Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58971
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een experimentele opstelling voor een analyse van de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen van de stam voorafgaand aan de transplantatie van de cel.

Abstract

Stam en de stam-cel-afgeleide cellen hebben enorme potentieel als een regeneratieve therapie voor verschillende degeneratieve ziekten. DNA is de opslagplaats van genetische gegevens in alle cellen, met inbegrip van stamcellen, en zijn integriteit is fundamenteel voor het regeneratieve vermogen. Stamcellen ondergaan snelle voortplanting in laboratoria te bereiken van de vereiste aantallen voor transplantatie. Versnelde celgroei leidt tot het verlies van DNA integriteit door geaccumuleerde metabolieten, zoals reactieve zuurstof carbonyl en alkylerende agentia. Verplanten van deze cellen zou resulteren in slecht engraftment en regeneratie van het verslechterende orgaan. Bovendien, overplanten DNA-beschadigde cellen leidt tot instabiliteit van het DNA, mutaties, cellulaire senescentie, en eventueel, levensbedreigende ziekten zoals kanker. Daarom is er dringend behoefte aan een methode voor de controle van de kwaliteit te evalueren van de cel geschiktheid voor transplantatie. Hier, bieden wij stapsgewijze protocollen voor de beoordeling van de betrouwbaarheid van de DNA van stamcellen voorafgaand aan de transplantatie van de cel.

Introduction

Experimentele en klinische bewijs toont aan dat cel transplantatie kan matig prestaties linkerventrikel contractiele van falende hart1,2,3,4,5 ,6,,7,,8,9. Recente vooruitgang hebt geopend verder aantrekkelijke mogelijkheden voor cardiovasculaire regeneratie; Deze omvatten de gedwongen uitdrukking van herprogrammering factoren in somatische cellen veroorzaken pluripotent te differentiëren deze geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) in verschillende cardiale lineages, belangrijker cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. het erfelijk materiaal in elke cel, inclusief de kunstmatig geproduceerde iPSCs en de iPSC-afgeleide CM (iPS-CM), is DNA. De genetische instructies worden opgeslagen in DNA dicteert de groei, ontwikkeling en functie van cellen, weefsels, organen en organismen. DNA is niet inert; cel metabolieten, zoals reactieve zuurstof, carbonyl en stikstof soorten, en alkylerende agentia kan oorzaak DNA beschadigen in vitro en in vivo14,15,16,17. Belangrijker, optreedt DNA schade intuïtief in elke cel, met een grote frequentie. Als deze schade worden niet gecorrigeerd, zal dit leiden tot DNA mutatie, cellulaire senescentie, het verlies van DNA en cel integriteit, en eventueel ook ziekten, met inbegrip van levensbedreigende kankers. Behoud van de integriteit van het DNA is daarom essentieel om een willekeurige cel, vooral iPSCs, die heeft een enorm potentieel in de kliniek.

Voor de beoordeling van de hoeveelheid en de integriteit van geïsoleerde genomic DNA, is dure apparatuur beschikbaar op de markt. Er zijn echter geen eenvoudige en kosteneffectieve methoden voor de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen zonder de cellen te isoleren. Gebruiker-geïnduceerde DNA afbraak tijdens DNA-isolatie is bovendien één van de grote nadelen bij het gebruik van deze methoden. De eencellige gel elektroforese (bekend als de komeet assay)18,19 en γH2A.X immunolabeling8 technieken zijn fundamentele benaderingen in onderzoek labs voor de beoordeling van de DNA-beschadiging. Deze twee methoden vereisen geen dure apparatuur of geïsoleerde genomic DNA te analyseren DNA integriteit8,20,21. Aangezien zijn deze technieken uitgevoerd met hele cellen; gebruiker-geïnduceerde DNA/RNA/eiwit-afbraak tijdens de bereiding van de monsters zal niet van invloed op deze protocollen. Hier, om te beoordelen van de schade van DNA en DNA schade reactie in de stam en de stam-cel-afgeleide cellen, bieden wij stapsgewijze protocollen voor het uitvoeren van zowel de komeet-assay en γH2A.X de immunolabeling. Bovendien, het combineren van deze twee benaderingen, stellen wij voor een naïeve beoordeling die kan worden gebruikt voor het evalueren van de cel geschiktheid voor transplantatie.

