Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Vurdering af stamceller DNA integritet for kardiale celleterapi

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58971
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

Her give vi en detaljeret beskrivelse af en eksperimentel opsætning for en analyse af vurderingen af DNA integritet i stamceller inden celle transplantation.

Abstract

Stammen og stammen-celle-afledte celler har enorme potentiale som en regenerativ behandling af forskellige degenerative sygdomme. DNA er lagerbygning af genetiske data i alle celler, herunder stamceller, og dens integritet er grundlæggende for sin regenerative evne. Stamceller undergår hurtige formering i labs for at opnå de nødvendige tal til transplantation. Accelereret cellevækst fører til tab af DNA integritet af akkumulerede metabolitter, såsom reaktive oxygen, carbonyl og alkylerende stoffer. Omplantning disse celler ville resultere i dårlig engraftment og regenerering af den forværrede orgel. Derudover omplantning DNA-beskadigede celler fører til mutationer, DNA ustabilitet, cellulære ældning, og eventuelt livstruende sygdomme som kræft. Derfor, der er et øjeblikkeligt behov for en kvalitetskontrol metode til at vurdere den celle er egnet til transplantation. Her, leverer vi en trinvis protokoller for vurdering af DNA integriteten af stamceller inden celle transplantation.

Introduction

Eksperimentel og klinisk dokumentation viser, at celle transplantation kan moderat forbedre venstre ventrikel kontraktile svigtende hjerter1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. De seneste fremskridt har åbnet yderligere tiltrækkende muligheder for hjerte-kar-regenerering; Disse omfatter den tvungne udtryk for omprogrammering faktorer i somatiske celler til at fremkalde pluripotency og differentiere disse inducerede pluripotente stamceller (iPSC) i forskellige kardiale lineages, især cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. den arvelige materiale i hver celle, herunder kunstigt genereret iPSCs og iPSC-afledte CM (iPS-CM), er DNA. De genetiske instruktioner lagret i DNA dikterer vækst, udvikling og funktion af celler, væv, organer og organismer. DNA er ikke inaktiv; celle metabolitter, såsom reaktive oxygen, carbonyl og nitrogen arter, og alkylerende stoffer kan forårsage DNA skade in vitro- og in vivo14,15,16,17. Vigtigere, opstår DNA-skader intuitivt i hver celle, med en betydelig frekvens. Hvis disse skader ikke er løst, vil det føre til DNA-mutation, cellulære gulne, tabet af DNA og celle integritet, og eventuelt, sygdomme, herunder livstruende kræft. Derfor er bevarer DNA integritet afgørende for enhver celle, især iPSCs, der har et enormt potentiale i klinikken.

For at vurdere den mængde og integritet på isolerede genomisk DNA, er dyrt udstyr tilgængelige på markedet. Men der er ingen enkle og omkostningseffektive metoder til at vurdere DNA integritet i celler, uden at isolere cellerne. Derudover er bruger-induceret DNA nedbrydning under DNA isolation en af de større ulemper ved at bruge disse metoder. De encellede gel elektroforese (kendt som comet assay)18,19 og γH2A.X immunolabeling8 teknikker er grundlæggende metoder i forskning labs for vurdering af DNA-skader. Disse to metoder kræver ikke dyrt udstyr eller isolerede genomisk DNA til at analysere DNA integritet8,20,21. Da er disse teknikker blevet udført med hele celler; bruger-induceret DNA/RNA/protein nedbrydning under prøveforberedelsen vil ikke påvirke disse protokoller. Her, for at vurdere de DNA-skader og DNA skader svar i stammen og stammen-celle-afledte celler, leverer vi en trinvis protokoller til at udføre både komet assay og γH2A.X immunolabeling. Derudover foreslår kombinerer disse to tilgange, vi en naiv vurdering, der kan bruges til at vurdere den celle er egnet til transplantation.

Komet assay, eller enkelt celle gel elektroforese, måler DNA pauser i celler. Celler indlejret i lav-smeltende Agarosen er mængden til form Xanthophyta indeholdende supercoiled DNA. Ved elektroforese vandrer små stykker af fragmenterede DNA og DNA-strenge, brudt gennem porerne Agarosen intakt DNA, på grund af deres enorme størrelse og deres konjugering med matrix protein, vil have en begrænset migration. Mønster af farvede DNA under et fluorescens mikroskop efterligner en komet. Komet hovedet indeholder intakt DNA og halen er sammensat af brudstykker og brudt DNA-strenge. Brøkdel af DNA-skader kan måles ved fluorescens-intensiteten af den beskadigede DNA (comet hale) i forhold til intakt DNA (comet hoved) intensiteten. Parameter halen øjeblik kan beregnes som vist i figur 1.

