Summary
여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.
Abstract
줄기 줄기 세포 유래 세포는 다양 한 퇴행 성 질환 재생 치료로 서 엄청난 잠재력이 있다. DNA는 줄기 세포를 포함 하 여 모든 셀에서 유전 정보의 창 고입니다 그리고 그것의 무결성은 재생 능력에 기본적 이다. 줄기 세포가 식 위한 필요한 수를 달성 하기 위해 실험실에서 급속 한 전파를 받 다. 빠른된 세포 성장 반응 산소, 생성, 에이전트 alkylating 등 축적 된 대사 산물에 의해 DNA 무결성의 손실에 지도 한다. 이 세포를 이식 가난한 engraftment 및 악화 장기의 재생 발생할 것 이다. 또한, 돌연변이, DNA 불안정, 세포 노화, DNA 손상 세포 리드를 이식 하 고 가능 하 게, 생명이 암 같은 질병. 따라서,이 식 위한 세포의 적합성을 평가 하는 품질 관리 방법에 대 한 즉각적인 필요가 있다. 여기, 우리는 이전에 세포 이식 줄기 세포의 DNA 무결성의 평가 대 한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
실험 및 임상 증거 세포 이식 적당히 마음1,2,,34,5 실패의 좌 심 실 수축 성능을 향상 시킬 수 보여줍니다. ,6,7,,89. 최근 진보 심혈 관 재생;에 대 한 기회를 더 매력적인 연 이러한 체세포 pluripotency 유도 다른 심장 계보, 중요 한 것은 cardiomyocyte (CM)10, 으로이 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 구분 하기에 재활 요인의 강제 식 포함 11 , 12 , 13. 인위적으로 생성 된 Ipsc, iPSC 파생 CM (iPS-CM)를 포함 하 여 모든 세포에서 유전 물질은 DNA. DNA에 저장 된 유전 지시 지시 성장, 개발 및 셀, 조직, 장기, 그리고 유기 체 기능. DNA는 불활성; 세포 대사 산물, 반응성 산소, 생성, 질소 종 등 하 고 에이전트 alkylating 손상 될 수 있습니다 원인 DNA 생체 외에서 그리고 vivo에서14,15,,1617. 중요 한 것은, DNA 손상 중요 한 주파수를 가진 모든 셀에 직관적으로 발생합니다. 경우 이러한 손해는 해결 되지 않으면, 그것은 DNA 돌연변이, 세포 노화, DNA와 세포 무결성, 그리고 아마도, 질병, 생명을 위협 하는 암 등의 손실 이어질 것입니다. 따라서, DNA 무결성 유지 특히 Ipsc, 병원에서 엄청난 잠재력을 가진 어떤 셀에 필수적 이다.
수량 및 고립 된 게놈 DNA의 무결성을 평가, 고가의 장비 시장에 유효 하다. 그러나, 셀을 분리 하지 않고 셀에 DNA 무결성을 평가 하기 위해 아무 간단 하 고 비용 효율적인 방법이 있다. 또한, DNA 분리 하는 동안 DNA 저하 사용자 유도 이러한 메서드를 사용 하 여 주요 단점 중 하나입니다. 단일 셀 젤 전기 이동 법 (혜성 분석 결과 라고도 함)18,19 와 γH2A.X immunolabeling8 기술 연구 실험실에서 DNA 손상 평가 대 한 근본적인 접근 있습니다. 이러한 두 가지 방법 고가의 장비 또는 DNA 무결성8,,2021분석 하 고립 된 게놈 DNA를 필요 하지 않습니다. 이후, 이러한 기술은 전체 셀; 수행 되었습니다. 샘플 준비 하는 동안 사용자 유도 DNA/RNA/단백질 저하는 이러한 프로토콜에 영향을 미치지 않습니다. 여기, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포에서 DNA 손상 응답 평가, 우리 혜성 분석 결과 및 γH2A.X immunolabeling를 모두 수행 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 결합이 두 가지 방법, 제안 한다 순진한 평가 이식에 대 한 셀의 적합성을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.