De komeet assay, of eencellige gel elektroforese, meet de einden van het DNA in cellen. Cellen die zijn ingesloten in lage-smelten agarose zijn lysed naar formulier nucleoids met supercoiled DNA. Bij elektroforese migreren kleine stukjes van gefragmenteerde DNA en gebroken DNA-strengen door de agarose poriën, overwegende dat het intact DNA, vanwege hun enorme omvang en hun vervoeging met de matrix eiwitten, zal een beperkte migratie hebben. Het patroon van gebeitst DNA onder een fluorescentie Microscoop bootst een komeet. Het hoofd van de komeet bevat intact DNA en de staart is samengesteld uit fragmenten en gebroken DNA-strengen. De Fractie van de schade van DNA kan worden gemeten door de intensiteit van de fluorescentie van de beschadigde DNA (de staart van de komeet) ten opzichte van de intact DNA (komeet hoofd) intensiteit. De parameter staart moment kan worden berekend zoals aangegeven in Figuur 1.

DNA-beschadigingen induceert de fosforylatie van Histon H2A. X (γH2A.X) op Ser139 door ATM, ATR en DNA-PK kinases. De fosforylatie en rekrutering van H2A. X op DNA strand einden heet DNA schade reactie (DDR) en gebeurt snel nadat DNA is beschadigd. Na dit proces, celcyclus checkpoint-gemedieerde arrestatie en DNA reparatie processen in gang zijn gezet. Na de succesvolle voltooiing van DNA-herstel, is γH2A.X gedefosforyleerd en geïnactiveerd door fosfatasen genaamd. Verlengd en meerdere DNA strand einden leiden tot de opeenstapeling van γH2A.X foci in DNA. Hiermee wordt aangegeven van de cel onvermogen om te herstellen van de DNA-beschadiging en het verlies van DNA integriteit. Deze γH2A.X foci in DNA kunnen worden geïdentificeerd door en het aantal DDR foci kan worden geteld met behulp van het protocol in sectie 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de komeet Assay

