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Genetics

Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58971
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de uma instalação experimental para uma análise da avaliação da integridade do DNA em células antes do transplante de células-tronco.

Abstract

Tronco e células tronco-células-derivadas têm imenso potencial como uma terapia regenerativa para várias doenças degenerativas. DNA é o armazém de dados genéticos em todas as células, incluindo células-tronco, e sua integridade é fundamental para a sua capacidade de regeneração. Células-tronco passam por propagação rápida em laboratórios para alcançar os números necessários para transplante. Crescimento acelerado celular leva à perda da integridade do DNA por metabólitos acumulados, como reativas de oxigênio, carbonila e agentes alquilantes. Estas células de transplantação resultaria em enxertia pobre e regeneração do órgão se deteriorando. Além disso, transplante de células de DNA danificado leva a mutações, instabilidade do DNA, senescência celular e possivelmente, fatais doenças como o câncer. Portanto, há uma necessidade imediata de um método de controle de qualidade avaliar a adequação da célula para transplante. Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a avaliação da integridade da DNA de células antes do transplante de células-tronco.

Introduction

Evidências experimentais e clínicas demonstra que o transplante de células moderadamente pode melhorar o desempenho contrátil do ventrículo esquerdo de falhando corações1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Avanços recentes abriram ainda mais atraentes oportunidades de regeneração cardiovascular; Estes incluem a expressão forçada de reprogramação fatores em células somáticas para induzir a pluripotência e diferenciar essas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) em diferentes linhagens cardíacas, importante casos (CM)10, 11 , 12 , 13. o material hereditário em todas as células, incluindo os artificialmente gerado iPSCs e derivado de iPSC CM (iPS-CM), é DNA. Instruções genéticas armazenadas no DNA dita o crescimento, desenvolvimento e função de células, tecidos, órgãos e organismos. DNA não é inerte; metabólitos, tais como reativas de oxigênio, carbonila e espécies de nitrogênio, de células e agentes alquilantes pode DNA causa danos in vitro e in vivo14,15,16,17. Importante, o dano ao DNA ocorre intuitivamente em cada célula, com uma frequência significativa. Se esses danos não são corrigidos, conduzirá a mutação de DNA, senescência celular, a perda da integridade do DNA e células e possivelmente, doenças, incluindo câncer fatal. Portanto, mantendo a integridade do DNA é essencial para qualquer célula, especialmente iPSCs, que tem um enorme potencial na clínica.

Para avaliar a quantidade e a integridade do DNA genômico de isolados, equipamento caro está disponível no mercado. No entanto, não há nenhum método simples e econômico para avaliar a integridade do DNA nas células sem isolar as células. Além disso, degradação de DNA induzida pelo usuário durante o isolamento do DNA é uma das principais desvantagens em usar esses métodos. O gel de célula única eletroforese (conhecido como ensaio cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 técnicas é abordagens fundamentais em laboratórios de pesquisa para avaliar o dano do ADN. Esses dois métodos não exigem equipamentos caros ou DNA genômico isolado para analisar DNA integridade8,20,21. Desde então, estas técnicas têm sido realizadas com células toda; degradação de DNA/RNA/proteína induzida pelo usuário durante a preparação da amostra não afetará a esses protocolos. Aqui, para avaliar os danos ao DNA e resposta de dano do ADN no tronco e células tronco-células-derivadas, nós fornecemos protocolos passo a passo para executar tanto o cometa do ensaio e γH2A.X immunolabeling. Além disso, combinando essas duas abordagens, propomos uma avaliação ingênua que pode ser usada para avaliar a adequação da célula para transplante.

O ensaio cometa, ou célula única electroforese do gel, mede as quebras de DNA nas células. Incorporado em agarose de baixo ponto de fusão de células lysed para nucleoids de formulário contendo DNA supercoiled. Após eletroforese, pequenos pedaços de DNA fragmentado e fios quebrados de DNA migram através dos poros de agarose, Considerando que o DNA intacto, devido ao seu enorme tamanho e sua conjugação com a proteína da matriz, terá uma migração restrita. O padrão de DNA manchada sob um microscópio de fluorescência imita um cometa. A cabeça do cometa contém DNA intacto e a cauda é composta de fragmentos de quebrar cadeias de ADN. A fração de dano do ADN pode ser medida pela intensidade da fluorescência do DNA danificado (cauda de cometa) em relação a intensidade de (cabeça de cometa) de DNA intacta. O momento de cauda do parâmetro pode ser calculado como mostrado na Figura 1.