DNA-skader inducerer fosforylering af Histon H2A. X (γH2A.X) på Ser139 ved ATM, ATR og DNA-PK kinaser. Fosforylering og rekruttering af H2A. X på DNA strand pauser kaldes DNA skader svar (DDR) og sker hurtigt efter DNA er beskadiget. Efter denne proces, checkpoint-medieret celle cyklus anholdelse og DNA reparationsprocesser er indledt. Efter den vellykkede afslutning af DNA reparation, er γH2A.X defosforyleret og inaktiveret ved fosfataser. Forlænget og flere DNA strand pauser føre til ophobning af γH2A.X foci i DNA. Dette angiver cellens evne til at reparere DNA skader og tab af DNA integritet. Disse γH2A.X foci i DNA kan identificeres af og antallet af DDR foci kan tælles ved hjælp af protokollen i afsnit 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. komet Assay

  1. Af reagens
    1. For lav smeltepunkt agarosegelelektroforese, placere 500 mg af lav-smeltende Agarosen i 100 mL af DNA- / RNA-frit vand. Varm flasken i en mikrobølgeovn, indtil Agarosen er opløst. Placere flasken i et 37 ° C vandbad indtil det skal bruges.
      Bemærk: Yderligere læsning, du Azqueta et al., der studerede virkningerne af Agarosen koncentration på DNA-afvikling tid og flere elektroforese faktorer23.
    2. Fortynd SYBR green DNA farvestof i Tris-EDTA (TE) Buffer i forholdet 1:10,000 at opnå en 1 x arbejder stock farvestof løsning. Dette farvestof er lysfølsomt, så Opbevar det i et mørkt sted.
    3. For lysisbuffer cellen opløses 100 mL lysisbuffer (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) i ionbyttet vand (DI H2O). Derefter tilføje 10 M NaOH for at justere pH-værdien til 10,0. Cool buffer til 4 ° C.
    4. For basisk DNA-afvikling/elektroforese kører bufferen, opløse 1 L af basisk opløsning (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) i DI H2O. Cool buffer til 4 ° C. Sørg for, at pH > 13.
    5. Brugsklare komet dias, sted et par dråber af 0,5% Agarosen på et glas dias. Straks, bruger den flade del af et andet dias, sprede Agarosen for at danne et tyndt lag af Agarosen belægning.
      Bemærk: Tør diasene før brug.
    6. Til iPS cellekultur, kort kultur iPS-celler i kælderen-membran-matrix-belagt (Se Tabel af materialer) kultur plader i mTESR1 næringssubstratet indtil confluency er nået.
      Bemærk: Human-hjerte-fibroblast-afledt iPS-celler blev brugt i denne protokol. Omprogrammering af iPS celle afledning og dyrkningsbetingelserne er beskrevet i seneste artikler fra vores forskning gruppe12,13,21.
  2. Forberedelse af prøver
    1. Kassér næringssubstratet og cellerne vaskes. Adskille de celler ved hjælp af detachment løsning (Se Tabel af materialer). Vaske celle pellet med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og resuspend celler i PBS ved 1 x 105 celler/mL.
  3. Prøveforberedelse dias
    Bemærk: Udfør følgende trin under dårlige lysforhold at undgå ultraviolet-lys-induceret celleskader.
    1. Mix 10 μL cellesuspension og 90 μL af Agarosen løsning (1:10 ratio) i et rør. Glasset anbringes i et 37 ° C vandbad til at forhindre, at Agarosen solidifying.
    2. Opløsninger blandes uden at indføre luftbobler og afpipetteres 70 μL/spot diaset brugsklare komet. Ved hjælp af en pipette tip, sprede celle Agarosen blanding at danne et tyndt lag. Marker diasset 4 ° C i 15 min.
    3. I en container, helt nedsænkes dias i kolde lysisbuffer. Beholderen anbringes i mørke ved 4 ° C i 1 time.
    4. Erstatte lysisbuffer med kolde alkalisk opløsning. Kontroller dias er helt neddykket. Beholderen anbringes i mørke ved 4 ° C i 30 min.
  4. Elektroforese
    1. Sted diaset i en vandret elektroforese tank. Fyld tanken med kolde alkalisk elektroforese buffer, indtil diasene er helt neddykket. Anvende spænding på 1 V/cm for 15 til 30 min.
      Bemærk: Total spænding = afstand mellem elektroderne x 1 V
    2. I en container, helt nedsænkes dias i kolde DI H2O. Efter 2 min, fjerne DI H2O og tilføje frisk DI H2O. gentage dette trin.
    3. Erstatte DI H2O med kolde 70% ethanol. Vent 5 min. forsigtigt fjerne diaset, ikke vippe det, og lad det lufttørre.
    4. Når tørret, Tilsæt 100 μL fortyndet DNA farvestof til hver plet. Vente 15 min ved stuetemperatur. Ved hjælp af et FITC filter i et epifluorescensmikroskop, tage billeder af 50 til 100 kometer i alt pr. prøve.
  5. Billedanalyse og beregning af resultater
    1. For scoring kometerne, bruge National Institutes of Health's (NIH) ImageJ med comet assay plugin (download ImageJ her: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; downloade plugin her: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      Bemærk: Plugin kommer med en PDF-instruktion, der indeholder alle detaljer til at udføre analysen. Derudover er screenshots af comet analyse vist i Figur 2A-C. Repræsentative komet billeder af kontrol og doxorubicin (Doxo)-behandlede iPS-celler og kvantificering af kometerne er vist i Fig. 3A-C.