  1. Bereiding van het reagens
    1. Voor lage-smeltpunt agarose, plaats van 500 mg van lage-smelten agarose in 100 mL DNA- / RNA-gratis water. Verwarm de fles in de magnetron totdat het agarose oplost. Plaats de fles in een waterbad 37 ° C totdat het nodig is.
      Opmerking: Zie voor verder lezen, Azqueta et al., die de effecten van agarose concentratie op de DNA-ontspannen tijd en verschillende elektroforese factoren23 bestudeerde.
    2. Verdun DNA SYBR groene kleurstof in Tris-EDTA (TE) Buffer bij een verhouding van 1:10,000 een 1 x voorraad kleurstof werkoplossing te verkrijgen. Deze kleurstof lichtgevoelig is, dus sla deze op een donkere plaats.
    3. Voor de cellysis-buffermengsel, ontbinden 100 mL lysisbuffermengsel (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) in gedeïoniseerd water (DI H2O). Voeg vervolgens 10 M NaOH om Breng de pH op 10.0. Koel de buffer tot 4 ° C.
    4. Voor de alkalische DNA-afwikkelen/elektroforese lopende buffer, los 1 L van alkalische oplossing (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) in DI H2O. Cool de buffer tot 4 ° C. Ervoor te zorgen dat de pH > 13.
    5. Voor voorgelakt komeet dia's, plaats een paar druppels van 0,5% agarose op een glasplaatje. Onmiddellijk, met behulp van het platte oppervlak van een andere dia, verspreid de agarose vormen een dunne laag van agarose coating.
      Opmerking: De dia's droog alvorens te gebruiken.
    6. Voor de cultuur van de cel van de iPS, kort cultuur cultuur iPS cellen in kelder-membraan-matrix-coated (Zie Tabel van materialen) platen in mTESR1 kweekmedium totdat confluentie is bereikt.
      Opmerking: IPS mens-cardiale-fibroblast-afgeleide cellen werden gebruikt in dit protocol. De herprogrammering van de iPS-cel afleiding en kweekomstandigheden wordt beschreven in de recente artikelen van ons onderzoek groep12,13,21.
  2. Bereiding van de monsters
    1. Negeren van het kweekmedium en wassen van de cellen. Distantiëren van de cellen met behulp van de oplossing van het detachement (Zie Tabel van materialen). Wassen van de cel pellet met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeer de cellen in PBS op 1 x 105 cellen/mL.
  3. Monster prepareren van objectglaasjes
    Opmerking: Voer de volgende stappen uit onder low-light voorwaarden om te voorkomen dat UV-licht-geïnduceerde celbeschadiging.
    1. Mix 10 μl celsuspensie en 90 μL van agarose oplossing (1:10 verhouding) in een buis. Plaats de buis in een waterbad 37 ° C om te voorkomen dat de agarose stollen.
    2. Meng de oplossingen zonder luchtbellen en Pipetteer 70 μL/plek op de dia die voorgelakt komeet. Met behulp van een pipet tip, verspreid de cel agarose mengsel aan het vormen van een dunne laag. Plaats de dia in 4 ° C gedurende 15 minuten.
    3. In een container, volledig dompelen de dia in koude lysis-buffermengsel. Plaats de container in het donker bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    4. Vervang de lysis-buffermengsel met koude alkalische. Zorg ervoor dat de dia's zijn volledig ondergedompeld. Plaats de container in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
  4. Elektroforese
    1. Plaats de dia in de tank van een horizontale elektroforese. Vul de tank met koude Elektroforese van alkalische buffer totdat de dia's zijn volledig ondergedompeld. Het toepassen van spanning aan 1 V/cm voor 15 tot 30 min.
      Opmerking: Total spanning = afstand tussen de elektroden x 1 V
    2. In een container, volledig dompelen de dia in koude DI H2O. Na 2 min, verwijder de DI H2O en voeg verse DI H2O. Herhaal deze stap toe.
    3. De DI H2O vervangen door koude 70% ethanol. Wacht 5 min. zachtjes verwijderen van de dia, niet kantelen, en laat het drogen.
    4. Eenmaal gedroogd, voeg 100 μl van verdunde DNA kleurstof naar elke plek. Wacht 15 minuten bij kamertemperatuur. Het gebruiken van een FITC-filter in een epifluorescence Microscoop, neem beelden van 50 tot 100 kometen in totaal per monster.
  5. Beeldanalyse en berekening van de resultaten
    1. Voor het scoren van de kometen, gebruiken de National Institutes of Health van (NIH) ImageJ met komeet assay plugin (ImageJ hier downloaden: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; download de plugin hier: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      Opmerking: De plug wordt geleverd met een PDF-instructie waarin alle details voor het uitvoeren van de analyse. Screenshots van de komeet analyse worden bovendien getoond in Figuur 2A-C. Representatieve komeet beelden van controle en Doxorubicine (Doxo)-behandelde iPS cellen en de kwantificering van de kometen zijn weergegeven in Figuur 3A-C.