혜성 분석 결과, 또는 단일 셀 젤 전기 이동 법, 세포에서 DNA 나누기를 측정 한다. 낮은 녹는 agarose에 포함 된 셀은 supercoiled DNA를 포함 하는 양식 nucleoids을 lysed. 전기 이동 법, 그들의 거 대 한 크기와 매트릭스 단백질 그들의 활용 그대로 DNA 제한 마이그레이션 갖습니다 반면 agarose 숨 구멍을 통해 작은 조각 조각난된 DNA와 깨진된 DNA 가닥의 마이그레이션합니다. 형광 현미경으로 얼룩진된 DNA의 패턴은 혜성을 모방합니다. 그대로 DNA를 포함 하는 혜성 머리와 꼬리 조각의 구성 및 고장 DNA 가닥. DNA 손상의 분수는 그대로 DNA (혜성 머리) 강도 기준으로 손상 된 DNA (혜성 꼬리)의 형광 강도 의해 측정할 수 있습니다. 그림 1과 같이 매개 변수 꼬리 순간을 계산할 수 있습니다.
DNA 손상 히스톤 H2A의 인 산화를 유도 한다. ATM, ATR, 및 DNA-PK kinases 여 Ser139에서 (γH2A.X) X. 인 산화 그리고 H2A의 모집입니다. DNA 가닥 나누기에서 X DNA 손상 응답 (DDR) 이라고 하 고 DNA 손상 후 급속 하 게 일어난다. 이 과정, 세포 주기 검문소 중재 체포 및 DNA 복구 프로세스가 시작 됩니다. DNA 수리 완료 후 γH2A.X dephosphorylated 이며 가수분해에 의해 비활성화. 연장 하 고 여러 개의 DNA 가닥 나누기 DNA에 γH2A.X foci의 축적으로 이어질. 이 DNA 손상 및 DNA 무결성의 손실 복구 하 셀의 무 능력을 나타냅니다. 이러한 γH2A.X foci DNA에 의해 확인 될 수 있다 그리고 2 절에서 프로토콜을 사용 하 여 DDR foci의 수를 계산 하실 수 있습니다.
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Protocol
1. 혜성 분석 결과
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시 약 준비
- 낮은 용 해 점 agarose 낮은 녹는 agarose의 500 mg 100 ml의 DNA-장소/물 RNA-무료. agarose를 녹이 고 때까지 전자 레인지에서 병을 열. 37 ° C 물 목욕까지 필요에 병을 배치 합니다.
참고: 추가 읽기를 위해 Azqueta 그 외 여러분, DNA 해제 시간 및 여러 전기 요소23agarose 농도의 영향을 공부한 참조. - 재고 염료 솔루션 작업 x 1를 1:10,000 비에 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 SYBR 녹색 DNA 염료 희석. 이 염료는 빛에 민감한, 그래서 어두운 장소에 보관.
- 세포 세포의 용 해 버퍼에 대 한 분해 세포의 용 해 버퍼의 100 mL (2.5 M NaCl, 0.1 m M EDTA, 10 mM Tris, 1% 트라이 톤 X-100) 이온을 제거 된 물 (디 H2O). 그런 다음, 추가 10 M NaOH pH 10.0 조정. 4 ° c.에 버퍼를 냉각
- 알칼리 성 DNA-해제/전기 실행 버퍼에 대 한 해산 디 H2o. 쿨 4 ° c 버퍼에에서 알칼리 성 해결책 (0.3 M NaOH, 1 mM EDTA) 1 리터 PH를 확인 > 13.
- 도장된 혜성 슬라이드 유리 슬라이드에 0.5 %agarose 몇 방울을 놓습니다. 즉시, 다른 슬라이드의 평평한 표면에 사용 하 여, agarose 코팅의 얇은 층을 형성 하는 agarose 확산.
참고: 사용 하기 전에 슬라이드를 건조. - IPS 세포 배양에 대 한 간단히 문화 iPS 세포 지하실 막 매트릭스 코팅 ( 재료의 표참조) 문화 접시 mTESR1 문화 매체에 confluency에이 때까지.
참고: 인간 심장 섬유 아 세포 파생 iPS 세포는이 프로토콜에 사용 되었다. 프로그래밍의 iPS 세포 파생 문화 우리 연구 그룹12,13,21에서 최근 기사에 설명 되어 있습니다.
- 낮은 용 해 점 agarose 낮은 녹는 agarose의 500 mg 100 ml의 DNA-장소/물 RNA-무료. agarose를 녹이 고 때까지 전자 레인지에서 병을 열. 37 ° C 물 목욕까지 필요에 병을 배치 합니다.
