पॉट शुरू किए बिना समाधान मिश्रण । एक पिपेट टिप का प्रयोग, एक पतली परत बनाने के लिए सेल agarose मिश्रण फैल गया । 15 मिनट के लिए 4 ° c में स्लाइड प्लेस ।
    3. किसी संग्राहक में, शीत lysis बफ़र में स्लाइड पूरी तरह से जलमग्न है । 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कंटेनर रखें ।
    4. lysis बफ़र को ठंडे क्षारीय समाधान से बदलें । सुनिश्चित करें कि स्लाइड्स पूरी तरह से जलमग्न हैं । 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कंटेनर प्लेस ।
  4. वैद्युतकणसंचलन
    1. स्लाइड को क्षैतिज ट्रो टैंक में रखें । स्लाइड पूरी तरह से जलमग्न होने तक कोल्ड alkaline ट्रो बफर के साथ टैंक भरें । 1 वी/सेमी पर 15 से 30 मिनट के लिए वोल्टेज लागू करें ।
      नोट: कुल वोल्टेज = इलेक्ट्रोड के बीच दूरी x 1 V
    2. एक कंटेनर में, पूरी तरह से शीत DI एच2ओ में स्लाइड जलमग्न । 2 मिनट के बाद, डि एच2ओ निकालें और ताजा डि एच2ओ जोड़ें इस कदम को दोहराएँ ।
    3. बदलें DI एच2O ठंड ७०% इथेनॉल के साथ । 5 मिनट रुको । धीरे स्लाइड निकालें, यह झुकाव नहीं है, और यह हवा सूखी ।
    4. एक बार सूख, प्रत्येक स्थान पर पतला डीएनए डाई के १०० μL जोड़ें । कमरे के तापमान पर 15 मिनट रुको । एक epifluorescence माइक्रोस्कोप में एक FITC फिल्टर का उपयोग करना, प्रति नमूना कुल में ५० १०० धूमकेतु के चित्र ले.
  5. छवि विश्लेषण और परिणामों की गणना
    1. धूमकेतु स्कोरिंग के लिए, धूमकेतु परख प्लगइन के साथ स्वास्थ्य (NIH) ImageJ के राष्ट्रीय संस्थानों का उपयोग करें (यहां ImageJ डाउनलोड: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; प्लगइन यहां डाउनलोड करें: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/) ।
      नोट: प्लगइन एक PDF अनुदेश जो सभी विवरण शामिल करने के लिए विश्लेषण प्रदर्शन के साथ आता है । इसके अतिरिक्त, धूमकेतु विश्लेषण के स्क्रीनशॉट चित्र 2a-सीमें दिखाए जाते हैं । प्रतिनिधि धूमकेतु नियंत्रण और डॉक्सोरूबिसिन (Doxo) के चित्र-इलाज आईपीएस कोशिकाओं और धूमकेतु की ठहराव चित्र 3 ए-सीमें दिखाए जाते हैं ।

