Summary
在这里, 我们提供了一个实验设置的详细描述, 用于分析细胞移植前干细胞 dna 完整性的评估。
Abstract
干细胞和干细胞衍生细胞作为各种退行性疾病的再生治疗具有巨大的潜力。dna 是包括干细胞在内的所有细胞中基因数据的仓库, 其完整性是其再生能力的基础。干细胞在实验室中迅速繁殖, 以获得移植所需的数量。加速细胞生长会导致积累的代谢物 (如活性氧、碳基和烷基化剂) 失去 dna 完整性。移植这些细胞会导致移植不良和器官再生恶化。此外, 移植 dna 受损的细胞会导致突变、dna 不稳定、细胞衰老, 并可能导致癌症等危及生命的疾病。因此, 迫切需要一种质量控制方法来评估细胞是否适合移植。在这里, 我们提供了评估干细胞在细胞移植之前 dna 完整性的分步协议。
Introduction
实验和临床证据表明, 细胞移植能适度改善衰竭心脏1、2、3、4、5的左心室收缩性能 ,6,7,8,9。最近的进展为心血管再生提供了进一步的吸引人的机会;这些包括在体细胞中强制表达重编程因子, 以诱导多能性, 并将这些诱导的多能干细胞 (ipsc)分化为不同的心脏谱系, 重要的是心肌细胞 (cm)10,11,12,13. 每个细胞的遗传物质, 包括人工生成的 ipscs 和 ipsc 衍生 cm (ips-cm), 都是 dna。存储在 dna 中的基因指令决定了细胞、组织、器官和生物的生长、发育和功能。dna 不是惰性的;细胞代谢物, 如活性氧、碳基和氮以及烷基化剂, 可在体外和体内造成dna 损伤 14、15、16、17。重要的是, dna 损伤直观地发生在每个细胞中, 频率很高。如果这些损害得不到纠正, 将导致 dna 突变、细胞衰老、dna 和细胞完整性的丧失, 以及可能的疾病, 包括危及生命的癌症。因此, 保留 dna 完整性对于任何在临床中具有巨大潜力的细胞, 尤其是 ipsc 来说都是必不可少的。
为了评估分离基因组 dna 的数量和完整性, 市场上有昂贵的设备。然而, 没有简单和具有成本效益的方法来评估 dna 完整性的细胞, 而不分离细胞。此外, 用户在 dna 分离过程中诱导的 dna 降解是使用这些方法的主要缺点之一。单细胞凝胶电泳 (称为彗星检测)18,19和γh2a. x 免疫标记8技术是评估 dna 损伤的研究实验室的基本方法。这两种方法不需要昂贵的设备或分离的基因组 dna 来分析 dna 完整性8,20,21。自那时以来, 这些技术已经执行了整个细胞;用户诱导的 dna只能在样品制备过程中降解 dnaa/rna 蛋白不会影响这些协议。在这里, 为了评估干细胞和干细胞中的 dna 损伤和 dna 损伤反应, 我们提供了一步一步的协议来执行彗星分析和γh2a. x 免疫标记。此外, 结合这两种方法, 我们提出了一个天真的评估, 可用于评估细胞是否适合移植。
彗星检测, 或单细胞凝胶电泳, 测量细胞中的 dna 断裂。对低熔融琼脂糖中的细胞进行裂解, 形成含有超盘绕 dna 的核。电泳后, 小块破碎的 dna 和破碎的 dna 链通过琼脂糖毛孔迁移, 而完整的 dna, 由于它们的巨大大小和它们与基质蛋白的结合, 将有一个受限制的迁移。荧光显微镜下染色 dna 的图案模仿彗星。彗星头包含完整的 dna, 尾巴由片段和破碎的 dna 链组成。dna 损伤的分数可以通过受损 dna (彗星尾部) 相对于完整的 dna (彗星头) 强度的荧光强度来测量。参数尾矩可以计算, 如图 1所示。