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샘플 준비
- 문화 매체를 삭제 하 고 셀을 씻어. 해리 초연 솔루션을 사용 하 여 셀 ( 재료의 표참조). 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 셀 펠 릿을 세척 하 고 resuspend 1 x 105 셀/mL에 PBS에 셀.
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샘플 슬라이드 준비
참고: 자외선 빛 유도 하는 세포의 손상을 방지 하려면 낮은 조명 조건에서 다음 단계를 수행 합니다.- 세포 현 탁 액 및 agarose 솔루션의 90 μ의 믹스 10 μ (1시 10분 비율) 튜브에서. 장소는 37 ° C 물 목욕에서 튜브는 agarose 응고 하지 않도록.
- 공기 방울을 소개 하지 않고 솔루션을 혼합 하 고 플라스틱 도장된 혜성 슬라이드에 70 μ/자리. 피 펫 팁을 사용 하 여 얇은 레이어를 셀 agarose 혼합 확산. 15 분 동안 4 ° C에 슬라이드를 놓습니다.
- 컨테이너에 완전히 찬 세포의 용 해 버퍼에 슬라이드 잠수함. 1 시간에 4 ° C에서 어둠 속에서 컨테이너를 놓습니다.
- 냉 알칼리 성 해결책에 세포의 용 해 버퍼를 바꿉니다. 슬라이드는 완전히 빠져들 다는 것을 확인 하십시오. 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 컨테이너를 놓습니다.
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전기 이동 법
- 수평 전기 탱크에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드는 완전히 빠져들 때까지 차가운 알칼리 성 전기 이동 법 버퍼 탱크를 채우십시오. 15 ~ 30 분 1 V/cm에 전압을 적용 합니다.
참고: 총 전압 = x 1 V 전극 사이의 거리 - 컨테이너에 완전히 찬 디 H2o. 슬라이드 잠수함 2 분 후 디 h 조2O를 제거 하 고 신선한 디 H2o. 반복이이 단계를 추가 합니다.
- 찬 70% 에탄올과 디 h 조2O를 교체 합니다. 부드럽게 5 분을 기다려 제거 슬라이드, 기울기, 없고 그것은 건조.
- 건조 되 면, 각 자리를 희석된 DNA 염료의 100 μ를 추가 합니다. 실 온에서 15 분을 기다립니다. FITC 필터를 사용 하 여 epifluorescence 현미경에서, 샘플 당 총에서 50 ~ 100 혜성의 이미지를 가져가 라.
- 수평 전기 탱크에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드는 완전히 빠져들 때까지 차가운 알칼리 성 전기 이동 법 버퍼 탱크를 채우십시오. 15 ~ 30 분 1 V/cm에 전압을 적용 합니다.
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이미지 분석 및 결과의 계산
- 혜성, 점수는 국립 보건원의 (NIH) 사용 하 여 혜성 분석 결과 플러그인 ImageJ (ImageJ 여기 다운로드: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; 여기 플러그인 다운로드: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
참고: 플러그인 분석을 수행 하기 위해 모든 세부 정보를 포함 하는 PDF 명령을 함께 제공 됩니다. 또한, 혜성 분석의 스크린샷은 그림 2A-C에 표시 됩니다. 제어 및 독 소 루비 (Doxo)의 대표적인 혜성 이미지-대우 iPS 세포 및 혜성의 정량화 그림 3A-C에 나와 있습니다.
- 혜성, 점수는 국립 보건원의 (NIH) 사용 하 여 혜성 분석 결과 플러그인 ImageJ (ImageJ 여기 다운로드: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; 여기 플러그인 다운로드: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
2. DNA 손상 응답
- 샘플 및 시 약 준비
- IPS CM 세포 배양에 대 한 문화 iPS-CM 세포 지하실 막 매트릭스 코팅 ( 재료의 표참조)에 confluency에이 때까지 B-27 (CMM) 보충 RPMI 매체에 문화 접시.
참고: 인간 iPS 세포 유래 cardiomyocytes은이 프로토콜에서 사용 되었다. Cardiomyocytes에 iPS 세포 분화에 대 한 프로토콜은 우리의 연구 그룹12,13,21에서 최근 기사에서 찾을 수 있습니다. - IPS-CMs 챔버 슬라이드에 씨앗
- IPS-CM 우물에서 문화 매체를 버리십시오. 3 회 PBS로 세포 세척.