Danos ao DNA induz a fosforilação de histona H2A. X (γH2A.X) no Ser139 por quinases ATM, ATR e DNA-PK. A fosforilação e o recrutamento da H2A. X em quebras da cadeia de ADN é chamada de resposta de dano de DNA (DDR) e acontece rapidamente depois que o DNA é danificado. Após este processo, detenção de ciclo de celular mediada por ponto de verificação e DNA são iniciados os processos de reparação. Após a conclusão bem-sucedida de reparação do ADN, γH2A.X é dephosphorylated e inativado por fosfatases. Prolongada e múltiplas quebras DNA levam ao acúmulo de focos γH2A.X no DNA. Isto indica a incapacidade da célula para reparar os danos do DNA e a perda da integridade do DNA. Estes focos γH2A.X no DNA podem ser identificados por... e o número de focos DDR pode ser contado usando o protocolo na secção 2.

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Protocol

1. ensaio cometa

  1. Preparação do reagente
    1. Para agarose de baixo ponto de fusão, coloque 500 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 100 mL de DNA - RNA-livre água /. Aqueça a garrafa em um forno de microondas, até que se dissolva a agarose. Coloque o frasco num banho de água de 37 ° C até que seja necessário.
      Nota: Para ler mais, consulte Azqueta et al, que estudou os efeitos da concentração de agarose no tempo DNA-desenrolar e vários fatores de electroforese23.
    2. Dilua o corante SYBR green DNA em tampão Tris-EDTA (TE) na proporção de 1:10,000 para obter um 1 x solução de tintura estoque de trabalho. Esta tintura é sensível à luz, então armazená-lo em um lugar escuro.
    3. Para a lise celular, dissolver 100 mL de tampão de lise (2,5 M NaCl, EDTA 0,1 M, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) em água deionizada (DI H2O). Em seguida, adicione 10 M NaOH para ajustar o pH a 10.0. Legal o buffer de 4 ° C.
    4. Para o buffer de execução DNA-desenrolar/eletroforese alcalino, dissolver 1 L de solução alcalina (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) em DI H2Cool O. o buffer de 4 ° C. Certifique-se o pH > 13.
    5. Para slides cometa pré-revestidos, coloque algumas gotas de 0,5% de agarose sobre uma lâmina de vidro. Imediatamente, usando a superfície plana de outro slide, espalhe o agarose para formar uma fina camada de revestimento de agarose.
      Nota: Seca as lâminas antes de usar.
    6. Para cultura de células iPS, brevemente as células iPS de cultura no porão-membrana-matriz-revestido (ver Tabela de materiais) cultura placas em meio de cultura de mTESR1 até confluência é alcançada.
      Nota: Células iPS de humanos-cardíaco fibroblasto-derivados foram utilizadas no presente protocolo. A reprogramação de derivação de células iPS e as condições de cultura é descrita em artigos recentes de nossa pesquisa grupo12,13,21.
  2. Preparação da amostra
    1. Descartar o meio de cultura e lavar as células. Dissociar as células usando a solução de destacamento (ver Tabela de materiais). Lave o centrifugado com tampão fosfato salino (PBS) e ressuspender as células em PBS a 1 x 105 células/mL.
  3. Preparação da amostra slide
    Nota: Execute as seguintes etapas sob condições de pouca luz, para evitar danos nas células ultravioleta luz-induzida.
    1. Mix 10 μL da suspensão de células e 90 μL de solução de agarose (01:10 proporção) em um tubo. Coloca o tubo em um banho de água de 37 ° C para evitar que a agarose solidificar.
    2. Misturar as soluções sem a introdução de bolhas de ar e pipetar 70 μL/spot para o slide pré-revestido cometa. Utilizando uma pipeta de ponta, espalhe a mistura de agarose de célula para formar uma camada fina. Coloque o slide em 4 ° C por 15 min.
    3. Em um recipiente, mergulhe completamente o slide em tampão de Lise fria. Coloque o recipiente no escuro a 4 ° C, durante 1 h.
    4. Substitua o tampão de Lise fria solução alcalina. Assegure-se de que os slides estão completamente submersos. Coloque o recipiente no escuro a 4 ° C por 30 min.
  4. Eletroforese
    1. Coloque o slide em um tanque de eletroforese horizontal. Encha o depósito com tampão de eletroforese alcalina frio até que as lâminas estão completamente submersos. Aplica tensão a 1 V/cm por 15 a 30 min.
      Nota: Total de tensão = distância entre os eletrodos x 1 V
    2. Em um recipiente, mergulhe completamente o slide no frio DI H2O. Depois de 2 min, retire o DI H2O e adicione fresco DI H2O. repetir este passo.
    3. Substitua o DI H2O frio etanol a 70%. Espere 5 min. gentilmente remover o slide, não incliná-lo e deixá-lo secar ao ar livre.
    4. Uma vez seco, adicione 100 μL de tintura diluída do DNA para cada local. Espere 15 min à temperatura ambiente. Usando um filtro FITC em um microscópio de epifluorescência, com imagens de cometas de 50 a 100 no total por amostra.
  5. Análise de imagem e cálculo dos resultados
    1. Para marcar os cometas, usar o National Institutes of Health (NIH) ImageJ com plugin do ensaio cometa (download ImageJ aqui: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; Baixe o plugin aqui: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      Nota: O plugin vem com uma instrução de PDF que contém todos os detalhes para realizar a análise. Além disso, screenshots da análise cometa são mostrados na Figura 2A-C. Imagens do cometa representativa de controle e doxorrubicina (Doxo)-células iPS tratados e a quantificação dos cometas são mostrados na Figura 3A-C.

2. resposta de dano de DNA

  1. Preparação de amostra e reagente
    1. Para uma cultura de células iPS-CM, cultura iPS-CM pilhas no porão-membrana-matriz-revestido (ver Tabela de materiais) placas de cultura em RPMI suplementado com B-27 (CMM) até confluência é alcançada.
      Nota: Humanos-iPS-derivado de células cardiomyocytes foram utilizados no presente protocolo. O protocolo para a diferenciação de células iPS em cardiomyocytes pode ser encontrado em artigos recentes de nossa pesquisa grupo12,13,21.
    2. Semente de iPS-CMs em slides de câmara.
      1. Descarte o meio de cultura de poços de iPS-CM. Lave as células três vezes com PBS.
      2. Adicione 1 mL de tripsina 0,25% por bem e incubar a 37 ° C por 5 min. verificar a placa sob um microscópio para o destacamento de célula. Adicione 1 mL de CMM para parar a tripsina.
      3. Coloque a suspensão de células em um tubo de 15 mL e centrifugar por 5 min a 4 ° C e 200 x g. Descartar o meio, adicionar 1 mL de CMM e ressuspender as células. Contar as células e ajustar a contagem de células para obter células de 20 x 105 em 1,6 mL de CMM.
      4. Semente de 200 µ l de suspensão de células por poço da câmara 8 poços deslize (ver Tabela de materiais). Toque o deslize suavemente para espalhar as células ao redor do poço e incubar a 37 ° C.
    3. Para o tratamento de doxorrubicina iPS-CM, descarte o meio de cultura de poços de iPS-CM. Lave as células com PBS. Tratar as células com 1 doxorrubicina μM e CMM para 4 h. Aspire o meio e lavar as células com PBS.
    4. Para o tampão de bloqueio, prepare-se 10 mL da solução de albumina de soro bovino (BSA) contendo 3% de BSA e 0,05% Triton X-100. Para preparar 10 mL de tampão de bloqueio, adicione 1 mL de soro normal burro para 9 mL da solução preparada de BSA.
    5. Para a solução de anticorpo primário, adicione 1 μL de antifosfo coelho-histona H2A. X (Ser139) anticorpo para 200 μL de tampão de bloqueio.
    6. Para a mistura de anticorpo secundário, adicione 1 μL de conjugados a fluorocromo coelho anti anticorpo secundário, DAPI e conjugados a fluorocromo faloidina para 200 μL de tampão de bloqueio.
  2. Immunolabeling
    1. Lavar as células três vezes com PBS e adicionar 200 μL de acabadas paraformaldeído 4% (PFA) em cada poço. Conserte as células por 20 min no escuro à temperatura ambiente. Lave as células com PBS.
    2. Remover a PBS e adicionar 200 μL de tampão de bloqueio por poço e bloco por 30 min em uma câmara humidificada à temperatura ambiente. Retire o tampão de bloqueio e adicionar 200 μL de solução de anticorpo primário. Incube durante 45 min em uma câmara escura, umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços três vezes com PBS.
    3. Remova a PBS e adicione 200 μL de mistura de anticorpo secundário. Incube durante 45 min em uma câmara escura, umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços três vezes com PBS. Lavar com DI H2O, antes de montá-los com Media. Coloque uma lamela e armazenar os slides no escuro a 4 ° C.
    4. Usando um microscópio de epifluorescência, tomar três a cinco imagens de campos aleatórios por amostra, como indicado na Figura 4Ae proceder à análise de imagem.
  3. Contagem dos focos da DDR
    1. Baixe e instale CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
    2. Nota: Imagem de processamento neste estudo foi realizada usando CellProfiler versão 2.1.1. Tutoriais para CellProfiler que foram usados podem ser encontrados em outro lugar (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & lista = PL7CC87670239B4D10). Se uma versão mais recente de CellProfiler está sendo usada, o gasoduto pode exigir adaptações menores.
    3. Baixe o oleoduto punctae_gH2AX.cpipe. Selecione arquivo > importar > Pipeline do arquivo e escolha punctae_gH2AX.cpipe.
    4. Arrastar e soltar a pasta que contém as imagens adquiridas de focos γH2A.X para a janela de lista de arquivo na seção de Módulos de entrada/imagens para análise (Figura 5A). Siga as instruções, como mostrado na Figura 5A-L.
    5. Defina os seguintes parâmetros para as imagens:
      1. Arraste a imagem desejada para a análise da lista de arquivos. Em módulos de entrada, selecione imagens (ver Figura 5A para configurações do módulo). Em módulos de entrada, selecione metadados (ver Figura 5B para configurações do módulo). Em módulos de entrada, selecione NamesAndTypes (consulte a Figura 5 para as configurações do módulo).
      2. Para grupos, selecione nenhum. Em módulos de análise, selecione ColorToGray (consulte a Figura 5 para as configurações do módulo).
    6. Em módulos de análise, selecione suave (ver Figura 5E para configurações do módulo).
      Nota: Esse valor pode precisar de ser otimizado, dependendo da resolução da imagem.
    7. Em módulos de análise, selecione IdentifyPrimaryObjects (ver Figura 5F para configurações do módulo).
      Nota: Otimize esses valores para certificar-se que o núcleo inteiro é selecionado. Após esta etapa, o computador pode ficar.
    8. Em módulos de análise, selecione suave (consulte a Figura 5 para as configurações do módulo).
      Nota: Esse valor pode precisar de ser otimizado, dependendo da resolução da imagem.
    9. Em módulos de análise, selecione EnhanceOrSuppressFeatures (consulte a Figura 5 H para as configurações do módulo).
    10. Em módulos de análise, selecione IdentifyPrimaryObjects (ver Figura 5I para configurações do módulo).
      Nota: Otimize esses valores para certificar-se de que os punctae são selecionados. Após esta etapa, o computador pode lag novamente.
      1. Em módulos de análise, selecione RelateObjects (ver Figura 5J para configurações do módulo). Em módulos de análise, selecione ClassifyObjects (consulte a Figura 5 K para as configurações do módulo). Em módulos de análise, selecione ExportToSpreadsheet (consulte a Figura 5 L para as configurações do módulo).
      2. Clique em Analisar imagens no painel inferior esquerdo para realizar a análise de imagem. Após a conclusão bem sucedida da análise, várias imagens são geradas (Figura 6A-F).
        Nota: Os usuários devem salvar essas imagens para referência futura.
      3. Observação o arquivo CSV que contém os dados quantitativos para uma análise mais adicional que é gerado e salvo no local apropriado no computador. Na planilha chamada MyExpt_Image, colunas B e D terá o número de núcleos que têm até cinco e mais punctae, respectivamente. Adicione colunas B e D para obter o número total de núcleos.
    11. Repita a etapa 2.3.3 - 2.3.8 para todas as imagens (mudar o nome do arquivo MyExpt_ antes de cada análise). Parcelas podem ser feitas para avaliar a integridade do DNA, como mostrado na Figura 4.

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Representative Results

Células-tronco pluripotentes induzidas humanas foram cultivadas, e os danos do DNA e o momento de cauda, que eram usados como uma medida de integridade do DNA, foram analisados por meio de ensaio cometa. células iPS foram incorporadas em agarose de baixo ponto de fusão e colocadas em uma lâmina de vidro. As células foram, em seguida, tratadas com tampão de Lise, seguido por uma solução alcalina, para obter o DNA supercoiled. Nucleoids foram electrophoresed e cometas foram visualizados pelo corante de DNA (figura 1A-D). Os cometas foram, então, analisados com ImageJ, usando o plugin do ensaio cometa (Fig. 2A-C).

Células iPS de humanos foram tratadas com Doxo para induzir dano do ADN e para ser usado como controle positivo. Micrografias representativas de cometas de células iPS Doxo-tratados e folhas são mostradas na Figura 3A. Verificou-se uma quantidade basal de dano do ADN em células iPS, expressadas como uma fração do momento de cauda e danos do DNA. No entanto, o Doxo tratamento aumenta o dano de DNA em células iPS como esperado (Figura 3BC). Isso mostra que o ensaio cometa pode ser usado para avaliar a integridade do DNA não só em células somáticas18,19 , mas também no de células-tronco pluripotentes21.

Recém diferenciadas iPS cardiomyocytes (iPS-CMs), cultivadas por 6 meses (cultura prolongada [PC]) e tratados com Doxo iPS-CMs foram submetidos a γH2A.X immunolabeling iPS-CMs. Micrografias representativas de γH2A.X encontrava são mostradas na Figura 4A (baixa ampliação) e Figura 4B (ampliação maior). O número de focos γH2A.X (focos DDR) (punctae) em cada núcleo são quantificados, usando CellProfiler com módulos de pipeline personalizado (Figura 5A-L). A porcentagem de células que são positivos para γH2A.X são classificados em núcleos com zero a cinco punctae e núcleos com mais de 10 punctae. No controle iPS-CM, mais de 90% das células tinha menos de cinco focos DDR por núcleos, e um total de menos de 10% das células tinha mais de seis focos DDR por núcleos (Figura 4, controle [Ctrl]). iPS-CMs cultivadas por 6 meses tinham menos de 90% de células com menos de cinco focos DDR por núcleos e um total de mais de 13% das células tinham mais de seis focos DDR por núcleos (Figura 4, PC), Considerando que o iPS-CM Doxo-Tratado mostrou menos de 80% das células com les s do que cinco focos DDR por núcleos e um total de cerca de 24% das células tinham mais de seis focos DDR por núcleos (Figura 4, Doxo). Este dados claramente mostram que cultura celular prolongada e Doxo tratamento induzem danos significativos do DNA no iPS-CMs e não são adequados para o transplante de células.

Figure 1
Figura 1: esquemático do ensaio cometa. (A) mistura a suspensão de células com agarose de baixo ponto de fusão e (B) Coloque-o sobre uma lâmina de vidro. (C) tratar com tampão de lise celular, seguido de uma solução alcalina, para obter nucleoids contendo DNA supercoiled. (D) Electrophorese e manchar o DNA usando corante SYBR green DNA. (E) esquema de intacta (esquerda) e DNA danificado (direito, forma de cometa). (F) a fórmula para calcular uma fração do momento de cauda e danos do DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: quantificação de momento danos e cauda DNA pelo ImageJ. (-C) Screenshots do ImageJ, com o plugin de análise cometa mostrando uma seleção da cabeça do cometa e da cauda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: doxorrubicina induz dano de DNA em células iPS humana. (A) DNA danos em tratados com doxorrubicina (Doxo) e células iPS de folhas (controle), analisadas usando o ensaio cometa. (B) fração de dano do ADN (n = 3) e (C) momento de cauda (n = 63 cometas) quantificados usando o ensaio cometa. Tratamento com doxorrubicina, um agente intercalante de DNA, aumentou significativamente a fração do momento de cauda e dano de DNA em células iPS. Dados são meios ± SEM. *P < 0.05, estudante está pareado t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: resposta de dano de DNA em iPS-derivado cardiomyocytes. Marcador de resposta de dano (A) DNA γH2A.X identificado por imunofluorescência em tratados com doxorrubicina (Doxo) e folhas (controle) iPS-cardiomyocytes, bem como uma prolongada cultura iPS-cardiomyocytes (PC). (B) maior ampliação de γH2A.X (punctae verde) rotulagem aos sítios de dano do ADN no iPS-focos CMs. (C) quantificação de DDR, analisados usando CellProfiler com módulos de pipeline personalizado. Dados são meios ± SD; n = 3 a 4. P < 0.05, estudante está pareado t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: análise de resposta de danos de DNA por CellProfiler automatizada. (-L) Screenshots de CellProfiler com configurações especificadas para importar as imagens e o automatizado identificação e quantificação de γH2A.X punctae no iPS-CMs. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: análise de resposta de danos de DNA por CellProfiler automatizada. (-F) Imagens de dados geradas pelo CellProfiler após a conclusão da análise de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Integridade do DNA retrata a integridade celular. Células com DNA danificado são frequentemente em stress e eventualmente perdem sua integridade. A integridade do tronco e células tronco-derivado de células que estão sendo propagadas para fins de transplante é principal para as células executar sua função pretendida. Transplante de células com DNA danificado resultaria em uma taxa de enxertia pobre e desempenho da célula8,20. Por conseguinte, examinar a integridade do DNA antes do transplante de células é um protocolo de controle de qualidade necessário. Aqui descrevemos duas abordagens econômicas, ou seja o cometa ensaio e γH2A.X imunofluorescência rotulagem, para avaliar os danos ao DNA e qualidade do tronco e células tronco-células-derivadas.

Das principais causas do envelhecimento celular é pensada para ser o acúmulo de dano do ADN nas células. Usando o ensaio cometa, Al-Baker et al analisou o dano de DNA em jovens e senescentes fibroblastos dérmicos humanos22. Anteriormente, nós mostramos que transplante cardíaco de livre de danos de DNA células progenitoras isoladas de um rato transgénico p53 aumentaram a taxa de enxertia no anfitrião órgão8. Recentemente, mostramos o papel do domínio do transactivation do p53 em mecanismos de reparação de dano de DNA em células de iPS humana21. Em ambos os estudos, nós empregamos ambos imunofluorescência de ensaio e γH2A.X o cometa rotulagem metodologias para avaliar os danos do DNA em células-tronco. Ambos estes métodos são cost-effective e podem ser executados com equipamentos básicos de laboratório. Um problema crítico chato que experimentamos muitas vezes é agarose solidificando na pipeta e tubos. Podemos superar esse problema por prewarming todos os tubos e dicas antes da pipetagem agarose. Enquanto o ensaio cometa leva até 2 dias para completar, o procedimento otimizado de rotulagem de imunofluorescência em γH2A.X pode ser concluído em menos de 4h.

Culturas de células iPS de humanos com mais de 10% dano do ADN, medido pelo ensaio cometa, não eficientemente se diferenciam em cardiomyocytes (dados não mostrados) em vitro. O ensaio cometa é sensível e dinâmica na avaliação de danos no DNA em células-tronco. No entanto, as avaliações de integridade de DNA em determinadas células, como iPS-derivado cardiomyocytes, são pesadas por ensaio cometa devido à natureza das células. Os cardiomyocytes são enriquecidos com troponina, proteínas sarcomero e as proteínas de matriz extracelular secretado. Desnaturação dessas estruturas complexas tornar supercoiled DNA e sua reprodutibilidade são questionáveis. Mais importante ainda, 25% a 40% dos cardiomyocytes humana são binucleated25, e estas percentagens variam em iPS-derivado cardiomyocytes. Desde que a parede celular é interrompida no ensaio cometa, a avaliação precisa da percentagem de células com DNA danificado é impossível. Portanto, no caso de iPS-CMs, o procedimento de rotulagem de imunofluorescência γH2A.X para avaliar os danos do DNA é uma alternativa simplista para o ensaio cometa.

Baseado nestes resultados e aqueles de publicações anteriores por nosso grupo8,20,21, sugerimos que, se há mais de 10% dano do ADN, avaliado pelo ensaio cometa, ou menos de 90% das células têm de zero a cinco DDR focos e, em seguida, a cultura deve ser desclassificado para transplante de células.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional do coração, pulmão e sangue Instituto bolsas RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (para J. Zhang) e pela American coração Associação científica desenvolvimento Grant 17SDG33670677 (a. R. Kannappan).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		 Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

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