2. DNA skader svar

  1. Prøve og reagens forberedelse
    1. For en iPS-CM cellekultur, kultur iPS-CM celler i kælderen-membran-matrix-belagt (Se Tabel af materialer) kultur plader i RPMI medium suppleret med B-27 (CMM), indtil confluency er nået.
      Bemærk: Human-iPS-celle-afledte cardiomyocytes blev brugt i denne protokol. Protokol for iPS Celledifferentiering af cardiomyocytes kan findes i seneste artikler fra vores forskning gruppe12,13,21.
    2. Frø iPS-CMs i salen dias.
      1. Kassér næringssubstratet fra iPS-CM brønde. Cellerne vaskes tre gange med PBS.
      2. Der tilsættes 1 mL 0,25% trypsin pr. brønd og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Check plade under et mikroskop for celle detachement. Der tilsættes 1 mL af CMM at stoppe trypsin.
      3. Placer cellesuspension i en 15 mL rør og centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C og 200 x g. Kassere mediet, der tilsættes 1 mL af CMM og resuspend cellerne. Tælle cellerne og justere celletal for at opnå 20 x 105 celler i 1,6 mL af CMM.
      4. Frø 200 µL af cellesuspension pr. brønd 8-godt kammerets slide (Se Tabel af materialer). Tryk på diasset forsigtigt for at sprede cellerne omkring brønden og inkuberes ved 37 ° C.
    3. Til iPS-CM doxorubicin behandling, kassere næringssubstratet fra iPS-CM brønde. Cellerne vaskes med PBS. Behandling af celler med 1 μM doxorubicin og CMM for 4 h. Aspirér medium og cellerne vaskes med PBS.
    4. For den blokerende buffer, forberede 10 mL af bovint serumalbumin (BSA) løsning, der indeholder 3% BSA og 0,05% Triton X-100. For at forberede 10 mL blokerende buffer, der tilsættes 1 mL af normale æsel serum til 9 mL rede BSA løsning.
    5. Den primære antistof løsning, tilføje 1 μL af anti-kanin phospho-Histon H2A. X (Ser139) antistof til 200 μl blokerende buffer.
    6. Sekundær antistof blanding, tilføje 1 μL fluorokrom-konjugerede anti-kanin sekundær antistof, DAPI og fluorokrom-konjugeret phalloidin til 200 μl blokerende buffer.
  2. Immunolabeling
    1. Cellerne vaskes tre gange med PBS og tilføje 200 μl af frisklavede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) til hver brønd. Fix celler i 20 min. i mørke ved stuetemperatur. Cellerne vaskes med PBS.
    2. Fjern PBS og tilsæt 200 μl blokerende buffer pr. brønd og blokere for 30 min i en fugtig kammer ved rumtemperatur. Fjern den blokerende buffer og tilsæt 200 μl af primære antistof løsning. Inkuber i 45 min i en mørk, fugtig kammer ved rumtemperatur. Derefter brøndene vaskes tre gange med PBS.
    3. Fjern PBS og tilsæt 200 μl af sekundær antistof mix. Inkuber i 45 min i en mørk, fugtig kammer ved rumtemperatur. Derefter brøndene vaskes tre gange med PBS. Vask med DI H2O før montering dem med antifade. Placere et daekglas og gemme diasene i mørke ved 4 ° C.
    4. Brug et epifluorescensmikroskop, tage tre til fem billeder af tilfældige felter pr. sample, som vist i figur 4A, og Fortsæt til billedanalyse.
  3. Optælling af DDR foci
    1. Hent og Installer CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
    2. Bemærk: Billedbehandling i denne undersøgelse blev udført ved hjælp af CellProfiler version 2.1.1. Tutorials til CellProfiler, der blev brugt kan findes andre steder (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & liste = PL7CC87670239B4D10). Hvis der bruges en nyere version af CellProfiler kan rørledningen kræve mindre tilpasninger.
    3. Download pipeline punctae_gH2AX.cpipe. Vælg File > Import > rørledning fra filen, og vælg punctae_gH2AX.cpipe.
    4. Træk-og-slip mappen, der indeholder de erhvervede billeder af γH2A.X foci til vinduet listen over filer i afsnittet Input moduler/billeder til analyse (figur 5A). Følg derefter instruktionerne, som vist i Figur 5A-L.
    5. Angiv følgende parametre for billederne:
      1. Træk det ønskede billede for analyse til fillisten. Vælg billeder under Input moduler, (Se figur 5A for modulet indstillinger). I Input moduler, Vælg Metadata (Se figur 5B for modulet indstillinger). I Input moduler, skal du vælge NamesAndTypes (Se figur 5 c for modulet indstillinger).
      2. Grupper, skal du vælge ingen. I analyse moduler, skal du vælge ColorToGray (Se figur 5 d for modulet indstillinger).
    6. I analyse moduler, Vælg glat (Se figur 5E for modulet indstillinger).
      Bemærk: Denne værdi skal optimeres, afhængigt af billedopløsningen.
    7. I analyse moduler, skal du vælge IdentifyPrimaryObjects (Se figur 5F for modulet indstillinger).
      Bemærk: Optimere disse værdier for at sikre hele kernen er markeret. Efter dette trin, kan computeren halter.
    8. I analyse moduler, Vælg glat (Se figur 5 g for modulet indstillinger).
      Bemærk: Denne værdi skal optimeres, afhængigt af billedopløsningen.
    9. I analyse moduler, skal du vælge EnhanceOrSuppressFeatures (Se figur 5 H for modulet indstillinger).
    10. I analyse moduler, skal du vælge IdentifyPrimaryObjects (Se figur 5I for modulet indstillinger).
      Bemærk: Optimere disse værdier for at sikre at punctae er markeret. Efter dette trin, kan computeren halter igen.
      1. I analyse moduler, skal du vælge RelateObjects (Se figur 5J for modulet indstillinger). I analyse moduler, skal du vælge ClassifyObjects (Se figur 5 K for modulet indstillinger). I analyse moduler, skal du vælge ExportToSpreadsheet (Se figur 5 L for modulet indstillinger).
      2. Klik på Analysere billeder på nederste venstre panel til at udføre billedanalyse. På den vellykkede afslutning af analysen, flere billeder genereres (Fig. 6A-F).
        Bemærk: Brugere skal gemme disse billeder til fremtidig reference.
      3. Bemærk den .csv-fil, der indeholder de kvantitative data for yderligere analyse, der er oprettet og gemt i den korrekte placering på computeren. I regneark kaldet MyExpt_Image, vil kolonne B og D have antallet af kerner, der har til fem og mere punctae, henholdsvis. Tilføje kolonne B og D til at få det samlede antal kerner.
    11. Gentag trin 2.3.3 - 2.3.8 for alle billeder (Skift MyExpt_ filnavn før hver analyse). Plots kan foretages for at vurdere DNA integritet, som vist i figur 4 c.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Menneskelige inducerede pluripotente stamceller var kulturperler, og DNA-skader og halen øjeblik, der blev brugt som et mål for DNA integritet, blev analyseret af comet assay. iPS-celler blev integreret i lav smeltepunkt Agarosen og placeret på et glas dias. Cellerne blev, derefter, behandlet med lysisbuffer, efterfulgt af en alkalisk opløsning, at opnå supercoiled DNA. Xanthophyta var electrophoresed og kometer blev visualiseret ved DNA farvestof (figur 1A-D). Kometerne var, derefter analyseret med ImageJ, ved hjælp af comet assay plugin (figur 2A-C).

Menneskelige iPS-celler blev behandlet med Doxo inducerer DNA-skader og bruges som en positiv kontrol. Repræsentative micrographs af kometer fra Doxo-behandlet og nontreated iPS-celler er vist i figur 3A. En basal del af DNA-skader blev fundet i iPS-celler, udtrykt som en brøkdel af DNA skade og halen øjeblik. Dog forventet Doxo behandling øget DNA skader i iPS-celler som (figur 3BC). Dette viser, at kometen analysen kan bruges til at vurdere DNA integritet ikke kun i somatiske celler18,19 , men også i pluripotente stamceller21.

Frisk opdelte iPS cardiomyocytes (iPS-CMs), iPS-CMs kulturperler for 6 måneder (forlænget kultur [PC]) og iPS-CMs behandlet med Doxo blev udsat for γH2A.X immunolabeling. Repræsentative micrographs af γH2A.X immunolabelling er vist i figur 4A (lavere forstørrelse) og figur 4B (højere forstørrelse). Antallet af γH2A.X foci (DDR foci) (punctae) i hver kerne er kvantificeret, ved hjælp af CellProfiler med brugerdefinerede pipeline moduler (figur 5A-L). Procentdelen af celler, der er positive for γH2A.X inddeles i kerner med nul til fem punctae og kerner med mere end 10 punctae. I kontrol iPS-CM, mere end 90% af celler havde mindre end fem DDR foci per kerner, og mindre end 10% af cellerne i alt havde mere end seks DDR foci per kerner (figur 4 c, control [Ctrl]). iPS-CMs kulturperler for 6 måneder havde mindre end 90% celler med mindre end fem DDR foci per kerner, og i alt mere end 13% af cellerne havde mere end seks DDR foci per kerner (figur 4 c, PC), mens Doxo-behandlet iPS CM viste mindre end 80% af celler med les s end fem DDR foci per kerner, og alt omkring 24% af cellerne havde mere end seks DDR foci per kerner (figur 4 c, Doxo). Disse data viser klart, at langvarig cellekultur og Doxo behandling fremkalde betydelige DNA skader i iPS-CMs og er ikke egnet til celle transplantation.

Figure 1
Figur 1: skematisk af comet assay. (A) Mix cellesuspension med lavt smeltepunkt Agarosen og (B) Anbring det på et glas dias. (C) behandle det med celle lysisbuffer, efterfulgt af en alkalisk opløsning, at få Xanthophyta der indeholder supercoiled DNA. (D) Electrophorese og plette DNA ved hjælp af SYBR green DNA farvestof. (E) skematisk af intakt (venstre) og beskadigede DNA (højre, comet form). (F) formel til at beregne en brøkdel af DNA skade og halen øjeblik. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: DNA skader og halen øjeblik kvantificering af ImageJ. (A-C) Screenshots af ImageJ, med comet analyse plugin viser et udvalg af comet hoved og hale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Doxorubicin inducerer DNA-skader i humant iPS-celler. (A) DNA skader i behandlet med doxorubicin (Doxo) og nontreated (kontrol) iPS-celler, analyseret ved hjælp af comet assay. (B) brøkdel af DNA-skader (n = 3) og (C) halen øjeblik (n = 63 kometer) kvantificeres ved hjælp af comet assay. Behandling med doxorubicin, en DNA-intercalating agent, steget betydeligt brøkdel af DNA skade og halen øjeblik i iPS-celler. Data er middel ± SEM. *P < 0,05, studerende er parrede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: DNA skade svar i iPS-afledte cardiomyocytes. (A) DNA skader svar markør γH2A.X identificeret ved immunfluorescens i behandlet med doxorubicin (Doxo) og nontreated (kontrol) iPS-cardiomyocytes samt langvarig kultur iPS-cardiomyocytes (PC). (B) højere forstørrelse af γH2A.X (grøn punctae) mærkning på lokaliteter af DNA-skader i iPS-CMs. (C) kvantificering DDR foci, analyseret ved hjælp af CellProfiler med brugerdefinerede pipeline moduler. Data er middel ± SD; n = 3 til 4. P < 0,05, studerende er parrede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: automatiseret DNA skader svar analyse af CellProfiler. (A-L) Screenshots af CellProfiler med angivne indstillinger for import af billeder, og automatiseret identifikation og kvantificering af γH2A.X punctae i iPS-CMs. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: automatiseret DNA skader svar analyse af CellProfiler. (A-F) Databilleder genereret af CellProfiler ved afslutningen af billedanalyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA integritet skildrer celle integritet. Celler med beskadiget DNA er ofte i stress og i sidste ende miste deres integritet. Integriteten af stammen og stammen-celle-afledte celler, som overføres til transplantation er vigtigste for cellerne til at udføre deres ønskede funktion. Transplantation af celler med beskadiget DNA ville resultere i en dårlig engraftment hastighed og ydeevne af celle8,20. Derfor er undersøger DNA integritet før celle transplantation en nødvendig kvalitetskontrol protokol. Her beskriver vi to omkostningseffektive metoder, nemlig den komet assay og γH2A.X immunofluorescens mærkning, for at vurdere de DNA-skader og kvaliteten i stamceller og stamceller-celle-afledte celler.

En væsentlig årsag til cellulær aldring menes at være ophobning af DNA-skader i celler. Bruger komet assay, analyseret Al-Baker et al. DNA-skader i unge og senescent human dermal fibroblaster22. Tidligere, har vi vist at transplantere DNA skade-fri hjerte stamceller isoleret fra en p53 Transgene mus steg antallet af engraftment i vært orgel8. For nylig, har vi vist rolle af domænet p53 transactivation i DNA skade reparation mekanismer i menneskelige iPS celler21. I begge undersøgelser, har vi ansat både komet assay og γH2A.X immunofluorescens mærkning metoder til at vurdere DNA-skader i stamceller. Begge disse metoder er omkostningseffektive og kan udføres med grundlæggende lab udstyr. En irriterende kritiske problem, som vi ofte oplevet er Agarosen solidifying i pipetten og rør. Vi overvinde problemet ved prewarming alle rør og tips før pipettering agarosegelelektroforese. Mens komet analysen tager op til 2 dage at fuldføre, kan optimeret γH2A.X immunofluorescens mærkning procedure udføres i under 4 h.

Menneskelige iPS cellekulturer med mere end 10% DNA-skader, målt ved komet assay, ikke effektivt differentiere i cardiomyocytes (data ikke vist) i vitro. Komet assay er følsomme og dynamisk vurdering af DNA-skader i stamceller. DNA integritet vurderinger i visse celler, såsom iPS-afledte cardiomyocytes, er dog tung af comet assay på grund af karakteren af celler. Cardiomyocytes er beriget med troponin, sarcomeric proteiner og udskilles ekstracellulære matrix proteiner. Denatureringen disse komplekse strukturer at gøre supercoiled er DNA og dets reproducerbarhed tvivlsom. Vigtigst, 25-40% af menneskelige cardiomyocytes er binucleated25, og disse procentdele varierer i iPS-afledte cardiomyocytes. Da cellevæggen er forstyrret i komet assay, er den præcise vurdering af procentdelen af DNA-beskadigede celler umuligt. Derfor, i tilfælde af iPS-CMs, γH2A.X immunofluorescens mærkning procedure for vurdering af DNA-skader er en forsimplet alternativ til comet assay.

Baseret på disse resultater og de fra tidligere udgivelser af vores gruppe8,20,21, foreslår vi, at hvis der er mere end 10% DNA-skader, vurderet af comet assay, eller mindre end 90% af cellerne har nul til fem DDR Foci, så kultur bør blive diskvalificeret for celle transplantation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet i en del af National Heart, Lung, og Blood Institute tilskud RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 og UO1-HL-134764 (til J. Zhang) og af American Heart Association videnskabelige udvikling Grant 17SDG33670677 (til R. Lars).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		 Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  2. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  3. Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
  4. Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
  5. Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
  6. Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
  7. Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
  8. Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
  9. Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
  10. Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
  11. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  12. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  13. Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
  14. Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
  15. Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
  16. Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
  17. Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
  18. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  19. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  20. Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
  21. Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
  22. Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
  23. Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
  24. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
  25. Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).

Tags

Genetik spørgsmålet 143 DNA integritet DNA-skader iPS-celler comet assay γH2A.X cardiomyocytes celle transplantation
Vurdering af stamceller DNA integritet for kardiale celleterapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, J. M., Mardhekar, N. M.,… More

Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter