Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценки целостности ДНК стволовых клеток для сердечно клеточной терапии

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58971

⸱

25 января 2019 г.

 ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предоставляем подробное описание экспериментальной установки для анализа оценки целостности ДНК в стволовых клеток до трансплантации клеток.

Аннотация

Стебель и стволовых клеток, полученных клетки имеют огромный потенциал как регенеративной терапии для различных дегенеративных заболеваний. ДНК является склад генетических данных во всех клетках, в том числе стволовых клеток, и ее целостность имеет основополагающее значение для его регенеративные способности. Стволовые клетки претерпевают быстрое распространение в лабораториях для достижения необходимого числа для трансплантации. Ускоренное клеточный рост приводит к потере целостности ДНК накопленных метаболитов, таких как кислорода, карбонил и алкилирующие агенты. Пересадка эти клетки приведет к плохой приживления и регенерации органов ухудшение. Кроме того, пересадке ДНК поврежденных клеток приводит к мутации, нестабильность ДНК и клеточного старения и возможно, угрожающих жизни заболеваний, как рак. Таким образом существует настоятельная необходимость для метода контроля качества для оценки пригодности клеток для трансплантации. Здесь мы предоставляем пошаговые протоколы для оценки целостности ДНК стволовых клеток до трансплантации клеток.

Введение

Экспериментальные и клинические данные показывают, что трансплантация клеток умеренно может улучшить левого желудочка сократительной производительность при отсутствии сердца1,2,3,4,5 ,6,,78,9. Последние достижения открыли дальнейшего обжалования возможности для сердечно-сосудистой системы регенерации; к ним относятся принудительный выражение перепрограммирования фактор....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. комета Assay

  1. Подготовка реагента
    1. Температура плавления агарозы место легкоплавких агарозы 500 мг в 100 мл ДНК- / РНК свободной воды. Нагрейте бутылку в микроволновой печи до тех пор, пока агарозы растворяет. Поместите бутылку в ванну воды 37 ° C до тех пор, пока требуется.
      Примечание: Для дальнейшего чтения, см. аскета et al., который изучал эффекты агарозы концентрации на время ДНК Размотка и несколько факторов электрофорез23.
    2. Разбавьте ДНК SYBR зеленый краситель в буфер Tris-ЭДТА (TE) в соотношении мэм для получения 1 x работает раствор красителя запасов. Этот краситель ч....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Были искусственного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, и повреждения ДНК и хвост момент, которые были использованы как мера целостности ДНК, были проанализированы пробирного кометы. ИПК клетки были встроенные в температура плавления агарозы и размещены на стеклянное скольжение. Клетки затем, лечили литического буфера, а затем щелочной раствор, чтобы получить supercoiled ДНК. Нуклеоидах были electrophoresed и кометы были визуализировать ДНК краситель (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Целостность ДНК изображает целостность клеток. Клетки с поврежденной ДНК часто в стресс и в конечном итоге потерять их целостность. Целостность стволовых стволовых клеток, полученных клеток, которые распространяются для целей трансплантации и основных ячеек для выполнения их требуемую функцию. Пересадка клетки с поврежденной ДНК приведет к плохой приживления скорость и производительность ячейки8,20. Таким образом изучение целостности ДНК до трансплантации клеток .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа частично поддержали национальные сердца, легких и крови института грантов RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 и UO1-HL-134764 (с J. Чжан) и американской сердца ассоциации научного развития Грант 17SDG33670677 (до р. Kannappan).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсинCorning25200056
8-луночной камерепредметного стекла MillicellPEZGS0816
AccutaseStemcell Technologies7920Раствор для отслоения клеток
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG
Jackson Immuno
Research Laboratories
711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson Immuno
Research Laboratories
711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPISigma-AldrichD9564
Gibco B-27 Добавка, без сыворотки,Gibco17504-044
Фактор роста Matrigel сниженCorning354230
mTeSR1Технологии стволовых клеток85850
ФаллоидинA488Технология жизниA12379
Фосфо-гистон H2A. X (Ser139) Технология передачи сигналов антителами2577 (RRID: AB_2118010)
RPMIGibco11875-093
SYBR  Зеленый I гелевый краситель для нуклеиновых кислотSigma-AldrichS9430
Triton X-100Fisher scientificBP151-100
UltraPure Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520050
VectashieldVector LaboratoriesH-1000Antifade

Ссылки

  1. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  2. Makkar, R. R., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Метод кометиммуномаркировка Gamma-H2AXоценка повреждения ДНКкардиомиоцитыполученные из иПСКконтроль качества трансплантации клетокфлуоресцентная микроскопияанализ в CellProfilerпроцедура электрофорезаиммунофлуоресцентное окрашивание