dna 损伤诱导组蛋白 h2a 的磷酸化。x (γh2a. x) 在 ser139 通过 atm、atr 和 dna-pk 激酶。h2a 的磷酸化和招募。x 在 dna 链断裂被称为 dna 损伤反应 (ddr), 并在 dna 损伤后迅速发生。在这一过程之后, 开始了检查点介导的细胞周期抑制和 dna 修复过程。成功完成 dna 修复后, γh2a. x 被磷酸化并通过磷酸酶灭活。长的多个 dna 链断裂导致在 dna 中积累γh2a. x 病灶。这表明细胞无法修复 dna 损伤和 dna 完整性的丧失。dna 中的这些γh2a. x 病灶可以通过第2部分中的协议进行识别, 并可以使用第2节中的协议计算 ddr 病灶的数量。
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Protocol
1. 彗星检测
-
试剂制备
- 对于低熔点琼脂糖, 将500毫克的低熔融琼脂糖放入100毫升的 dna-/rna 无水中。在微波炉中加热瓶子, 直到琼脂糖溶解。将瓶子放在37°c 的水浴中, 直到需要为止。
请注意:关于进一步的阅读, 见 azqueta 等人, 他研究了琼脂糖浓度对 dna 展开时间的影响和几个电泳因素23。 - 在 tris-edta (te) 缓冲液中稀释 sybr 绿色 dna 染料, 比例为 1:10000, 以获得1x 的工作库存染料溶液。这种染料是感光剂, 所以存放在黑暗的地方。
- 对于细胞裂解缓冲液, 在去离子水 (di h2o) 中溶解100毫升裂解缓冲液 (2.5 m 氯化钠、0.1 m edta、10mm tris、1% triton x-100).然后, 加入 10m naoh, 将 ph 值调整为10.0。将缓冲液冷却至4°c。
- 对于碱性 dna-untwing/ceding/电泳运行缓冲液, 在 di h2o 中溶解1升碱性溶液 (0.3 m naoh, 1mm edta), 将缓冲液冷却至4°c。确保 ph 值和 gt;13。
- 对于预涂彗星滑块, 在玻璃滑块上放置几滴0.5% 的琼脂糖。立即, 使用另一张幻灯片的平面, 展开琼脂糖, 形成一层薄薄的琼脂糖涂层。
请注意:使用前将幻灯片擦干。 - 对于 ips 细胞培养, 在 mtesr1 培养基中, 在基膜-基质-包膜 (见材料表) 培养板中短暂培养 ips 细胞, 直到达到融合。
请注意:该方案采用了人心-心肌纤维细胞衍生的 ips 细胞。我们的研究小组12、13、21最近的文章介绍了 ips 细胞来源和培养条件的重新编程。
- 对于低熔点琼脂糖, 将500毫克的低熔融琼脂糖放入100毫升的 dna-/rna 无水中。在微波炉中加热瓶子, 直到琼脂糖溶解。将瓶子放在37°c 的水浴中, 直到需要为止。
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样品制备
- 丢弃培养基, 清洗细胞。使用分离溶液分离细胞 (见材料表)。用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞颗粒, 并在 1 x10 5 细胞/细胞处重新悬浮 pbs 中的细胞。
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样品幻灯片准备
请注意:在低光照条件下执行以下步骤, 以避免紫外线引起的细胞损伤。- 将细胞悬浮液10μl 和琼脂糖溶液 90μl (1:10 比) 混合在一起。将管子放置在37°c 的水浴中, 以防止琼脂糖凝固。
- 将溶液混合在一起, 而不会引入气泡和移液器70μl 点到预涂彗星滑块上。使用移液器尖端, 将细胞琼脂糖混合物展开, 形成薄薄的一层。将幻灯片置于4°c 中15分钟。
- 在容器中, 将滑块完全淹没在冷裂解缓冲液中。将容器置于4°c 的黑暗中1小时。
- 将裂解缓冲液更换为冷碱性溶液。确保幻灯片完全被淹没。将容器置于4°c 的黑暗中30分钟。
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电泳
