Summary
Здесь мы предоставляем подробное описание экспериментальной установки для анализа оценки целостности ДНК в стволовых клеток до трансплантации клеток.
Abstract
Стебель и стволовых клеток, полученных клетки имеют огромный потенциал как регенеративной терапии для различных дегенеративных заболеваний. ДНК является склад генетических данных во всех клетках, в том числе стволовых клеток, и ее целостность имеет основополагающее значение для его регенеративные способности. Стволовые клетки претерпевают быстрое распространение в лабораториях для достижения необходимого числа для трансплантации. Ускоренное клеточный рост приводит к потере целостности ДНК накопленных метаболитов, таких как кислорода, карбонил и алкилирующие агенты. Пересадка эти клетки приведет к плохой приживления и регенерации органов ухудшение. Кроме того, пересадке ДНК поврежденных клеток приводит к мутации, нестабильность ДНК и клеточного старения и возможно, угрожающих жизни заболеваний, как рак. Таким образом существует настоятельная необходимость для метода контроля качества для оценки пригодности клеток для трансплантации. Здесь мы предоставляем пошаговые протоколы для оценки целостности ДНК стволовых клеток до трансплантации клеток.
Introduction
Экспериментальные и клинические данные показывают, что трансплантация клеток умеренно может улучшить левого желудочка сократительной производительность при отсутствии сердца1,2,3,4,5 ,6,,78,9. Последние достижения открыли дальнейшего обжалования возможности для сердечно-сосудистой системы регенерации; к ним относятся принудительный выражение перепрограммирования факторов в соматических клетках побудить плюрипотентности и дифференцировать эти индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) в различных линий сердца, главное cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. Наследственный материал в каждой ячейке, включая искусственно созданные iPSCs и iPSC производные см (iPS см), является ДНК. Генетические инструкции, хранящиеся в ДНК диктует рост, развитие и функции клеток, тканей, органов и организмов. ДНК не является инертным; Мобильный метаболитов, таких как карбонильных кислорода и азота, и алкилирующие агенты могут причина ДНК повреждения в vitro и in vivo в14,,1516,17. Важно отметить, что повреждение ДНК интуитивно происходит в каждой клетке, с частотой значительный. Если эти убытки не исправить, это приведет к мутации ДНК, сотовой старение, потеря целостности ДНК и ячеек, и возможно, заболеваний, включая раковые заболевания, угрожающие жизни. Таким образом сохраняя целостность ДНК имеет важное значение для любой ячейки, особенно iPSCs, которая имеет огромный потенциал в клинике.
Для оценки количества и целостности изолированных геномной ДНК, дорогое оборудование доступны на рынке. Однако не существует простых и экономически эффективных методов для оценки целостности ДНК в клетках без изоляции клеток. Кроме того пользователь ДНК-деградации во время изоляции ДНК является одним из основных недостатков в использовании этих методов. Одноклеточных гель электрофореза (известный как комета пробирного)18,19 и γH2A.X immunolabeling8 методы являются фундаментальные подходы в исследовательских лабораториях для оценки повреждения ДНК. Эти два метода не требуется дорогостоящее оборудование или изолированные геномной ДНК для анализа ДНК целостности8,,2021. Поскольку эти методы были выполнены с всей клетки; пользователя индуцированной деградации ДНК/РНК/белков во время подготовки пробы не будет затрагивать эти протоколы. Здесь чтобы оценить повреждение ДНК и ДНК повреждения ответ в стволовых и стволовых клеток, полученных клеток, мы предоставляем пошаговые протоколы для выполнения как комета пробирного и γH2A.X immunolabeling. Кроме того сочетание этих двух подходов, мы предлагаем наивно оценки, которая может использоваться для оценки пригодности клеток для трансплантации.
Комета пробирного, или одну ячейку электрофорез геля, измеряет разрывы ДНК в клетках. Клетки, встроенные в легкоплавких агарозы лизированы в форме нуклеоидах, содержащих supercoiled ДНК. После электрофореза небольшие кусочки фрагментированных ДНК и сломанной нити ДНК мигрируют через агарозы поры, тогда как нетронутыми ДНК, из-за их огромного размера и конъюгирования их с белками матрицы, будет иметь ограничения миграции. Шаблон окрашенных ДНК под микроскопом флуоресценции имитирует кометы. Голова кометы содержит нетронутыми ДНК и хвост состоит из фрагментов и сломанной нити ДНК. Фракция повреждения ДНК может измеряться по интенсивности флуоресценции поврежденной ДНК (хвост кометы) относительно неизменной интенсивности (голова кометы) ДНК. Данный параметр хвост момент может быть рассчитана, как показано на рисунке 1.