2. DNA schade reactie

  1. Voorbereiding van het monster en reagens
    1. Voor een cultuur van de cel van de iPS-CM, cultuur iPS-CM cellen in kelder-membraan-matrix-coated (Zie Tabel van materialen) cultuur platen in RPMI medium aangevuld met B-27 (CMM) totdat confluentie is bereikt.
      Opmerking: Mens-iPS-cell-derived cardiomyocytes werden gebruikt in dit protocol. Het protocol voor iPS celdifferentiatie in cardiomyocytes kan worden gevonden in de recente artikelen van ons onderzoek groep12,13,21.
    2. Zaad iPS-CMs in kamer dia's.
      1. Gooi het kweekmedium de iPS-CM-putjes. Wassen van de cellen drie keer met PBS.
      2. Voeg 1 mL trypsine van 0,25% per putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten Check de plaat onder een Microscoop voor mobiele-detachement. Voeg 1 mL CMM om te stoppen met de trypsine.
      3. Breng celsuspensie in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 min bij 4 ° C en 200 x g. Negeren van het medium, voeg 1 mL CMM en resuspendeer de cellen. Cellen tellen en de telling van de cel om te verkrijgen van 20 x 105 cellen in 1.6 mL CMM aan te passen.
      4. Zaad 200 µL celsuspensie per putje van de kamer 8-well schuif (Zie Tabel van materialen). Tik op de dia voorzichtig om te verspreiden van de cellen naast de waterput en Incubeer bij 37 ° C.
    3. Voor de behandeling van de iPS-CM Doxorubicine, gooi het kweekmedium de iPS-CM-putjes. Wassen van de cellen met PBS. De cellen met 1 μM Doxorubicine behandelen en CMM voor 4 h. gecombineerd van het medium en wassen van de cellen met PBS.
    4. Voor de buffer met blokkerend, bereiden 10 mL bovien serumalbumine (BSA) oplossing met 3% BSA en 0,05% Triton X-100. Ter voorbereiding van 10 mL blokkeerbuffer, voeg 1 mL normale ezel serum tot 9 mL bereide oplossing van de BSA.
    5. Voor de oplossing van het primaire antilichaam, toevoegen 1 μL van anti-konijn phospho-Histon H2A. X (Ser139) antilichaam aan 200 μL van de buffer met blokkerend.
    6. Voor het secundair antilichaam mix, 1 μL van fluorescerende-geconjugeerde anti-konijn secundair antilichaam, DAPI en fluorescerende-geconjugeerde phalloidin aan 200 μL van de buffer met blokkerend te toevoegen.
  2. Immunolabeling
    1. Wassen van de cellen driemaal met PBS en 200 μL van vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen aan elk putje. De cellen gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur vast te stellen. Wassen van de cellen met PBS.
    2. Verwijder de PBS en voeg 200 l blokkeerbuffer per goed en blok gedurende 30 minuten in een bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeerbuffer en voeg 200 l primair antilichaam oplossing. Incubeer gedurende 45 min. in een donkere, bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur. Vervolgens was de putjes drie keer met PBS.
    3. Verwijder de PBS en 200 μL van secundair antilichaam mix toevoegen. Incubeer gedurende 45 min. in een donkere, bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur. Vervolgens was de putjes drie keer met PBS. Wassen met DI H2O vóór hen met antifade te monteren. Plaats een dekglaasje en de dia's opslaan in het donker bij 4 ° C.
    4. Met behulp van een Microscoop epifluorescence, nemen drie tot vijf beelden van willekeurige velden per monster, zoals weergegeven in figuur 4A, en overgaan tot beeldanalyse.
  3. Tellen van de DDR foci
    1. Download en installeer CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
    2. Opmerking: Beeldverwerking in deze studie werd uitgevoerd met behulp van CellProfiler versie 2.1.1. Tutorials voor CellProfiler die werden gebruikt kunnen elders worden gevonden (lijst & https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk = PL7CC87670239B4D10). Als een nieuwere versie van CellProfiler wordt gebruikt, nodig de pijpleiding kleine aanpassingen.