- 잘 당 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 37 ° C 5 분 표 셀 분리에 대 한 현미경 접시에서 품 어. CMM는 트립 신을 막으려고의 1 mL를 추가 합니다.
- 15 mL 튜브와 4 ° C와 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 세포 현 탁 액을 배치 합니다. 매체를 폐기, CMM의 1 mL를 추가 하 고 셀을 resuspend. 셀을 계산 하 고 20 x 105 셀 CMM의 1.6 mL를 셀 수를 조정 합니다.
- 씨 8 잘 챔버의 당 세포 현 탁 액의 200 µ L 슬라이드 ( 재료의 표참조). 부드럽게 잘 주위 세포를 확산 하 고 37 ° c.에 품 어 슬라이드를 누릅니다
- IPS-CM 독 소 루비 치료에 대 한 Ip CM 우물에서 문화 매체를 삭제 합니다. PBS로 세포 세척. 1 μ M 독 소 루비 셀 치료 4 헤 대 한 CMM 매체를 발음 하 고 PBS로 세포 세척.
- 블로킹 버퍼에 대 한 준비 10 mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션 3 %BSA 및 0.05%의 트라이 톤 X-100. 블로킹 버퍼의 10 mL를 준비 하려면 준비 BSA 솔루션의 9 mL를 정상 당나귀 혈 청 1 mL를 추가 합니다.
- 1 차적인 항 체 솔루션에 대 한 안티 토끼 인 히스톤 H2A의 1 μ를 추가 합니다. 블로킹 버퍼의 200 μ 항 체 (Ser139) X.
- 이차 항 체 믹스에 대 한 블로킹 버퍼의 200 μ에 형광 색소 활용 된 항 토끼 이차 항 체, DAPI, 및 형광 색소 활용 된 phalloidin의 각 1 μ를 추가 합니다.
- IPS CM 세포 배양에 대 한 문화 iPS-CM 세포 지하실 막 매트릭스 코팅 ( 재료의 표참조)에 confluency에이 때까지 B-27 (CMM) 보충 RPMI 매체에 문화 접시.
- Immunolabeling
- 3 회 PBS로 세포 세척 하 고 각 우물에 갓된 4 %paraformaldehyde (PFA)의 200 μ를 추가. 실 온에서 어둠 속에서 20 분에 대 한 셀을 수정 합니다. PBS로 세포 세척.
- PBS를 제거 하 고 실내 온도에 습도 챔버에 잘와 30 분에 대 한 블록 당 블로킹 버퍼의 200 μ를 추가. 블로킹 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 솔루션의 200 μ를 추가 합니다. 실내 온도, 습도 챔버에 45 분 동안 품 어. 다음, 세 번 PBS와 웰 스 워시.
- PBS를 제거 하 고 이차 항 체 혼합의 200 μ를 추가. 실내 온도, 습도 챔버에 45 분 동안 품 어. 다음, 세 번 PBS와 웰 스 워시. Antifade와 함께 그들을 장착 하기 전에 디 H2O 세척. coverglass 놓고 4 ° c.에 어둠 속에서 슬라이드 저장
- Epifluorescence 현미경을 사용 하 여, 샘플 당 임의의 필드의 3-5 이미지 그림 4A와 같이 고 이미지 분석을 진행.
- DDR foci의 계산
- 다운로드 및 설치 CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
- 참고: 이 연구에서 처리 하는 이미지는 CellProfiler 버전 2.1.1 사용 하 여 수행 되었다. 사용 된 CellProfiler에 대 한 자습서는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다 (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & 목록 = PL7CC87670239B4D10). CellProfiler의 최신 버전은 사용 되는 경우 파이프라인 부 적응이 필요할 수 있습니다.
- 파이프라인 punctae_gH2AX.cpipe를 다운로드 합니다. 선택 파일 > 가져오기 > 파이프라인 파일에서 punctae_gH2AX.cpipe를 선택 하 고.
- 분석 (그림 5A)에 대 한 입력 모듈/이미지 섹션에서 파일 목록 창에 γH2A.X foci의 인수 이미지가 포함 된 폴더 끌어서 놓습니다. 그림 5A-L와 같이 그런 다음 지침을 따르십시오.