Повреждение ДНК вызывает фосфорилирование гистона Н2А. X (γH2A.X) в Ser139, ATM, ATR и ДНК-PK киназы. Фосфорилирование и вербовка Н2А. X на разрывы ДНК пряди называется ДНК повреждения ответ (РДР) и быстро происходит после повреждения ДНК. Этот процесс, КПП опосредованной клеточного цикла ареста и ДНК инициировал ремонт процессы. После успешного завершения восстановления ДНК γH2A.X dephosphorylated и инактивированных фосфатаз. Длительные и несколько разрывы ДНК пряди приводят к накоплению очагов γH2A.X в ДНК. Это указывает на неспособность ячейки для ремонта повреждений ДНК и потеря целостности ДНК. Эти очаги γH2A.X в ДНК может быть идентифицирован и количество DDR очагов могут быть подсчитаны с использованием протокола в разделе 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. комета Assay
-
Подготовка реагента
- Температура плавления агарозы место легкоплавких агарозы 500 мг в 100 мл ДНК- / РНК свободной воды. Нагрейте бутылку в микроволновой печи до тех пор, пока агарозы растворяет. Поместите бутылку в ванну воды 37 ° C до тех пор, пока требуется.
Примечание: Для дальнейшего чтения, см. аскета et al., который изучал эффекты агарозы концентрации на время ДНК Размотка и несколько факторов электрофорез23. - Разбавьте ДНК SYBR зеленый краситель в буфер Tris-ЭДТА (TE) в соотношении мэм для получения 1 x работает раствор красителя запасов. Этот краситель чувствителен к свету, так что хранить в темном месте.
- Для буфера lysis клетки, растворяют в 100 мл буфера lysis (2,5 М NaCl, 0,1 М ЭДТА, 10 мм трис, 1% тритон X-100) в деионизированной воде (ди H2O). Затем добавьте 10 M NaOH для регулировки рН до 10,0. Прохладный буфера до 4 ° C.
- Для щелочных идущий буфер ДНК размотки/электрофореза растворяют в 1 Л раствора (0,3 М NaOH, 1 мм ЭДТА) в ди H2O. Cool буфера до 4 ° C. Убедитесь, что рН > 13.
- Для ветротурбин комета слайды место несколько капель 0,5% агарозном на стеклянное скольжение. Сразу же используя плоскую поверхность другой слайд, распространение агарозы для формирования тонкого слоя агарозы покрытия.
Примечание: Сухие слайды перед использованием. - Кратко для iPS клеточной культуры, культуры клеток iPS в подвал мембрана матрица покрытием (см. Таблицу материалы) культуры пластин в mTESR1 питательной среды вплоть до confluency.
Примечание: Клетки человека сердца фибробластов производные iPS использовались в настоящем Протоколе. Перепрограммирование Дифференцирование клетки iPS и культуры условий описано в последних статей с нашей исследовательской группы12,13,21.
- Температура плавления агарозы место легкоплавких агарозы 500 мг в 100 мл ДНК- / РНК свободной воды. Нагрейте бутылку в микроволновой печи до тех пор, пока агарозы растворяет. Поместите бутылку в ванну воды 37 ° C до тех пор, пока требуется.
-
Подготовка образца
- Отказаться от питательной среды и вымыть клетки. Разбить ячейки с помощью отряда решения (см. Таблицу материалы). Помыть лепешка ячейки с фосфат амортизированное saline (PBS) и Ресуспензируйте клетки в PBS в 1 х 105 кл/мл.
-
Подготовка образца слайдов
Примечание: Выполните следующие действия в условиях низкой освещенности во избежание повреждения УФ свет индуцированной клеток.- Смесь 10 мкл суспензии клеток и 90 мкл раствора агарозы (1:10 соотношении) в трубу. Место трубку в ванну воды 37 ° C, чтобы предотвратить застывающих агарозы.
- Смешать решения без введения воздушные пузыри и Пипетка 70 мкл/спот на слайд ветротурбин кометы. С помощью кончика пипетки, распространение смесь агарозы клеток сформировать тонким слоем. Место в слайд 4 ° C на 15 мин.