    3. Download de pijpleiding punctae_gH2AX.cpipe. Selecteer bestand > importeren > pijpleiding uit het bestand en kies punctae_gH2AX.cpipe.
    4. Drag-and-drop de map met de verworven beelden van γH2A.X foci naar het venster van de bestandslijst in de sectie van de Input modules/Images voor analyse (figuur 5A). Volg de aanwijzingen zoals aangegeven in Figuur 5A-L.
    5. Stel de volgende parameters voor de beelden:
      1. Sleep de gewenste afbeelding voor analyse naar de bestandenlijst. Selecteer onder Input modules, beelden (Zie figuur 5A voor module-instellingen). Selecteer in Input modules, metagegevens (Zie figuur 5B voor module-instellingen). Selecteer in Input modules, NamesAndTypes (Zie figuur 5C voor module-instellingen).
      2. Voor groepen, selecteert u geen. Selecteer in modules van de analyse, ColorToGray (Zie figuur 5D voor module-instellingen).
    6. Selecteer in modules van de analyse, glad (Zie figuur 5E voor module-instellingen).
      Opmerking: Deze waarde moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de resolutie van de afbeelding.
    7. Selecteer in modules van de analyse, IdentifyPrimaryObjects (Zie figuur 5F voor module-instellingen).
      Opmerking: Het optimaliseren van deze waarden om ervoor te zorgen dat de hele kern is geselecteerd. Na deze stap, kan de computer lag.
    8. Selecteer in modules van de analyse, glad (Zie Figuur 5 g voor module-instellingen).
      Opmerking: Deze waarde moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de resolutie van de afbeelding.
    9. Selecteer in modules van de analyse, EnhanceOrSuppressFeatures (Zie Figuur 5 H voor module-instellingen).
    10. Selecteer in modules van de analyse, IdentifyPrimaryObjects (Zie figuur 5I voor module-instellingen).
      Opmerking: Het optimaliseren van deze waarden om ervoor te zorgen dat de punctae worden geselecteerd. Na deze stap, kan de computer weer vertraging.
      1. Selecteer in modules van de analyse, RelateObjects (Zie figuur 5J voor module-instellingen). Selecteer in modules van de analyse, ClassifyObjects (Zie Figuur 5 K voor de module instellingen). Selecteer in modules van de analyse, ExportToSpreadsheet (Zie Figuur 5 L voor module-instellingen).
      2. Klik op Analyseren beelden op de linker onderkant aan te sluiten beeld analyses uit te voeren. Op de succesvolle voltooiing van de analyse, meerdere afbeeldingen worden gegenereerd (Figuur 6A-F).
        Opmerking: Gebruikers moeten deze beelden voor toekomstig gebruik opslaan.
      3. Opmerking het CSV-bestand met de kwantitatieve gegevens voor verdere analyse die is gegenereerd en opgeslagen in de juiste locatie op de computer. In het werkblad genaamd MyExpt_Image, zal de kolommen B en D hebben het aantal kernen die beschikken over maximaal vijf en meer punctae, respectievelijk. Voeg de kolommen B en D te krijgen van het totale aantal kernen.
    11. Herhaal stap 2.3.3 - 2.3.8 voor alle afbeeldingen (Wijzig de bestandsnaam van de MyExpt_ vóór elke analyse). Percelen kunnen worden gemaakt voor de beoordeling van de integriteit van het DNA, zoals weergegeven in figuur 4C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn gekweekt en de DNA-beschadiging en het moment van de staart, die werden gebruikt als een maatregel van DNA integriteit, werden geanalyseerd door bepaling van de komeet. iPS cellen werden ingesloten in lage-smeltpunt agarose en geplaatst op een glasplaatje. De cellen werden, vervolgens behandeld met lysis-buffermengsel, gevolgd door een alkaline oplossing, te verkrijgen supercoiled DNA. Nucleoids waren electrophoresed en kometen waren gevisualiseerd door DNA kleurstof (figuur 1A-D). De kometen zijn, vervolgens geanalyseerd met ImageJ, met behulp van de komeet assay plugin (figuur 2A-C).