- 将滑块放置在水平电泳槽中。用冷碱性电泳缓冲液填充油箱, 直到滑块完全淹没。在 1 v/厘米处施加电压15至30分钟。
请注意:总电压 = 电极之间的距离 x 1 v - 在容器中, 将幻灯片完全淹没在冷的 dih2o 中。2分钟后, 取出 di h2o并添加新的 di h2o.重复此步骤。
- 将 di h2o更换为冷的70% 乙醇。等待 5分钟, 轻轻取出滑梯, 不要倾斜, 让它风干。
- 干燥后, 在每个点加入100μl 的稀释 dna 染料。在室温下等待15分钟。使用荧光显微镜中的 fitc 滤光片, 拍摄每个样本总共50到100颗彗星的图像。
- 将滑块放置在水平电泳槽中。用冷碱性电泳缓冲液填充油箱, 直到滑块完全淹没。在 1 v/厘米处施加电压15至30分钟。
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图像分析和结果计算
- 要给彗星打分, 请使用带有彗星分析插件的国家卫生研究院 (nih) imagej (在此下载 imagej: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; 在此处下载该插件: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/)。
请注意:该插件附带了一个 pdf 指令, 其中包含执行分析的所有详细信息。此外, 彗星分析的截图如图 2a-c所示。图 3a-c显示了控制和多索比星 (doxo) 处理的 ips 细胞的代表性彗星图像以及彗星的定量。
- 要给彗星打分, 请使用带有彗星分析插件的国家卫生研究院 (nih) imagej (在此下载 imagej: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; 在此处下载该插件: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/)。
2. dna 损伤反应
- 样品和试剂制备
- 对于 ips-cm 细胞培养, 在 rpmi 培养基中的基膜-基质-基质-包膜 (见材料表) 培养板中培养 ips-cm 细胞, 辅以 b-27 (cmm), 直到达到融合。
请注意:该方案采用了人机-ips 细胞衍生的心肌细胞。在我们的研究小组12、13、21的最新文章中可以找到 ips 细胞分化为心肌细胞的方案。 - 在室内幻灯片的种子 ips-cm。
- 从 ips-cm 井中丢弃培养基。用 pbs 清洗细胞三次。
- 每口加入1毫升0.25% 的胰蛋白酶, 在37°c 孵育 5分钟, 在显微镜下检查板是否有细胞脱离。添加1毫升的 cmm 来停止胰蛋白酶。
- 将细胞悬浮液放置在15毫升管和离心机中, 在4°c 和 200 x g 下保持5分钟。丢弃介质, 添加1毫升的 cmm, 然后重新挂起单元格。计数细胞并调整细胞计数, 以获得 cmm 1.6 ml 中的 20 x10 5细胞。
- 种子200μl 细胞悬浮液每井8井室幻灯片 (见材料表)。轻轻轻拍滑梯, 将细胞分散在井内, 并在37°c 下孵育。
- 对于 ips-cm 的 doxorubicin 处理, 请从 ips-cm 井中丢弃培养基。用 pbs 清洗细胞。用 1μm doxorubicin 和 cmm 治疗细胞 4小时, 吸入培养基, 用 pbs 清洗细胞。
- 对于阻滞缓冲液, 制备含有 3% bsa 和 0.05% triton x-100 的牛血清白蛋白 (bsa) 溶液10毫升。制备10毫升阻断缓冲液, 在制备的 bsa 溶液中加入正常驴血清1毫升。
- 对于原代抗体溶液, 加入1μl 的抗兔磷组蛋白 h2a。x (ser139) 抗体为200μl 的阻滞剂。
- 对于二级抗体混合物, 在200μl 的阻断缓冲液中加入1μl 的荧光铬共轭抗兔二级抗体、dapi 和氟铬共轭 phalloidin。
- 对于 ips-cm 细胞培养, 在 rpmi 培养基中的基膜-基质-基质-包膜 (见材料表) 培养板中培养 ips-cm 细胞, 辅以 b-27 (cmm), 直到达到融合。
- 免疫标记
- 用 pbs 清洗细胞三次, 并在每口井中加入200μl 的新鲜准备的4% 的甲醛 (pfa)。在室温下将细胞在黑暗中固定20分钟。用 pbs 清洗细胞。
- 取下 pbs, 每口井加入200μl 的阻滞缓冲液, 并在室温下在加湿室内封堵30分钟。去除阻滞缓冲液, 加入200μl 的原代抗体溶液。在室温下在黑暗、加湿的室内孵化45分钟。然后, 用 pbs 清洗三口井。
- 取出 pbs, 加入200μl 的二级抗体混合物。在室温下在黑暗、加湿的室内孵化45分钟。然后, 用 pbs 清洗三口井。用 di h2o 清洗, 然后再安装防褪色.放置一个盖板玻璃, 并将幻灯片存放在黑暗中4°c。
- 使用荧光显微镜, 每个样本采集3到5个随机场图像, 如图 4 a所示, 然后进行图像分析。
- 复员方案重点的计算
- 下载并安装 cellprofiler 24 (http://cellprofiler.org)。
- 请注意:本研究中的图像处理是使用 cellprofiler 版本2.1.1 进行的。使用过的 cellprofiler 教程可以在其他地方找到 (https://www.youtube.com/watch？v=PvhRL9xpduk&list=PL7CC87670239B4D10)。如果正在使用较新版本的 cellprofiler, 则管道可能需要进行一些小的调整。
- 下载管道punctae_gH2AX.cpipe。从文件中选择"文件 > 导入>管道", 然后选择"punctae_gH2AX.cpipe"。
- 将包含γh2a. x 焦点图像的文件夹拖放到 "输入模块" 部分的"文件"列表窗口中进行分析 (图 5a)。然后, 按照图 5a-l所示的说明进行操作。
- 为图像设置以下参数:
- 将所需图像拖到 "文件" 列表中进行分析。在 "输入模块"下, 选择"图像" (有关模块设置, 请参见图 5a )。在"输入模块"中, 选择"元数据" (有关模块设置, 请参见图 5 b )。在"输入模块"中, 选择 "命名和类型" (有关模块设置, 请参见图 5c )。
- 对于"组", 选择"否"。在分析模块中, 选择"颜色-灰色" (有关模块设置, 请参见图 5d )。
- 在"分析模块" 中, 选择"平滑" (有关模块设置, 请参见图 5e )。
请注意:此值可能需要优化, 具体取决于图像分辨率。 - 在分析模块中, 选择 "标识对象" (有关模块设置, 请参见图 5f )。
请注意:优化这些值, 以确保选择整个原子核。完成此步骤后, 计算机可能会延迟。 - 在"分析模块" 中, 选择"平滑" (有关模块设置, 请参见图 5g )。
请注意:此值可能需要优化, 具体取决于图像分辨率。 - 在"分析模块"中, 选择 "增强保护功能" (有关模块设置, 请参见图 5h )。
- 在"分析模块" 中, 选择 "标识对象" (有关模块设置, 请参见图 5i )。
请注意:优化这些值, 以确保选择标点符号。完成此步骤后, 计算机可能会再次延迟。- 在分析模块中, 选择"关系对象" (有关模块设置, 请参见图 5j )。在分析模块中, 选择"分类对象" (有关模块设置, 请参见图 5k )。在分析模块中, 选择"出口电子表格" (有关模块设置, 请参见图 5l )。
- 单击左下角面板的"分析图像" 以执行图像分析。在成功完成分析后, 将生成多个图像 (图 6a-f)。
请注意:用户应保存这些图像以供将来参考。 - 请注意. csv 文件, 其中包含用于进一步分析的定量数据, 该文件生成并保存在计算机上的适当位置。在称为myexpt _ image 的电子表格中, b 列和 d 列的原子核数量分别有5个和更多的标点符号。添加列 b 和 d, 以获得原子核的总数。
- 对所有图像重复步骤 2.3.3 2.3.8 (每次分析前更改 myexpt _ 文件名) 。可以制作用于评估 dna 完整性的图, 如图4c 所示。
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Representative Results
对人体诱导多能干细胞进行了培养, 并对 dna 损伤和尾矩进行了分析, 并对其 dna 损伤和尾矩进行了分析。ips 细胞被嵌入低熔点琼脂糖中, 放置在玻璃滑梯上。然后, 用裂解缓冲液对这些细胞进行处理, 然后用碱性溶液进行治疗, 以获得超盘绕的 dna。用 dna 染料对成核进行了电泳, 并对彗星进行了可视化 (图 11-d)。然后, 利用彗星分析插件 (图 2a-c), 使用 imagej 对彗星进行了分析。
用 doxo 对人类 ips 细胞进行治疗, 以诱发 dna 损伤, 并将其用作阳性对照。图 3a 显示了多科处理和未处理的 ips 细胞中彗星的代表性显微图像。在 ips 细胞中发现了大量的 dna 损伤, 表现为 dna 损伤和尾矩的一小部分。然而, doxo 治疗如预期的那样增加了 ips 细胞的 dna 损伤 (图 3b, c)。这表明, 彗星检测不仅可以用来评估体细胞核、19岁的 dna 完整性, 还可以用于评估多能干细胞21中的 dna 完整性。
新鲜分化的 ips 心肌细胞 (ips-cms)、培养6个月的 ips-cms (延长培养 [pc]) 和使用 doxo 处理的 ips-cms 接受了γh2a. x 免疫标记。图 4 a (低放大倍率) 和图 4A (高放大倍率) 显示了γh2a. x 免疫标记的代表性显微镜图。使用带有自定义管道模块的 cellprofiler 对每个核中的γ h2a. x 焦点 (ddr-x焦点) 进行量化 (图 5a-l)。对γh2a. x 呈阳性的细胞百分比分为零到5个点状的细胞核和10个以上的点状核。在控制 ips-cm 中, 90% 以上的细胞每个细胞核的 ddr 病灶不到 5个, 总共有不到10% 的细胞每个细胞核有6个以上的 ddr 病灶 (图 4c, 控制 [ctrl])。6个月培养的 ips-cm 的细胞不到 90%, 每个细胞核的 ddr 灶不到 5个, 总共有13% 以上的细胞每个细胞核有6个以上的 ddr 病灶 (图 4c, pc), 而在 doxo 处理的 ips-cm 中, 80% 的细胞的每个细胞核超过 5个 ddr 病灶, 总共约24% 的细胞每个细胞核有6个以上的 ddr 病灶 (图 4c, doxo)。这一数据清楚地表明, 长期的细胞培养和多科治疗会导致 ips-cmm 中的 dna 损伤, 不适合细胞移植。
图 1: 彗星检测原理图.(a) 将细胞悬浮液与低熔点琼脂糖混合, 并 (b) 将其放置在玻璃滑梯上。(c) 用细胞裂解缓冲液治疗, 然后是碱性溶液, 以获得含有超盘绕 dna 的核。(d) 使用 sybr 绿色 dna 染料对 dna 进行电泳和染色。(e) 完整 (左) 和损坏的 dna (右, 彗星形状) 示意图。(f) 计算 dna 损伤和尾矩的一小部分的公式。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 图像对 dna 损伤和尾矩的定量.(A-C)imagej 的截图, 彗星分析插件显示了彗星头部和尾部的选择。请点击这里查看此图的较大版本.
图3:doxorubicin 诱导人 ips 细胞 dna 损伤.(a) 使用彗星分析分析的多索比星治疗 (多科) 和未经处理 (对照) ips 细胞的 dna 损伤。(b) 使用彗星测定量化的 dna 损伤分数 (n = 3) 和 (c) 尾矩 (n = 63个彗星)。用 dna 间培养剂 doxorubicin 治疗, 显著增加了 ips 细胞中 dna 损伤和尾矩的比例。数据均为±sem. * p < 0.05, 学生的未配对t检验。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: ips 衍生心肌细胞中的 dna 损伤反应.(a) dna 损伤反应标记γh2a. x 通过免疫荧光识别在多索比星治疗 (doxo) 和未经处理 (对照) ips 心肌细胞以及长期培养的 ips-y朱米细胞 (pc) 中。(b) 在 ips-cm 中 dna 损伤部位贴上的γh2a. x (绿色标点符号) 标记的放大倍率较高 (c) ddr 焦点的定量, 使用带有自定义管道模块的 cellprofiler 进行了分析。数据是指±sd;n = 3 到4。*p < 0.05, 学生的未配对t-测试。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: cellprofiler 的自动 dna 损伤反应分析.(A-L)带有用于导入图像的指定设置的 cellprofiler 的屏幕截图, 以及在 ips-cms 中自动识别和量化γh2a. x 标点符号的屏幕截图. 请点击此处查看此图的更大版本.
图 6: cellprofiler 的自动 dna 损伤反应分析.(A-F)由 cellprofiler 在完成图像分析时生成的数据图像。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
dna 完整性描绘了细胞的完整性。dna 受损的细胞经常处于压力状态, 最终失去完整性。为移植目的而繁殖的干细胞和干细胞的完整性是细胞履行其所需功能的主要原因。移植 dna 受损的细胞会导致8,20细胞的移植率和性能较差。因此, 在细胞移植前检查 dna 完整性是一种必要的质量控制方案。在这里, 我们描述了两种具有成本效益的方法, 即彗星检测和γh2a. x 免疫荧光标记, 以评估 dna 损伤和干细胞和干细胞衍生细胞的质量。
细胞老化的一个主要原因被认为是细胞 dna 损伤的积累。利用彗星法, al-baker 等人分析了22个年轻和衰老的人真皮成纤维细胞的 dna损伤。此前, 我们已经证明, 移植 dna 损伤的心脏祖细胞从 p53 转基因小鼠分离增加了在宿主器官8的雕刻率。最近, 我们已经证明了 p53 转染域在人类 ips 细胞21dna 损伤修复机制中的作用。在这两项研究中, 我们都采用了彗星分析和γh2a. x 免疫荧光标记方法来评估干细胞中的 dna 损伤。这两种方法都具有成本效益, 可使用基本的实验室设备执行。一个烦人的关键问题, 我们经常遇到的是琼脂糖固化在移液器和管。我们克服了这个问题, 在移液琼脂糖之前, 我们对所有的管道和吸头进行了预热。虽然彗星检测需要长达2天的时间才能完成, 但优化后的γh2a. x 免疫荧光标记程序可在4小时内完成。
通过彗星试验测量 dna 损伤超过10% 的人 ips 细胞培养物在体外没有有效地分化为心肌细胞 (数据未显示)。彗星检测对评估干细胞 dna 损伤具有敏感性和动态性。然而, 某些细胞 (如 ips 衍生的心肌细胞) 的 dna 完整性评估由于细胞的性质而被彗星检测所繁琐。心肌细胞富含肌钙蛋白、肉瘤蛋白和分泌的细胞外基质蛋白。对这些复杂的结构进行变性, 使超卷 dna 及其重现性是值得怀疑的。最重要的是, 25% 到40% 的人心肌细胞是双核 25, 这些百分比在 ips 衍生的心肌细胞中有所不同。由于细胞壁在彗星检测中被破坏, 因此不可能准确评估 dna 受损细胞的百分比。因此, 在 ips-cms 的情况下, 评估 dna 损伤的γh2a. x 免疫荧光标记程序是彗星检测的一种简单替代方法。
根据这些结果以及我们第8、20、21 组以前的出版物, 我们建议, 如果 dna 损伤超过 10%, 通过彗星分析评估, 或不到90% 的细胞有0至5的 ddr病灶, 那么培养应被取消细胞移植的资格。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家心脏组织的部分支持, 肺和血液研究所授予 ro1-hl-999507、hl-114120、hl-131017、hl138023 和 uo1-hl-134764 (致 j. zhang) 和美国心脏协会科学发展赠款 17sdg33670677 (至 r. kannappan)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
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