- В контейнере полностью погрузите слайд в холодной литического буфера. Поместите контейнер в темноте при температуре 4 ° C за 1 ч.
- Замените буфера lysis холодной щелочной раствор. Убедитесь, что слайды полностью погружены. Поместите контейнер в темноте при температуре 4 ° C за 30 мин.
-
Электрофорез
- Место слайда в бак горизонтального электрофореза. Заполните резервуар холодной щелочной электрофорез буфера до тех пор, пока слайды полностью погружены. Примените напряжение на 1 V/см для 15-30 мин.
Примечание: Всего напряжения = расстояние между электродами x 1 V - В контейнере полностью погрузите слайд в холодных ди H2O. После 2 минут удалите ди H2O и добавить свежие ди H2O. повторить этот шаг.
- Замените ди H2O холодной на 70% спирте. Подождите 5 минут осторожно удалить слайд, не наклоняйте его и пусть воздушно-сухой.
- После того, как сушеные, добавьте 100 мкл разбавленного ДНК красителя в каждом месте. Подождите 15 минут при комнатной температуре. Используя фильтр FITC в помощью эпифлуоресцентного микроскопа, принимать изображения от 50 до 100 комет в общей сложности на сэмпл.
- Место слайда в бак горизонтального электрофореза. Заполните резервуар холодной щелочной электрофорез буфера до тех пор, пока слайды полностью погружены. Примените напряжение на 1 V/см для 15-30 мин.
-
Анализ изображений и расчет результатов
- Для озвучивания комет, использовать национальные институты здравоохранения (NIH) ImageJ с кометой пробирного плагин (скачать ImageJ здесь: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; скачать плагин здесь: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
Примечание: Плагин поставляется с инструкции PDF, который содержит все детали для выполнения анализа. Кроме того скриншоты комета анализа приведены на Рисунке 2A-C. Представитель комета изображения контроля и доксорубицином (Doxo)-лечение ИПК клетки и количественная оценка комет показано на Рисунке 3A-C.
- Для озвучивания комет, использовать национальные институты здравоохранения (NIH) ImageJ с кометой пробирного плагин (скачать ImageJ здесь: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; скачать плагин здесь: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
2. ДНК повреждения ответ
- Подготовка образца и реагентов
- Для культуры клеток iPS-CM культура iPS-CM клеток в подвал мембрана матрица покрытием (см. Таблицу материалы) культуры пластин в среде RPMI, дополняется B-27 (CMM), пока не будет достигнуто confluency.
Примечание: Человека iPS клеток, полученных кардиомиоцитов использовались в настоящем Протоколе. Протокол для дифференцировки клеток iPS в cardiomyocytes можно найти в последних статьях с нашей исследовательской группы12,13,21. - Семя iPS-CMs в камере слайды.
- Отказаться от культуры среднего из скважин iPS см. Вымойте клетки три раза с PBS.
- Добавить 1 мл 0,25% трипсина в колодец и инкубировать при 37 ° C за 5 минут проверить пластину под микроскопом для ячейки отряда. Добавьте 1 mL ШМ остановить трипсина.
- Место суспензию клеток в 15 мл трубки и центрифуги для 5 мин при 4 ° C и 200 x g. Отказаться от среднего, добавляют 1 мл ШМ и Ресуспензируйте клетки. Подсчитать количество ячеек и отрегулировать количество клеток для получения 20 x 105 клеток в 1,6 мл CMM.
- Семя 200 мкл суспензии клеток за хорошо камеры 8-Ну слайд (см. Таблицу материалы). Коснитесь слайда, мягко для распространения клеток вокруг колодца и Инкубируйте на 37 ° C.
- Для лечения доксорубицин iPS-CM отказаться от культуры среднего из скважин iPS см. Вымойте клетки с PBS. Лечить клетки с 1 мкм доксорубицин и ШМ для 4 h. аспирационная среднего и вымыть клетки с PBS.
- Для блокировки буфера, подготовить 10 мл раствора бычьим сывороточным альбумином (БСА), содержащий 3% BSA и 0,05% Тритон X-100. Для приготовления 10 мл блокировки буфера, добавьте 1 мл сыворотки нормальной осла 9 мл приготовленного раствора БСА.
- Для решения основного антитела добавьте 1 мкл Н2А анти кролик фосфо гистонов. X (Ser139) антител к 200 мкл блокировки буфера.
- Для вторичного антитела смесь добавьте 1 мкл конъюгированных флюрохром вторичного антитела анти кролика, DAPI и флюрохром конъюгированных Фаллоидин 200 мкл блокировки буфера.