- 이미지에 대 한 다음 매개 변수를 설정:
- 분석을 위해 원하는 이미지 파일 목록끌어다 놓습니다. 입력 모듈에서 이미지 를 선택 합니다 ( 그림 5A 모듈 설정 참조). 입력 모듈에서 메타 데이터 를 선택 합니다 ( 그림 5B 모듈 설정 참조). 입력 모듈에서 NamesAndTypes 를 선택 합니다 ( 그림 5C 모듈 설정 참조).
- 그룹선택 없음. 분석 모듈에서 ColorToGray 를 선택 합니다 ( 그림 5D 모듈 설정 참조).
- 분석 모듈에서 선택 부드러운 ( 그림 5E 모듈 설정 참조).
참고: 이 값은 이미지 해상도 따라 최적화 할 수 있습니다. - 분석 모듈에서 IdentifyPrimaryObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5 층 모듈 설정 참조).
참고: 이 값을 전체 핵 선택 되어 있는지 확인 최적화. 이 단계 후 컴퓨터 지연 될 수 있습니다. - 분석 모듈에서 선택 부드러운 ( 그림 5G 모듈 설정 참조).
참고: 이 값은 이미지 해상도 따라 최적화 할 수 있습니다. - 분석 모듈에서 EnhanceOrSuppressFeatures 를 선택 합니다 ( 그림 5 H 모듈 설정 참조).
- 분석 모듈에서 IdentifyPrimaryObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5I 모듈 설정 참조).
참고: 이 값은 punctae가 선택 되어 있는지 확인을 최적화 합니다. 이 단계 후 컴퓨터는 다시 지연 될 수 있습니다.- 분석 모듈에서 RelateObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5J 모듈 설정 참조). 분석 모듈에서 ClassifyObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5 K 모듈 설정 참조). 분석 모듈에서 ExportToSpreadsheet 를 선택 합니다 ( 그림 5 L 모듈 설정 참조).
- 이미지 분석을 수행 하려면 하단 왼쪽된 패널에서 이미지 분석 을 클릭 합니다. 분석의 성공적인 완료에 여러 이미지 생성 됩니다 (그림 6A-F).
참고: 사용자는 미래의 참고를 위해이 이미지를 저장 해야 합니다. - 생성 되 고 컴퓨터에 적절 한 위치에 저장 하는 추가 분석을 위해 정량 데이터를 포함 하는.csv 파일 note MyExpt_Image라는 스프레드시트에서 열 B와 D는 각각 5와 더 많은 punctae에는 핵의 수가 있을 것 이다. 핵의 총 수를 B 및 D 열을 추가 합니다.
- 단계 2.3.3-2.3.8 (모든 분석 하기 전에 MyExpt_ 파일 이름 변경) 모든 이미지를 반복 합니다. 그림 4C와 같이 DNA 무결성을 평가 하기 위한 음모를 만들 수 있습니다.
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Representative Results
인간 유도 만능 줄기 세포를 배양 하 고 DNA 무결성의 측정으로 사용 되었다, DNA 손상 및 꼬리 순간 혜성 분석 결과 의해 분석 되었다. iPS 세포는 낮은 녹는 점 agarose에 포함 되었고 유리 슬라이드에 배치. 셀, 다음, 세포의 용 해 버퍼, 이어서 supercoiled DNA를 알칼리 성 해결책으로 취급 됩니다. Nucleoids electrophoresed 했다 고 혜성 DNA 염료 (그림 1A-D)에 의해 시각화 했다. 혜성, 혜성 분석 결과 플러그인 (그림 2A-C)를 사용 하 여 ImageJ로 분석 되었다.
인간 iPS 세포 Doxo DNA 손상을 유도 하 고 긍정적인 컨트롤로 사용할 수로 치료 했다. Doxo 취급 및 nontreated iPS 세포에서 혜성의 대표적인 현미경 그림 3A에 표시 됩니다. DNA 손상의 기초 금액 iPS 세포, DNA 손상 및 꼬리 순간의 분수로 표시에서 발견 되었다. 그러나, 치료 향상으로 iPS 세포에서 DNA 손상 Doxo 예상 (그림 3BC). 이 혜성 분석 결과 DNA 무결성 체세포18,19 뿐만 아니라 pluripotent 줄기 세포21를 평가 하기 위해 사용 될 수 있다는 것을 보여줍니다.