2. डीएनए क्षति प्रतिक्रिया

  1. नमूना और एजेंट की तैयारी
    1. एक आईपीएस के लिए-मुख्यमंत्री सेल संस्कृति, संस्कृति आईपीएस-सेमी कोशिकाओं तहखाने में झिल्ली-मैट्रिक्स-लेपित ( सामग्री की तालिकादेखें) RPMI मध्यम में संस्कृति प्लेट्स बी के साथ पूरक-27 (सीएमएम) जब तक प्रभावित तक पहुंच जाता है ।
      नोट: मानव-आईपीएस-सेल-व्युत्पंन cardiomyocytes इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया । cardiomyocytes में आईपीएस सेल भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल हमारे अनुसंधान समूह12,13,21से हाल के लेख में पाया जा सकता है ।
    2. बीज आईपीएस-चैंबर स्लाइड में सीएमएस ।
      1. कल्चरल मीडियम को आईपीएस-CM वेल्स से त्यागें. तीन बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
      2. अच्छी तरह से प्रति ०.२५% trypsin की 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । सेल टुकड़ी के लिए एक खुर्दबीन के नीचे प्लेट की जांच करें । trypsin को रोकने के लिए 1 मिलीलीटर सीएमएम जोड़ें ।
      3. प्लेस सेल सस्पेंशन एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और २०० एक्स जीपर केंद्रापसारक मध्यम छोड़ें, सीएमएम की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और कक्षों को पुनर्स्थगित करें । कोशिकाओं गिनती और सीएमएम के १.६ मिलीलीटर में 20 x 105 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सेल गिनती समायोजित करें ।
      4. बीज २०० 8 अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड के प्रति सेल निलंबन के µ एल ( सामग्री की तालिकादेखें) । स्लाइड को धीरे से चारों ओर फैलाएं और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के आसपास की कोशिकाओं को टैप करें ।
    3. आईपीएस-cm डॉक्सोरूबिसिन ट्रीटमेंट के लिए, आईपीएस-cm वेल्स से कल्चरल मीडियम को त्यागें. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । 4 एच. महाप्राण के लिए 1 माइक्रोन डॉक्सोरूबिसिन और सीएमएम के साथ कोशिकाओं का इलाज करें और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    4. ब्लॉकिंग बफ़र के लिए, 3% BSA और ०.०५% ट्राइटन X-१०० युक्त गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) समाधान की 10 मिलीलीटर तैयार करें । को रोकने के बफर के 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, तैयार BSA समाधान के 9 मिलीलीटर के लिए सामांय गधा सीरम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के लिए, एंटी-खरगोश phospho-हिस्टोन H2A के 1 μL जोड़ें । X (Ser139) एंटीबॉडी करने के लिए २०० μL बफ़र को अवरोधित कर रहा है ।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के लिए, 1 μL fluorochrome-संयुग्मित विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी, DAPI, और fluorochrome-संयुग्मित phalloidin के २०० μL को अवरुद्ध बफर के जोड़ें ।
  2. Immunolabeling
    1. पंजाबियों के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोने और नए सिरे से तैयार की २०० μL जोड़ें 4% paraformaldehyde (पीएफए) प्रत्येक अच्छी तरह से । कमरे के तापमान पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें । पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    2. पंजाबियों को हटाने और प्रति अच्छी तरह से बफर अवरुद्ध की २०० μL जोड़ने और कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में 30 मिनट के लिए ब्लॉक । ब्लॉकिंग बफ़र निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के २०० μL जोड़ें । कमरे के तापमान पर एक अंधेरे, humidified चैंबर में ४५ मिनट के लिए मशीन । फिर, पंजाबियों के साथ कुओं को तीन बार धोएं ।
    3. पंजाबियों निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के २०० μL जोड़ें । कमरे के तापमान पर एक अंधेरे, humidified चैंबर में ४५ मिनट के लिए मशीन । फिर, पंजाबियों के साथ कुओं को तीन बार धोएं । उंहें antifade के साथ बढ़ते पहले DI एच2ओ के साथ धो लो । एक coverglass प्लेस और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान ।
    4. एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, नमूना प्रति यादृच्छिक क्षेत्रों के तीन से पांच छवियों को ले, के रूप में चित्र 4aमें दिखाया गया है, और छवि विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ना.
  3. DDR घावों की गिनती
    1. CellProfiler24 (http://cellprofiler.org) डाउनलोड और स्थापित करें ।
    2. नोट: इस अध्ययन में छवि प्रसंस्करण CellProfiler संस्करण 2.1.1 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । CellProfiler के लिए ट्यूटोरियल है कि इस्तेमाल किया गया कहीं और पाया जा सकता है (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk&list=PL7CC87670239B4D10) । CellProfiler का एक नया संस्करण उपयोग किया जा रहा है, तो पाइपलाइन मामूली रूपांतरों की आवश्यकता हो सकती है ।
    3. पाइपलाइन punctae_gH2AX. cpipeडाउनलोड करें । फ़ाइल से फ़ाइल > आयात > पाइपलाइन का चयन करें और punctae_gH2AX. cpipeचुनें ।
    4. ड्रैग-एण्ड-ड्रॉप फ़ोल्डर γH2A. X के प्राप्त किए गए चित्रों को इनपुट मॉड्यूल/छवियां अनुभाग में विश्लेषण (चित्र 5) के लिए फ़ाइल सूची विंडो में शामिल हैं । उसके बाद, चित्र 5 में दिखाए गए के रूप में निर्देशों का पालन करें -L।
    5. छवियों के लिए निंन पैरामीटर सेट करें:
      1. फ़ाइल सूचीपर विश्लेषण के लिए इच्छित छवि खींचें । इनपुट मॉड्यूलके अंतर्गत, चित्र (मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए चित्र 5 देखें) का चयन करें । इनपुट मॉड्यूलमें, मेटाडेटा (देखें चित्र 5B मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) का चयन करें । इनपुट मॉड्यूलमें, का चयन करें NamesAndTypes (देखें चित्र 5C मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) ।
      2. समूहके लिए, नहींका चयन करें । विश्लेषण मॉड्यूलमें, ColorToGray (देखें चित्र 5d मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) का चयन करें ।
    6. विश्लेषण मॉड्यूलमें, स्मूथ (देखें चित्र 5E मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) का चयन करें ।
      नोट: इस मान को छवि रिज़ॉल्यूशन के आधार पर ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    7. विश्लेषण मॉड्यूलमें, का चयन करें IdentifyPrimaryObjects (देखें चित्र 5F मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) ।
      नोट: पूरा नाभिक चयनित है यह सुनिश्चित करने के लिए इन मानों का ऑप्टिमाइज़ करें । इस चरण के बाद, कंप्यूटर अंतराल हो सकता है ।
    8. विश्लेषण मॉड्यूलमें, स्मूथ (मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए चित्र की संख्या देखें) का चयन करें.
      नोट: इस मान को छवि रिज़ॉल्यूशन के आधार पर ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    9. विश्लेषण मॉड्यूलमें, का चयन करें EnhanceOrSuppressFeatures (देखें चित्र 5H मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) ।
    10. विश्लेषण मॉड्यूलमें, का चयन करें IdentifyPrimaryObjects (देखें चित्र 5I मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि punctae चयनित है करने के लिए इन मानों का अनुकूलन । इस चरण के बाद, कंप्यूटर फिर से अंतराल हो सकता है ।
      1. विश्लेषण मॉड्यूलमें, का चयन करें RelateObjects (देखें चित्र 5J मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) । विश्लेषण मॉड्यूलमें, ClassifyObjects (मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए चित्र 5k देखें) का चयन करें । विश्लेषण मॉड्यूलमें, का चयन करें ExportToSpreadsheet (देखें चित्र 5L मॉड्यूल सेटिंग्स के लिए) ।
      2. छवि विश्लेषण करने के लिए नीचे बाएँ फलक पर छवियों का विश्लेषण करें पर जाएँ. विश्लेषण के सफल समापन पर, कई छवियां (चित्रा 6A-F) उत्पंन कर रहे हैं ।
        नोट: उपयोगकर्ताओं को भविष्य में संदर्भ के लिए इन छवियों को बचाना चाहिए ।
      3. आगे के विश्लेषण के लिए मात्रात्मक डेटा वाली. csv फ़ाइल नोट करें जो कंप्यूटर पर उपयुक्त स्थान में उत्पंन और सहेजी गई है । MyExpt_Imageनामक स्प्रेडशीट में, कॉलम बी और डी में नाभिक की संख्या होगी जो क्रमशः पांच और अधिक punctae तक होती है । नाभिक की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए स्तंभ B और D जोड़ें ।
    11. दोहराएं कदम 2.3.3-2.3.8 सभी छवियों के लिए (हर विश्लेषण से पहले MyExpt_ फ़ाइल नाम बदलें) । भूखंडों का आकलन डीएनए अखंडता के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 4cमें दिखाया गया है ।

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Representative Results

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, संस्कृति और डीएनए क्षति और पूंछ पल, जो डीएनए अखंडता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया धूमकेतु परख द्वारा विश्लेषण थे । आईपीएस कोशिकाओं कम पिघलने बिंदु agarose में एंबेडेड और एक गिलास स्लाइड पर रखा गया । कोशिकाओं रहे थे, तो, lysis बफर के साथ इलाज किया, एक alkaline समाधान के बाद, supercoiled डीएनए प्राप्त करने के लिए । Nucleoids थे electrophoresed और धूमकेतु डीएनए डाई द्वारा visualized थे (चित्रा 1aडी). धूमकेतु थे, तो, ImageJ के साथ विश्लेषण, धूमकेतु परख प्लगइन का उपयोग कर (चित्रा 2aसी) ।

मानव आईपीएस कोशिकाओं Doxo के साथ डीएनए क्षति पैदा करने के लिए और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए इलाज किया गया । Doxo-इलाज और गैर-इलाज आईपीएस कोशिकाओं से धूमकेतुओं के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ चित्र 3ए में दिखाए जाते हैं । डीएनए क्षति का एक बेसल राशि आईपीएस कोशिकाओं में पाया गया था, डीएनए क्षति और पूंछ पल के एक अंश के रूप में व्यक्त की । हालांकि, Doxo उपचार की उंमीद के रूप में आईपीएस कोशिकाओं में डीएनए क्षति बढ़ी (चित्र बी, सी) । यह पता चलता है कि धूमकेतु परख न केवल दैहिक कोशिकाओं18,19 लेकिन यह भी pluripotent स्टेम कोशिकाओं21में डीएनए अखंडता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हौसले से विभेदित आईपीएस cardiomyocytes (आईपीएस-सीएमएस), आईपीएस-सीएमएस 6 महीने के लिए प्रसंस्कृत (लंबे समय तक संस्कृति [पीसी]), और आईपीएस-सीएमएस Doxo के साथ इलाज γH2A. X immunolabeling के अधीन थे । γH2A. X immunolabelling के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ चित्रा 4a (कम आवर्धन) और चित्रा 4B (उच्च आवर्धन) में दिखाए जाते हैं । प्रत्येक नाभिक में γH2A. X घावों (DDR घावों) (punctae) की संख्या quantified, कस्टम पाइपलाइन मॉड्यूल के साथ CellProfiler का उपयोग कर (चित्र 5 ए-एल) है । γH2A. X के लिए धनात्मक कक्षों का प्रतिशत 10 से अधिक punctae के साथ शूंय से पांच punctae और नाभिक के साथ नाभिक में वर्गीकृत किया गया है । नियंत्रण आईपीएस-सेमी में, ९०% से अधिक कोशिकाओं को प्रति नाभिक पांच से कम DDR घावों था, और कोशिकाओं के एक कुल से कम 10% की तुलना में नाभिक (चित्रा 4c, नियंत्रण [Ctrl]) प्रति छह से अधिक DDR घावों था । आईपीएस-सीएमएस 6 महीने के लिए प्रसंस्कृत कम से कम पांच DDR नाभिक प्रति घावों के साथ ९०% कोशिकाओं था, और कोशिकाओं के 13% से अधिक की कुल नाभिक प्रति छह से अधिक DDR घावों था (चित्रा 4c, पीसी), जबकि Doxo-इलाज आईपीएस-मुख्यमंत्री लेस के साथ कोशिकाओं के ८०% से भी कम दिखाया नाभिक प्रति पांच DDR घावों की तुलना में एस, और कोशिकाओं के लगभग 24% की कुल प्रति नाभिक (चित्रा 4c, Doxo) छह से अधिक DDR घावों था । इस डेटा को स्पष्ट रूप से पता चलता है कि लंबे समय तक सेल संस्कृति और Doxo उपचार आईपीएस में महत्वपूर्ण डीएनए क्षति-सीएमएस प्रेरित और कोशिका प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: धूमकेतु परख के योजनाबद्ध । (a) कम पिघलने वाली पॉइंट agarose के साथ सेल सस्पेंशन को मिक्स करें और (B) इसे शीशे की स्लाइड पर लगाएं । (ग) यह कोशिका lysis बफर के साथ इलाज, एक alkaline समाधान के बाद, supercoiled डीएनए युक्त nucleoids पाने के लिए । (घ) Electrophorese और SYBR ग्रीन डीएनए डाई का उपयोग डीएनए दाग । (ङ) अक्षुण्ण (बाएँ) और क्षतिग्रस्त डीएनए (दाएँ, धूमकेतु आकार) की योजनाबद्ध. (च) सूत्र डीएनए क्षति और पूंछ पल के एक अंश की गणना करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ImageJ द्वारा डीएनए क्षति और पूंछ पल ठहराव । (A-C) ImageJ के स्क्रीनशॉट, धूमकेतु विश्लेषण धूमकेतु सिर और पूंछ का चयन दिखा प्लगइन के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: डॉक्सोरूबिसिन मानव आईपीएस कोशिकाओं में डीएनए क्षति लाती है । (क) डॉक्सोरूबिसिन-इलाज (Doxo) और गैर इलाज (नियंत्रण) आईपीएस कोशिकाओं में डीएनए क्षति, धूमकेतु परख का उपयोग विश्लेषण । (ख) डीएनए क्षति के अंश (n = 3) और (ग) पूंछ पल (n = ६३ धूमकेतु) quantified धूमकेतु परख का उपयोग कर । डॉक्सोरूबिसिन, एक डीएनए intercalating एजेंट के साथ उपचार, काफी डीएनए क्षति और आईपीएस कोशिकाओं में पूंछ पल के अंश बढ़ गई । डेटा का अर्थ है ± SEM. *पी < ०.०५, छात्र की ख़राब टीपरीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: आईपी में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया-व्युत्पंन cardiomyocytes । (क) डीएनए क्षति प्रतिक्रिया मार्कर γH2A. X डॉक्सोरूबिसिन में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पहचान-इलाज (Doxo) और गैर इलाज (नियंत्रण) आईपीएस-cardiomyocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लंबे समय तक संस्कृति आईपीएस-cardiomyocytes (पीसी) । (ख) γH2A. X (green punctae) का उच्च आवर्धन आईपीएस-सीएमएस में डीएनए क्षति के स्थलों पर लेबलिंग । (ग) DDR घावों के ठहराव, कस्टम पाइपलाइन मॉड्यूल के साथ CellProfiler का उपयोग कर विश्लेषण । डेटा ± एसडी का मतलब है; n = 3 से 4. *पी < ०.०५, छात्र की ख़राब टीपरीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: CellProfiler द्वारा स्वचालित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया विश्लेषण । (A-L) छवियों को आयात करने के लिए निर्दिष्ट सेटिंग्स के साथ CellProfiler के स्क्रीनशॉट, और स्वचालित पहचान और आईपीएस में γH2A. X punctae के ठहराव-सीएमएस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: CellProfiler द्वारा स्वचालित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया विश्लेषण । (क-च) छवि विश्लेषण के पूरा होने पर CellProfiler द्वारा उत्पंन डेटा छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