- Для культуры клеток iPS-CM культура iPS-CM клеток в подвал мембрана матрица покрытием (см. Таблицу материалы) культуры пластин в среде RPMI, дополняется B-27 (CMM), пока не будет достигнуто confluency.
- Immunolabeling
- Вымыть клетки три раза с PBS и добавить 200 мкл свежеприготовленные параформальдегида 4% (PFA) для каждой скважины. Исправьте ячейки для 20 мин в темноте при комнатной температуре. Вымойте клетки с PBS.
- Удаление PBS и добавить 200 мкл блокировки буфера в колодец и блок для 30 мин в камере увлажненной при комнатной температуре. Удалите блокирующий буфер и добавьте 200 мкл раствора первичного антитела. Инкубируйте в темноте, увлажненные камере при комнатной температуре 45 мин. Затем промойте лунки три раза с PBS.
- Удаление PBS и добавить 200 мкл вторичное антитело смеси. Инкубируйте в темноте, увлажненные камере при комнатной температуре 45 мин. Затем промойте лунки три раза с PBS. Промойте ди H2O перед монтажом их с antifade. Место coverglass и хранить слайды в темноте при 4 ° C.
- С помощью эпифлуоресцентного микроскопа, три-пять изображения случайных полей за образец, как показано на рисунке 4Aи приступить к анализу изображений.
- Подсчет очагов DDR
- Загрузите и установите CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
- Примечание: Обработки изображений в этом исследовании была выполнена с использованием CellProfiler версии 2.1.1. Учебники для CellProfiler, которые были использованы можно найти в других местах (список & https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk = PL7CC87670239B4D10). Если используется новая версия CellProfiler, конвейер может потребоваться незначительные адаптации.
- Скачайте трубопровода punctae_gH2AX.cpipe. Выберите файл > Импорт > трубопровода из файла и выберите punctae_gH2AX.cpipe.
- Drag-and-drop в папку, содержащую полученные изображения очагов γH2A.X к окну списка файлов в разделе Модули ввода/изображения для анализа (Рисунок 5A). Затем следуйте инструкциям, как показано на Рис. 5A-Л.
- Установите следующие параметры для изображений:
- Перетащите нужное изображение для анализа на список файлов. В разделе модули ввода, выберите изображения (см. Рисунок 5A для настройки модуля). В модули ввода, выберите метаданные (см. Рисунок 5B для настройки модуля). В модули ввода, выберите NamesAndTypes (см. рис. 5 c для настройки модуля).
- Для группвыберите нет. В модули анализа, выберите ColorToGray (см. Рисунок 5 d для настройки модуля).
- В модули анализа, выберите гладкой (см. Рисунок 5E для настройки модуля).
Примечание: Это значение может должны быть оптимизированы, в зависимости от разрешения изображения. - В модули анализа, выберите IdentifyPrimaryObjects (см. Рисунок 5F для настройки модуля).
Примечание: Оптимизируйте эти значения, чтобы убедиться, что выбран весь ядро. После этого шага компьютер может отставать. - В модули анализа, выберите гладкой (см. Рисунок 5 g для настройки модуля).
Примечание: Это значение может должны быть оптимизированы, в зависимости от разрешения изображения. - В модули анализа, выберите EnhanceOrSuppressFeatures (см. Рисунок 5 H для настройки модуля).
- В модули анализа, выберите IdentifyPrimaryObjects (см. Рисунок 5I для настройки модуля).
Примечание: Оптимизируйте эти значения, чтобы убедиться, что выбраны punctae. После этого шага компьютер может отставать снова.- В модули анализа, выберите RelateObjects (см. Рисунок 5J для настройки модуля). В модули анализа, выберите ClassifyObjects (см. Рисунок 5 K для настройки модуля). В модули анализа, выберите ExportToSpreadsheet (см. Рисунок 5 Л для настройки модуля).
- Нажмите кнопку Анализировать изображения на нижней левой панели для выполнения анализа изображений. В успешное завершение анализа, создаются несколько изображений (Рис. 6A-F).
Примечание: Пользователи должны сохранять эти изображения для использования в будущем. - Обратите внимание, CSV-файл, содержащий количественные данные для дальнейшего анализа, который создается и сохраняется в соответствующее место на компьютере. В таблице под названием MyExpt_Imageстолбцы B и D будут иметь количество ядер, которые имеют до пяти и более punctae, соответственно. Добавьте столбцы B и D, чтобы получить общее количество ядер.
- Повторите шаг 2.3.3 - 2.3.8 для всех изображений (изменить имя файла MyExpt_ перед каждый анализ). Земельные участки могут сделаны для оценки целостности ДНК, как показано на рисунке 4 c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Были искусственного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, и повреждения ДНК и хвост момент, которые были использованы как мера целостности ДНК, были проанализированы пробирного кометы. ИПК клетки были встроенные в температура плавления агарозы и размещены на стеклянное скольжение. Клетки затем, лечили литического буфера, а затем щелочной раствор, чтобы получить supercoiled ДНК. Нуклеоидах были electrophoresed и кометы были визуализировать ДНК краситель (рис. 1A-D). Затем, комет анализировались с ImageJ, используя плагин пробирного Комета (рисунок 2A-C).
Клетки человека iPS лечили Doxo вызвать повреждение ДНК и использоваться в качестве позитивного элемента управления. Представитель микроскопии комет из клеток Doxo лечение и nontreated iPS показаны на рисунке 3A. В клетках iPS, выраженное в виде дроби ДНК повреждения и хвост момента было обнаружено базальной количество повреждения ДНК. Однако Doxo, лечение увеличение повреждения ДНК в клетках iPS как ожидалось (рисунок 3BC). Это показывает, что комета assay может использоваться для оценки целостности ДНК не только в соматические клетки18,19 , но и в плюрипотентных стволовых клеток21.
Свеже продифференцировано iPS кардиомиоцитов (iPS-CMs), iPS-CMs культивировали, за 6 месяцев (длительное культура [PC]) и iPS-CMs, относились с Doxo были подвергнуты γH2A.X immunolabeling. Представитель микроскопии γH2A.X immunolabelling приведены в рисунке 4A (нижний увеличение) и Рисунок 4B (-увеличение). Количество γH2A.X очагов (DDR очагов) (punctae) в каждом ядре количественно, используя CellProfiler с модулей пользовательских конвейера (Рисунок 5A-L). Процент клеток, которые являются позитивными для γH2A.X подразделяются на ядрах с нуля до пяти punctae и ядер с более чем 10 punctae. В управления iPS см более 90% клеток были менее пяти DDR очагов в ядрах, и в общей сложности менее 10% клеток было более чем шести DDR очагов в ядрах (рис. 4 c, управления [Ctrl]). iPS-CMs, культивируемых на 6 месяцев было меньше, чем 90% клеток с менее пяти DDR очагов в ядрах и в общей сложности более чем на 13% клеток более чем шести DDR очагов в ядрах (Рисунок 4 c, PC), тогда как лечить Doxo iPS-CM показали меньше чем 80% клеток с les с чем пяти DDR очагов в ядрах и в общей сложности около 24% клеток было более чем шести DDR очагов в ядрах (Рисунок 4 c, Doxo). Эти данные ясно показывает, что длительное клеточной культуры и Doxo лечение вызвать значительное повреждение ДНК в iPS-CMs и не подходят для трансплантации клеток.
Рисунок 1: схема анализа комета. Смесь суспензии клеток с низким плавления агарозы (A) и (B) поместить его на стеклянное скольжение. (C) относиться к нему с буфер lysis клетки, после чего щелочной раствор, чтобы получить нуклеоидах, содержащих supercoiled ДНК. (D) Electrophorese и пятно ДНК с помощью ДНК SYBR зеленый краситель. (E) схема нетронутыми (слева) и поврежденной ДНК (право, форма кометы). (F) формула для вычисления часть ДНК повреждения и хвост момента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: ДНК повреждения и хвост момент квантификации по ImageJ. (A-C) Скриншоты ImageJ, с плагином анализа кометы, показаны выбор комета голова и хвост. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: доксорубицин индуцирует повреждение ДНК в клетках человека iPS. (A) ДНК повреждения в доксорубицин лечение (Doxo) и клетки iPS nontreated (управления), анализируются с помощью комета assay. (B) доля повреждений ДНК (n = 3) и (C) хвост момент (n = 63 комет) количественно, используя assay кометы. Лечение с доксорубицином, ДНК вставочный агент, значительно увеличили долю ДНК повреждения и хвост момент в клетках iPS. Данные являются средства ± SEM. *P < 0,05, студент непарные t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: ответ повреждения ДНК в iPS производные кардиомиоцитов. (A) ДНК повреждения ответ маркера γH2A.X выявленных иммунофлюоресценции доксорубицин лечение (Doxo) и iPS кардиомиоцитов nontreated (управления), а также длительное культура iPS кардиомиоцитов (PC). (B) выше, увеличение γH2A.X (зеленый punctae) маркировки в местах повреждения ДНК в iPS-CMs. (C) количественная оценка DDR очагов, анализируются с помощью CellProfiler с модулей пользовательских конвейера. Данные являются средства ± SD; n = 3-4. P < 0,05, студент непарные t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: автоматизированный анализ ответ повреждения ДНК, CellProfiler. (A-L) Скриншоты из CellProfiler с указанными параметрами для импорта изображений и автоматической идентификации и количественной оценки γH2A.X punctae в iPS-CMs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: автоматизированный анализ ответ повреждения ДНК, CellProfiler. (A-F) Образы данных, генерируемых CellProfiler по завершении анализа изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целостность ДНК изображает целостность клеток. Клетки с поврежденной ДНК часто в стресс и в конечном итоге потерять их целостность. Целостность стволовых стволовых клеток, полученных клеток, которые распространяются для целей трансплантации и основных ячеек для выполнения их требуемую функцию. Пересадка клетки с поврежденной ДНК приведет к плохой приживления скорость и производительность ячейки8,20. Таким образом изучение целостности ДНК до трансплантации клеток — это протокол необходимый контроль качества. Здесь мы опишем два экономически эффективных подходов, а именно комета пробирного и γH2A.X иммунофлюоресценции маркировки, чтобы оценить повреждение ДНК и качество стволовых и стволовых клеток, полученных клеток.
Накопление повреждений ДНК в клетках считается одной из основных причин клеточного старения. Используя assay кометы, Аль-Бейкер et al. проанализировали повреждения ДНК в молодых и стареющей фибробластов дермы22. Ранее мы показали, что рассады сердечной свободной от повреждения ДНК клетки-предшественники изолированы от p53 трансгенные мыши увеличилась скорость приживления в орган принимающей8. Недавно мы показали роль домена transactivation p53 в ДНК повреждения ремонт механизмов в клетки человека iPS21. В обоих исследованиях мы использовали как комета пробирного и γH2A.X иммунофлюоресценции, маркировки методологий для оценки повреждения ДНК в стволовых клеток. Оба эти методы являются экономически эффективными и могут быть выполнены с основным лабораторное оборудование. Раздражает критическая проблема, которую мы часто испытывали агарозы застывающих в пипетку и трубы. Мы преодолеть эту проблему, подогрев всех трубок и советы до дозирования агарозы. В то время как комета assay занимает до 2 дней, оптимизированный γH2A.X иммунофлюоресценции маркировки процедура может быть выполнена в возрасте до 4 ч.
Культуры клеток человека iPS с более чем 10% повреждения ДНК, измеряется комета assay, не проводится различия эффективно в кардиомиоцитов (данные не показаны) в пробирке. Комета assay чувствительных и динамичной в оценке повреждения ДНК в стволовых клеток. Однако оценки целостности ДНК в некоторых клетках, таких как iPS производные кардиомиоцитов, являются громоздкими, комета пробирного ввиду характера клеток. Cardiomyocytes обогащены тропонин, саркомерных белков и внеклеточного матрикса секретируемые белки. Денатурировать эти сложные структуры, чтобы сделать supercoiled ДНК и его воспроизводимости являются сомнительными. Самое главное 25% до 40% человеческого кардиомиоцитов binucleated25, и эти показатели различаются по iPS производные кардиомиоцитов. Поскольку в assay комета нарушается клеточной стенки, точную оценку процент повреждения ДНК клеток невозможно. Таким образом в случае iPS-CMs, γH2A.X иммунофлюоресценции маркировки процедура оценки повреждения ДНК является упрощенной альтернативой для assay кометы.
Основываясь на эти результаты и те из предыдущих публикаций8,20,нашей группы21, мы предполагаем, что, если есть более чем 10% повреждения ДНК, оценены пробирного кометы, или менее чем 90% клеток имеют нулевую пяти DDR очаги, а затем культуры должен быть дисквалифицирован для трансплантации клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержали национальные сердца, легких и крови института грантов RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 и UO1-HL-134764 (с J. Чжан) и американской сердца ассоциации научного развития Грант 17SDG33670677 (до р. Kannappan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