갓 iPS cardiomyocytes (iPS-CMs), iPS-CMs 교양된 6 개월 (장시간된 문화 [PC]), 그리고 iPS-CMs Doxo 치료 대상이 됐다 γH2A.X immunolabeling에 대 한 차별. ΓH2A.X immunolabelling의 대표 현미경 (높은 배율) 그림 4A (낮은 배율) 및 그림 4B 에 표시 됩니다. ΓH2A.X foci (DDR foci)의 수 (punctae) 각 핵에는 정량, CellProfiler를 사용 하 여 사용자 지정 파이프라인 모듈 (그림 5A-L). ΓH2A.X에 대 한 긍정적인 셀의 비율 5 punctae 0으로 핵 및 10 개 이상의 punctae와 핵으로 분류 된다. 제어 iPS CM에서 세포의 90% 이상 핵, 당 미만 5 DDR foci 졌고 셀의 10% 미만의 총 핵 (그림 4C, 제어 [Ctrl]) 당 이상의 6 DDR foci 했다. iPS-CMs 6 개월 경작 덜 보다 핵, 당 미만 5 DDR foci 90% 셀 및 셀의 13% 이상의 총 핵 (그림 4C, PC), 당 이상의 6 DDR foci Doxo 취급 iPS-CM 보였다 레와 세포의 80% 보다 적은 반면 했다 핵, 당 5 DDR foci 보다 s 셀의 약 24%의 총 핵 (그림 4C, Doxo) 당 DDR foci 이상 했다. 이 데이터는 명확 하 게 장기 세포 배양 및 Doxo 치료 iPS CMs에 중요 한 DNA 손상 유도 및 세포 이식에 적합 하지 않습니다 보여줍니다.
그림 1: 혜성 분석 결과의 도식. (A) 믹스와 낮은 녹는 점 agarose 세포 현 탁 액 및 (B)는 유리 슬라이드에 배치. (C) 세포 세포의 용 해 버퍼, supercoiled DNA를 포함 하는 nucleoids를 알칼리 성 해결책 다음 그것을 취급. (D) Electrophorese DNA SYBR 녹색 DNA 염료를 사용 하 여 얼룩 및. 그대로 (왼쪽)와 (오른쪽, 혜성 모양) 손상 된 DNA의 회로도 (E) (F) DNA 손상 및 꼬리 순간의 일부를 계산 하기 위해 수식입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: DNA 손상 및 꼬리 순간 정량화 ImageJ 여. (A-C) 스크린샷의 ImageJ, 선택이 혜성 머리와 꼬리의 혜성 분석 플러그인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 독 소 루비 인간 iPS 세포에서 DNA 손상 유도. 독 소 루비 처리 (Doxo)에 혜성 분석 결과 사용 하 여 분석 nontreated (제어) iPS 세포 (A) DNA 손상. (B) DNA 손상의 분수 (n = 3) 및 (C) 꼬리 순간 (n = 63 혜성) 혜성 분석 결과 사용 하 여 계량. 독 소 루비, DNA intercalating 에이전트와 치료는 크게 iPS 세포에서 DNA 손상 및 꼬리 순간의 일부 증가. 데이터는 의미 ± SEM. *P < 0.05, 학생의 짝이 없는 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: DNA 손상 응답 iPS 파생 cardiomyocytes에. (A) DNA 손상 응답 마커 γH2A.X 독 소 루비 처리 (Doxo) 및 nontreated (제어) iPS cardiomyocytes 면역 형광으로 식별로 연장 iPS cardiomyocytes (PC) 문화. IPS에서 DNA 손상의 사이트에서 라벨 (B) 높은 배율 γH2A.X (녹색 punctae)의-CMs. (C) 정량화의 DDR foci, CellProfiler를 사용 하 여 사용자 지정 파이프라인 모듈 분석. 데이터는 의미 ± SD; n = 3 ~ 4. P < 0.05, 학생의 짝이 없는 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 자동 CellProfiler에 의해 DNA 손상 응답 분석. (A-L) 이미지, 자동된 식별 및 iPS에 γH2A.X punctae의 정량화를 가져오기에 대 한 지정 된 설정으로 CellProfiler의 스크린샷-CMs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 자동 CellProfiler에 의해 DNA 손상 응답 분석. (A-F) 데이터 이미지 이미지 분석의 완료에 CellProfiler에 의해 생성 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
DNA 무결성을 셀 무결성을 그렸다. 손상된 DNA와 세포 스트레스에 자주 하 고 결국 그들의 완전성을 잃고. 줄기와 줄기 세포 유래 세포 이식 목적으로 전파 되 고 되는 그들의 원하는 기능을 수행 하는 셀에 대 한 주은. 손상된 DNA와 세포 이식 셀8,20의 성능과 가난한 engraftment 속도 발생할 것 이다. 따라서, 세포 이식 전에 DNA 무결성 검사는 필요한 품질 관리 프로토콜입니다. 여기 우리 두 비용 효과적인 접근 방식, 즉는 혜성 분석 결과 및 γH2A.X 면역 형광 라벨, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포의 품질 평가를 설명 합니다.
세포 노화의 주요 원인 세포에서 DNA 손상의 축적 생각. 혜성 분석 결과 사용 하 여, 알 베이커 그 외 여러분 분석22젊고 노화 인간 피부 섬유 아 세포 DNA 손상. 이전에 우리가 그 이식 DNA 손상 없는 심장 나타났습니다 조상 세포 p53 유전자 변형 마우스에서 격리 engraftment 호스트 기관8의 속도 증가 했다. 최근, 우리 인간 iPS 세포21에서 DNA 손상 복구 메커니즘에서 p53 transactivation 도메인의 역할을 나타났습니다. 두 연구에서 우리는 모두 줄기 세포에 DNA 손상 평가 방법론 라벨 혜성 분석 결과 및 γH2A.X 면역 형광을 고용 했다. 이러한 두 방법 모두 비용 하 고 기본적인 실험실 장비와 함께 수행할 수 있습니다. 우리가 자주 경험 하는 성가신 중요 한 문제는 agarose는 피 펫과 튜브에 응고. 우리는 모든 튜브 및 팁 pipetting agarose 이전 prewarming에 의해이 문제를 극복. 혜성 시험 완료까지 최대 2 일 동안, 아래 4 h에 최적화 된 γH2A.X 면역 형광 라벨 절차를 완료할 수 있습니다.
인간 iPS 세포 배양 10% 이상의 DNA 손상, 혜성 분석 실험에 의해 측정 한 효율적으로 차별 하지 cardiomyocytes (데이터 표시 되지 않음)으로 생체 외에서. 혜성 분석 결과 줄기 세포에서 DNA 손상 평가에 동적 이다. 그러나, DNA 무결성 평가 iPS 파생 cardiomyocytes 같은 특정 셀에는 셀의 특성 분석 결과 혜성 여 성가신입니다. cardiomyocytes와 분, sarcomeric 단백질, 분 비 세포 외 기질 단백질 농축 됩니다. Supercoiled 있도록 이러한 복잡 한 구조를 변성 시키기 DNA와 그 재현성 의심 있습니다. 가장 중요 한 것은, 인간의 cardiomyocytes의 25% ~ 40%는 binucleated25, 그리고이 비율 iPS 파생 cardiomyocytes에 다릅니다. 세포 벽은 혜성 분석 결과에서 중단, 이후 DNA 손상 세포의 비율의 정확한 평가 불가능 합니다. 따라서, Ip-CMs의 경우 DNA 손상 평가에 γH2A.X 면역 형광 라벨 절차 혜성 분석 결과 대 한 단순한 대안 이다.
이러한 결과 및 이전 간행물에서 그에 우리의 그룹8,,2021에 의해 따라, 좋습니다, 10% 이상의 경우 DNA 손상, 혜성 분석 결과, 또는 세포의 90% 미만 의해 평가 5 개의 DDR 0 포커스, 다음 문화 세포 이식에 대 한 실격 한다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 보조금 RO1-HL-99507에 의해 부분적으로 지원 HL-114120, HL-131017, HL138023, 및 UO1-HL-134764 (하 제이 장)와 미국 심장 협회 과학적인 개발 그랜트 17SDG33670677 (R. Kannappan)에 의해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