डीएनए अखंडता कोशिका अखंडता चित्रित । क्षतिग्रस्त डीएनए के साथ कोशिकाओं को अक्सर तनाव में है और अंततः अपनी अखंडता खो देते हैं । स्टेम और स्टेम सेल व्युत्पंन कोशिकाओं है कि प्रत्यारोपण के प्रयोजन के लिए प्रचारित किया जा रहा है की अखंडता के लिए कोशिकाओं को अपने वांछित समारोह प्रदर्शन के लिए प्रमुख है । क्षतिग्रस्त डीएनए के साथ कोशिकाओं प्रत्यारोपण एक गरीब engraftment दर और सेल8,20के प्रदर्शन में परिणाम होगा । इसलिए, डीएनए अखंडता कोशिका प्रत्यारोपण करने से पहले की जांच एक आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण प्रोटोकॉल है । यहाँ हम दो लागत प्रभावी दृष्टिकोण, अर्थात् धूमकेतु परख और γH2A. X इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग का वर्णन, डीएनए क्षति और स्टेम की गुणवत्ता और स्टेम सेल व्युत्पंन कोशिकाओं का आकलन करने के लिए ।

सेलुलर एजिंग का एक प्रमुख कारण कोशिकाओं में डीएनए क्षति का संचय होने लगा है. धूमकेतु परख, अल बेकर एट अल का उपयोग कर । युवा और वृद्ध होनेवाला मानव अधययन fibroblasts22में डीएनए क्षति का विश्लेषण किया । पहले, हमें पता चला है कि प्रत्यारोपण डीएनए नुकसान मुक्त कार्डियक जनक एक p53 ट्रांसजेनिक माउस से अलग कोशिकाओं मेजबान अंग8में engraftment की दर में वृद्धि हुई । हाल ही में, हम मानव आईपीएस कोशिकाओं21में डीएनए क्षति मरंमत तंत्र में p53 transactivation डोमेन की भूमिका को दिखाया गया है । दोनों अध्ययनों में, हम स्टेम सेल में डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए धूमकेतु परख और γH2A. X इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग के तरीके में कार्यरत है । इन दोनों तरीकों लागत प्रभावी रहे है और बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । एक कष्टप्रद महत्वपूर्ण समस्या है कि हम अक्सर अनुभव agarose पिपेट और ट्यूबों में स्थिर है । हम pipetting agarose से पहले सभी ट्यूबों और सुझावों को गर्म करने से इस मुद्दे पर काबू पा लिया । जबकि धूमकेतु परख 2 दिन तक के लिए पूरा हो जाता है, अनुकूलित γH2A. X इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग प्रक्रिया के तहत 4 में पूरा किया जा सकता है एच ।

मानव आईपीएस सेल संस्कृतियों से अधिक 10% डीएनए क्षति के साथ, धूमकेतु परख द्वारा मापा, कुशलता से cardiomyocytes में अंतर नहीं था (डेटा नहीं दिखाया) इन विट्रो में । धूमकेतु परख संवेदनशील और स्टेम सेल में डीएनए की क्षति का आकलन करने में गतिशील है । हालांकि, कुछ कोशिकाओं में डीएनए अखंडता आकलन, ऐसे आईपीएस के रूप में व्युत्पंन cardiomyocytes, धूमकेतु परख कोशिकाओं की प्रकृति के कारण से बोझिल हैं । cardiomyocytes ट्रोपोनिन, sarcomeric प्रोटीन, और स्रावित extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन से समृद्ध कर रहे हैं । Denaturing इन जटिल संरचनाओं supercoiled डीएनए बनाने के लिए और इसके reproducibility संदिग्ध हैं । सबसे महत्वपूर्ण बात, 25% मानव cardiomyocytes के ४०% के लिए25binucleated हैं, और इन प्रतिशत आईपीएस में भिंनता-cardiomyocytes व्युत्पंन । चूंकि सेल की दीवार धूमकेतु परख में खलल डालती है, इसलिए डीएनए के प्रतिशत को क्षतिग्रस्त करने वाली कोशिकाओं का सटीक आंकलन असंभव है । इसलिए, आईपीएस-सीएमएस के मामले में, γH2A. X इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग प्रक्रिया डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए धूमकेतु परख के लिए एक सरलीकृत विकल्प है ।

इन परिणामों के आधार पर और हमारे समूह द्वारा पिछले प्रकाशनों से उन8,20,21, हम सुझाव है कि, अगर वहां है अधिक से अधिक 10% डीएनए क्षति, धूमकेतु परख द्वारा मूल्यांकन, या कोशिकाओं के ९०% से कम पांच DDR शूंय है घावों, तो संस्कृति कोशिका प्रत्यारोपण के लिए अयोग्य ठहराया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान अनुदान RO1-एचएल-९९५०७, एचएल-११४१२०, एचएल-१३१०१७, HL138023, और UO1-एचएल-१३४७६४ (जे जांग के लिए) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान 17SDG33670677 (आर Kannappan) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		 Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

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References

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आनुवंशिकी १४३ अंक डीएनए अखंडता डीएनए क्षति आईपीएस सेल धूमकेतु परख γH2A. X cardiomyocytes कोशिका प्रत्यारोपण
कार्डियक सेल थेरेपी के लिए स्टेम सेल डीएनए अखंडता का आकलन
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Miller, J. M., Mardhekar, N. M.,… More

Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

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