Menselijke iPS cellen werden behandeld met Doxo voor het opwekken van DNA-beschadiging en moet als positieve controle worden gebruikt. Representatieve microfoto van kometen uit Doxo-behandeld en nontreated iPS cellen worden weergegeven in figuur 3A. Een basale hoeveelheid DNA schade werd gevonden in iPS cellen, uitgedrukt in een breuk van DNA schade en staart moment. Echter, de Doxo behandeling steeg de DNA-beschadiging in iPS cellen als verwacht (figuur 3BC). Dit toont aan dat de komeet-bepaling kan worden gebruikt voor het beoordelen van DNA integriteit niet alleen in somatische cellen18,19 , maar ook in pluripotente stamcellen21.

Vers gedifferentieerde iPS cardiomyocytes (iPS-CMs), iPS-CMs gekweekte voor 6 maanden (langdurige cultuur [PC]), en iPS-CMs met Doxo behandeld werden onderworpen aan γH2A.X immunolabeling. Representatieve microfoto van γH2A.X immunolabelling staan in figuur 4A (lagere-vergroting) en figuur 4B (hoger-vergroting). Het aantal γH2A.X foci (DDR foci) (punctae) in elke celkern worden gekwantificeerd, CellProfiler met aangepaste pijpleiding modules (figuur 5A-L). Het percentage van cellen die positief voor γH2A.X zijn worden ingedeeld in de kernen met nul tot vijf punctae en kernen met meer dan 10 punctae. Meer dan 90% van de cellen had minder dan vijf DDR foci per kernen in de controle iPS-CM, en een totaal van minder dan 10% van de cellen had meer dan zes DDR foci per kernen (figuur 4C, controle [Ctrl]). iPS-CMs gekweekt voor 6 maanden had minder dan 90% cellen met minder dan vijf DDR foci per kernen, en een totaal van meer dan 13% van de cellen had meer dan zes DDR foci per kernen (figuur 4C, PC), terwijl de Doxo behandelde iPS-CM bleek minder dan 80% van de cellen met de les s dan vijf DDR foci per kernen, en een totaal van ongeveer 24% van de cellen had meer dan zes DDR foci per kernen (figuur 4C, Doxo). Deze gegevens toont duidelijk aan dat langdurige celkweek en Doxo behandeling aanzienlijke DNA schade in iPS-CMs veroorzaken en niet geschikt voor transplantatie van de cel zijn.

Figure 1
Figuur 1: schematische van de komeet assay. (A) Mix de celsuspensie met lage-smeltpunt agarose en (B) plaats het op een glasplaatje. (C) behandelen met cellysis-buffermengsel, gevolgd door een basische oplossing, om nucleoids met supercoiled DNA. (D)-Electrophorese en vlek het DNA met behulp van DNA SYBR groene kleurstof. (E) schema van intact (links) en beschadigde DNA (recht, komeet vorm). (F) formule voor het berekenen van een fractie van het DNA-schade en staart-moment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: DNA schade en staart moment kwantificering door ImageJ. (A-C) Screenshots van ImageJ, met de komeet analyse plugin toont een selectie van de komeet kop en staart. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Doxorubicine induceert de schade van DNA in menselijke iPS cellen. (A) DNA schade in Doxorubicine behandeld (Doxo) en nontreated (controle) iPS cellen geanalyseerd met behulp van de bepaling van de komeet. (B) breuk van DNA-schade (n = 3) en (C) staart moment (n = 63 kometen) gekwantificeerd aan de hand van de bepaling van de komeet. Behandeling met Doxorubicine, een DNA-intercalating agent, aanzienlijk verhoogd de breuk van DNA schade en staart moment in iPS cellen. Gegevens zijn middelen ± SEM. *P < 0,05, Student de ongepaarde t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: DNA schade reactie in cardiomyocytes iPS afkomstige. (A) DNA schade antwoord marker γH2A.X geïdentificeerd met immunofluorescentie in Doxorubicine behandeld (Doxo) en nontreated (controle) iPS-cardiomyocytes, alsmede verlengd cultuur iPS-cardiomyocytes (PC). (B) hogere vergroting van γH2A.X (groene punctae) labeling op de sites van DNA-beschadiging in iPS-CMs. (C) kwantificering van DDR foci, geanalyseerd met behulp van CellProfiler met aangepaste pijpleiding modules. Gegevens zijn middelen ± SD; n = 3 tot en met 4. P < 0,05, Student de ongepaarde t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: geautomatiseerde analyse van de reactie van het schade van DNA door CellProfiler. (A-L) Screenshots van CellProfiler met de opgegeven instellingen voor het importeren van de beelden, en de geautomatiseerde identificatie en kwantificering van γH2A.X punctae in iPS-CMs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: geautomatiseerde analyse van de reactie van het schade van DNA door CellProfiler. (A-F) Gegevens afbeeldingen gegenereerd door CellProfiler bij de voltooiing van de beeldanalyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA integriteit portretteert cel integriteit. Cellen met beschadigde DNA zijn vaak in spanning en uiteindelijk verliezen hun integriteit. De integriteit van de stam en de stam-cel-afgeleide cellen die worden doorgegeven ten behoeve van de transplantatie is het belangrijkste voor de cellen om hun gewenste functie te vervullen. Verplanten van cellen met beschadigde DNA zou resulteren in een slechte engraftment snelheid en prestaties van de cel8,20. Daarom is onderzoekt de integriteit van DNA vóór cel transplantatie een noodzakelijke kwaliteitscontrole-protocol. Hier beschrijven we twee kosteneffectieve benaderingen, namelijk de komeet assay en γH2A.X immunofluorescentie etikettering, om de DNA-beschadiging en de kwaliteit van de stam en de stam-cel-afgeleide cellen te beoordelen.

Een belangrijke oorzaak van cellulaire veroudering wordt beschouwd als de accumulatie van de schade van DNA in cellen. Met behulp van de bepaling van de komeet, Al-Baker et al. de DNA-beschadiging in jonge en verouderend menselijke dermale fibroblasten22geanalyseerd. Eerder, hebben wij aangetoond dat transplanteren DNA schade-vrije cardiale voorlopercellen geïsoleerd uit een p53 transgene muis steeg het aantal engraftment in de gastheer orgel8. Onlangs, hebben wij de rol van het p53 transactivation domein zien in DNA schade reparatie mechanismen in menselijk iPS cellen21. In beide studies, hebben wij zowel de komeet assay en γH2A.X immunofluorescentie labeling van methodologieën voor de beoordeling van de DNA-beschadiging in stamcellen werkzaam. Beide methoden zijn kosteneffectief en kunnen worden uitgevoerd met fundamentele lab apparatuur. Een vervelend kritieke probleem dat we vaak ervaren is agarose stollen in de pipet en buizen. We overwinnen dit probleem door alle buizen en tips vóór pipetting agarose prewarming. Terwijl de komeet assay maximaal 2 dagen neemt te voltooien, kan de geoptimaliseerde γH2A.X immunofluorescentie labeling procedure worden uitgevoerd in onder 4 h.

Menselijke iPS celculturen met meer dan 10% DNA-beschadiging, gemeten door de komeet assay, deed niet efficiënt onderscheiden in cardiomyocytes (gegevens niet worden weergegeven) in vitro. De bepaling van de komeet is gevoelig en dynamische bij de beoordeling van de schade van DNA in cellen van de stam. Beoordeling van de integriteit van de DNA in bepaalde cellen, zoals iPS-afgeleide cardiomyocytes, zijn echter omslachtig door komeet assay vanwege de aard van de cellen. De cardiomyocytes worden verrijkt met troponine, sarcomeric eiwitten en de secreted extracellulaire matrix-proteïnen. Deze complexe structuren te maken supercoiled denaturering zijn DNA en de reproduceerbaarheid twijfelachtig. Belangrijkst, 25% tot 40% van menselijke cardiomyocytes zijn binucleaire25, en deze percentages variëren in cardiomyocytes iPS-afgeleide. Aangezien de celwand wordt verstoord in de bepaling van de komeet, is de nauwkeurige aanduiding van het percentage van de DNA-beschadigde cellen niet onmogelijk. Daarom, in het geval van iPS-CMs, de γH2A.X immunofluorescentie labeling procedure voor het beoordelen van de schade van DNA is een simplistisch alternatief voor de komeet assay.

Gebaseerd op deze resultaten en die uit vorige publicaties van onze groep8,20,21, wij stellen voor dat, als er meer dan 10% DNA-beschadiging, beoordeeld door de komeet assay, of minder dan 90% van de cellen hebben nul tot vijf DDR Foci, dan de cultuur moet worden gediskwalificeerd voor transplantatie van de cel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Heart, Lung en bloed Instituut subsidies RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 en UO1-HL-134764 (met J. Zhang) en door de American Heart Association wetenschappelijke ontwikkeling Grant 17SDG33670677 (met R. Kannappan).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		 Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  2. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  3. Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
  4. Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
  5. Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
  6. Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
  7. Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
  8. Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
  9. Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
  10. Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
  11. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  12. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  13. Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
  14. Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
  15. Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
  16. Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
  17. Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
  18. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  19. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  20. Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
  21. Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
  22. Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
  23. Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
  24. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
  25. Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).

Tags

Genetica kwestie 143 integriteit van het DNA DNA-beschadiging iPS cellen komeet assay γH2A.X cardiomyocytes cel transplantatie
Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, J. M., Mardhekar, N. M.,… More

Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter