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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58971
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung des Versuchsaufbaus für eine Analyse der Bewertung der DNA-Integrität in Stammzellen vor Stammzelltransplantation.

Abstract

Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen haben immenses Potential als regenerative Therapie für verschiedene degenerative Krankheiten. DNA ist das Lagerhaus genetischer Daten in allen Zellen, einschließlich Stammzellen, und seine Integrität ist grundlegend für seine Regenerationsfähigkeit. Stammzellen werden schnelle Ausbreitung in Labors, die notwendigen Zahlen für die Transplantation zu erreichen. Beschleunigte Zellwachstum führt zum Verlust der DNA-Integrität durch angesammelte Stoffwechselprodukte wie reaktive Sauerstoff, Carbonyl und Alkylantien Agenten. Transplantation dieser Zellen führt zu schlechten Engraftment und Regeneration der sich verschlechternden Orgel. Darüber hinaus Umpflanzen DNA beschädigt Zellen führt zu Mutationen, DNA-Instabilität, zelluläre Seneszenz und möglicherweise lebensbedrohliche Krankheiten wie Krebs. Daher ist eine unmittelbare Notwendigkeit für eine Qualitätskontrollmethode, um die Zelle Eignung für Transplantationen zu bewerten. Hier bieten wir detaillierte Protokolle für die Beurteilung der DNA-Integrität der Stammzellen vor Stammzelltransplantation.

Introduction

Experimentelle und klinische Beweise zeigt, dass Zelltransplantation gemäßigt linken Ventrikel kontraktilen Ermangelung Herzen1,2,3,4,5 verbessern können ,6,7,8,9. Die jüngsten Fortschritte haben eröffnet weitere attraktive Möglichkeiten für kardiovaskuläre Regeneration; Dazu gehören die erzwungene Expression Neuprogrammierung Faktoren in somatischen Zellen induzieren Pluripotenz und differenzieren diese induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) in verschiedenen kardialen Linien, vor allem Cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. das Erbgut in jeder Zelle, einschließlich der künstlich erzeugten iPSCs und iPSC-abgeleitete CM (iPS-CM), ist die DNA. Die genetischen Anweisungen, die in der DNA gespeicherten diktiert die Wachstum, Entwicklung und Funktion von Zellen, Geweben, Organen und Organismen. DNA ist nicht träge; Handy-Metaboliten, wie reaktive Sauerstoff, Carbonyl und Stickstoff-Spezies, und Alkylantien Agenten kann Ursache Schäden an DNA in vitro und in-vivo-14,15,16,17. DNA-Schäden tritt vor allem intuitiv in jeder Zelle mit einer erheblichen Frequenz. Wenn diese Schäden nicht behoben sind, wird es zu DNA-Mutation, zelluläre Seneszenz, den Verlust der DNA und Zelle Integrität und gegebenenfalls Krankheiten, einschließlich lebensbedrohlichen Krebserkrankungen führen. Daher ist es wichtig, jede Zelle, besonders iPSCs, das enormes Potenzial in der Klinik hat, DNA-Integrität beizubehalten.

Für die Bewertung der Menge und der Integrität der isolierte genomische DNA, ist die teure Ausrüstung auf dem Markt verfügbar. Allerdings gibt es keine einfachen und kostengünstigen Methoden, um die Integrität der DNA in den Zellen zu beurteilen, ohne die Zellen zu isolieren. Benutzer-induzierten DNA-Abbau während der DNA-Isolierung ist übrigens einer der größten Nachteile im Umgang mit diesen Methoden. Die einzellige Gel-Elektrophorese (bekannt als Comet Assay)18,19 und γH2A.X Immunolabeling8 Techniken sind grundlegende Ansätze in Forschungslabors zur Bewertung von DNA-Schäden. Diese beiden Methoden benötigen keine teure Ausrüstung oder isolierte genomische DNA, DNA-Integrität8,20,21zu analysieren. Seitdem wurden diese Techniken mit ganzer Zellen durchgeführt; Benutzer-induzierten DNA/RNA/Proteinabbau während der Probenvorbereitung wird keine Auswirkungen auf diese Protokolle. Hier, um die DNA-Schäden und DNA-Schäden Antwort in Stamm und Stamm-abgeleitete Zellen zu beurteilen, bieten wir Ihnen Schritt für Schritt-Protokolle, um die Comet-Assay und γH2A.X der Immunolabeling durchführen. Darüber hinaus schlagen verbindet diese beiden Ansätze, wir eine naiv-Bewertung, die verwendet werden kann, um die Zelle Eignung für Transplantationen zu bewerten.

Die Comet-Assay oder einzellige gel-Elektrophorese, misst die DNA-Brüchen in den Zellen. Zellen in niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, Form ausgedehnt mit supercoiled DNA lysiert. Bei der Elektrophorese durchwandern kleine Stücke von fragmentierten DNA und gebrochenen DNA-Strängen die Agarose Poren, intakte DNA, aufgrund ihrer enormen Größe und ihre Konjugation mit dem Matrix-Protein, eine eingeschränkte Migration auswirken. Das Muster der gefärbten DNA unter dem Fluoreszenzmikroskop imitiert ein Komet. Der Kopf des Kometen enthält intakte DNA und die Rute besteht aus Fragmenten und gebrochen DNA-Stränge. Der Anteil der DNA-Schäden kann durch die Fluoreszenzintensität der beschädigten DNA (Kometenschweif) bezogen auf die intakte DNA (Kopf des Kometen) Intensität gemessen werden. Der Parameter Heck Moment kann berechnet werden, wie in Abbildung 1dargestellt.

DNA-Schädigung induziert die Phosphorylierung der Histone H2A. X (γH2A.X) am Ser139 von ATM, ATR und DNA-PK Kinasen. Die Phosphorylierung und Rekrutierung von H2A. X zu DNA-Strangbrüchen nennt man DNA-Schäden Antwort (DDR) und schnell geschieht, nachdem DNA beschädigt ist. Im Anschluss an diesen Prozess, Checkpoint-vermittelten Zellzyklus Festnahme und DNA-Reparaturprozesse initiiert. Nach dem erfolgreichen Abschluss der DNA-Reparatur ist γH2A.X Rezeptorsignals und durch Phosphatasen inaktiviert. Verlängert und mehrere DNA-Strangbrüchen führen zu die Ansammlung von γH2A.X Brennpunkte in der DNA. Dies zeigt die Zelle Unfähigkeit, die DNA-Schäden und dem Verlust der Integrität der DNA zu reparieren. Durch diese γH2A.X Brennpunkte in DNA identifiziert werden können und die Anzahl der DDR Brennpunkte kann unter Verwendung des Protokolls in Abschnitt 2 gezählt werden.

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Protocol

(1) Comet Assay

  1. Reagenz-Vorbereitung
    1. Für niedrige Schmelzpunkt Agarose 500 mg niedrig schmelzende Agarose in 100 mL DNA - Platz / RNA-freies Wasser. Erhitzen Sie die Flasche in der Mikrowelle, bis die Agarose auflöst. Stellen Sie die Flasche in einem 37 ° C Wasserbad bis benötigt.
      Hinweis: Weiter lesen, finden Sie unter Azqueta Et Al., die die Wirkungen von Agarose-Konzentration auf die DNA-Abbau-Zeit und mehrere Elektrophorese Faktoren23untersucht.
    2. Verdünnen Sie SYBR grün DNA-Farbstoff in Tris-EDTA (TE)-Puffer im Verhältnis 1: 10.000, 1 x Lager Farbstofflösung arbeiten zu erhalten. Dieser Farbstoff ist lichtempfindlich, also an einem dunklen Ort aufbewahren.
    3. Für die Zelle Lysis Puffer auflösen 100 mL Lyse-Puffer (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1 % Triton x-100) in entionisiertem Wasser (DI H2O). Fügen Sie 10 M NaOH zur Einstellung des pH-Wertes auf 10.0. Cool des Puffers, 4 ° C.
    4. Lösen Sie für den alkalischen DNA-Abbau/Elektrophorese laufenden Puffer 1 L alkalischer Lösung (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) in DI H2O. Cool den Puffer um 4 ° C auf. Achten Sie darauf, dass den pH-Wert > 13.
    5. Legen Sie ein paar Tropfen von 0,5 % Agarose bei vorbeschichteten Komet Dias auf einen Objektträger. Sofort, mit der flachen Oberfläche einer anderen Folie, verbreiten Sie die Agarose um eine dünne Schicht aus Agarose Beschichtung bilden.
      Hinweis: Trocknen Sie die Folien vor der Verwendung.
    6. Für iPS-Zellkultur kurz Kultur Kultur-iPS-Zellen im Keller-Membran-Matrix-beschichtet (siehe Tabelle der Materialien) Platten in mTESR1 Kulturmedium bis Konfluenz erreicht ist.
      Hinweis: Human-Herz-Kreislauf-Fibroblasten-abgeleitet von iPS-Zellen wurden in diesem Protokoll verwendet. Aktuelle Artikel aus unserer Forschung Gruppe12,13,21beschreibt die Reprogrammierung von IPS-Zellen Ableitung und Kulturbedingungen.
  2. Vorbereitung der Probe
    1. Verwerfen Sie das Kulturmedium zu und waschen Sie die Zellen. Die Zellen mit Ablösung Lösung zu distanzieren (siehe Tabelle der Materialien). Waschen Sie die Zelle Pellet mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Aufschwemmen der Zellen mit PBS-Puffer 1 x 105 Zellen/ml.
  3. Folie Probenvorbereitung
    Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter schlechten Lichtverhältnissen, UV-Licht-induzierte Zellschäden zu vermeiden.
    1. Mischung 10 μl Zellsuspension und 90 μL Agarose-Lösung (01:10 Verhältnis) in einem Rohr. Platzieren Sie das Rohr in einem 37 ° C Wasserbad zu verhindern, dass die Agarose erstarren.
    2. Mischen Sie die Lösungen ohne Luftblasen und pipette 70 μL/Spot auf der vorbeschichteten Komet-Folie. Mit einer Pipettenspitze verteilt die Zelle Agarose-Mischung, eine dünne Schicht zu bilden. Legen Sie die Folie in 4 ° C für 15 Minuten.
    3. In einem Behälter komplett eintauchen der Folie im kalten Lyse Puffer. Stellen Sie den Behälter im Dunkeln bei 4 ° C für 1 h.
    4. Ersetzen Sie die Lyse-Puffer mit kalten Lauge. Sicherstellen Sie, dass die Folien vollständig eingetaucht sind. Stellen Sie den Behälter im Dunkeln bei 4 ° C für 30 Minuten.
  4. Elektrophorese
    1. Legen Sie die Folie in einem horizontalen Elektrophorese-Tank. Füllen Sie den Tank mit kaltem alkalischen Elektrophorese Puffer, bis die Folien vollständig eingetaucht sind. Spannung 1 V/cm für 15 bis 30 min. anwenden.
      Hinweis: Gesamt-Spannung = Abstand zwischen den Elektroden X 1 V
    2. In einem Behälter komplett eintauchen der Folie im kalten DI H2O. Nach 2 min DI H2O und fügen Sie frische DI H2O. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    3. Ersetzen Sie die DI H2O mit kaltem 70 % igem Ethanol. Warten Sie 5 Minuten sanft entfernen die Folie, nicht kippen, und lassen es an der Luft trocknen.
    4. Sobald getrocknet, fügen Sie 100 μL der verdünnten DNA-Farbstoff an jeder Stelle. Warten Sie 15 min bei Raumtemperatur. Mit einem FITC-Filter in einem Epifluoreszenz-Mikroskop, Bilder von 50 bis 100 Kometen nehmen Sie insgesamt pro Probe.
  5. Bildanalyse und Berechnung der Ergebnisse
    1. Für die Wertung der Kometen, verwenden Sie die National Institutes of Health der (NIH) ImageJ mit Comet-Assay-Plugin (ImageJ hier herunterladen: Https://imagej.nih.gov/ij/download.html; das Plugin hier herunterladen: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      Hinweis: Das Plugin kommt mit einer PDF-Anleitung enthält alle Informationen, die Analyse durchzuführen. Darüber hinaus sind Screenshots der Komet Analyse in Abbildung 2A-Cgezeigt. Repräsentative Komet Bilder von Kontrolle und Doxorubicin (Doxo)-behandelten iPS-Zellen und die Quantifizierung der Kometen sind in Abbildung 3A-Cgezeigt.

(2) DNA-Schäden als Reaktion

  1. Probe und Reagenz Vorbereitung
    1. Für ein iPS-CM-Zellkultur Zellen Kultur iPS-CM im Keller-Membran-Matrix-beschichtet (siehe Tabelle der Materialien) Kultur Platten in RPMI Medium ergänzt mit B-27 (CMM) bis Konfluenz erreicht ist.
      Hinweis: Human-iPS-Zelle-derived Kardiomyozyten wurden in diesem Protokoll verwendet. Das Protokoll für iPS-Zell-Differenzierung in Kardiomyozyten finden Sie in den letzten Artikeln aus unserer Forschung Gruppe12,13,21.
    2. Samen iPS-CMs in Kammer Folien.
      1. Entsorgen Sie das Kulturmedium aus den iPS-CM-Brunnen. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
      2. Fügen Sie 1 mL Trypsin 0,25 % pro Bohrloch und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Check der Platte unter dem Mikroskop für Zelle ablösen. Fügen Sie 1 mL der CMM, die Trypsin zu stoppen.
      3. Legen Sie Zellsuspension in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 5 min bei 4 ° C und 200 X g. Entsorgen Sie das Medium, fügen Sie 1 mL der CMM und Aufschwemmen der Zellen. Zählen der Zellen und passen Sie die Zellzahl um 20 x 105 Zellen in 1,6 mL CMM zu erhalten.
      4. Samen 200 µL Zellsuspension pro Bohrloch der 8-Well-Kammer schieben (siehe Tabelle der Materialien). Tippen Sie auf die Folie vorsichtig, um die Zellen um den Brunnen zu verbreiten und bei 37 ° c inkubieren
    3. Verwerfen Sie für die iPS-CM Doxorubicin Behandlung das Kulturmedium aus den iPS-CM-Brunnen. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Behandeln Sie die Zellen mit 1 μM Doxorubicin und CMM für 4 Std. aspirieren Sie das Medium und die Zellen mit PBS waschen.
    4. Vorbereitung der blockierenden Puffer 10 mL Rinderserumalbumin (BSA) Lösung mit 3 % BSA und 0,05 % Triton x-100. Fügen Sie 1 mL normale Esel Serum um 10 mL blockierende Puffer vorzubereiten hinzu, 9 mL fertige BSA-Lösung.
    5. Fügen Sie für die primären Antikörper-Lösung 1 μl Anti-Kaninchen Phospho-Histon H2A hinzu. X (Ser139) Antikörper zu 200 μl blocking-Puffer.
    6. Fügen Sie für den sekundären Antikörper-Mix 1 μL Fluorochrom-konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper, DAPI und Fluorochrom konjugiert Phalloidin 200 μl blocking-Puffer hinzu.
  2. Immunolabeling
    1. Die Zellen dreimal mit PBS waschen und jedes gut 200 μL der frisch zubereitete 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen. Befestigen Sie die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit PBS.
    2. Entfernen der PBS und 200 μL der blockierenden Puffer pro Brunnen und Block für 30 min. in eine feuchte Kammer bei Raumtemperatur. Entfernen des blockierenden Puffers und 200 μl Primärantikörper Lösung. 45 min. in eine dunkle, feuchte Kammer bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Brunnen dreimal mit PBS.
    3. Entfernen der PBS und 200 μL der Sekundärantikörper Mischung. 45 min. in eine dunkle, feuchte Kammer bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Brunnen dreimal mit PBS. Waschen Sie mit DI H2O vor dem Einbau zusammen mit Antifade. Legen Sie ein Deckglas und speichern Sie die Folien im Dunkeln bei 4 ° C.
    4. Mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop, nehmen Sie drei bis fünf Bilder von Zufallsfelder pro Probe, wie in Abbildung 4Agezeigt, und fahren Sie mit Bildanalyse.
  3. Zählen der DDR Brennpunkte
    1. Downloaden Sie und installieren Sie CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
    2. Hinweis: Bildverarbeitung in dieser Studie erfolgte mittels CellProfiler Version 2.1.1. Tutorials für CellProfiler, die verwendet wurden, finden Sie an anderer Stelle (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & List = PL7CC87670239B4D10). Wenn eine neuere Version von CellProfiler verwendet wird, möglicherweise die Pipeline geringfügige Anpassungen erforderlich.
    3. Laden Sie die Pipeline punctae_gH2AX.cpipe. Wählen Sie Datei > Importieren > Pipeline aus der Datei und wählen Sie punctae_gH2AX.cpipe.
    4. Ziehen Sie den Ordner mit den erworbenen Bildern der γH2A.X Herde zum Fenster Datei-Liste im Abschnitt Input Module/Bilder für die Analyse (Abb. 5A). Dann folgen Sie den Anweisungen, wie in Abbildung 5A-Ldargestellt.
    5. Legen Sie die folgenden Parameter für die Bilder:
      1. Ziehen Sie das gewünschte Bild für die Analyse in der Dateiliste. Wählen Sie unter Input Module, Bilder (siehe Abb. 5A für Einstellungen des Moduls). Wählen Sie im Eingabe-Module, Metadaten (siehe Abbildung 5 b für die Einstellungen des Moduls). Wählen Sie im Eingabe-Module, NamesAndTypes (siehe Abbildung 5 Einstellungen des Moduls).
      2. Wählen Sie für Gruppen Nein. Wählen Sie im Analyse-Module, ColorToGray (siehe Abbildung 5 Einstellungen des Moduls).
    6. Wählen Sie im Analyse-Module, glatt (siehe Abbildung 5E für Einstellungen des Moduls).
      Hinweis: Diesen Wert müssen optimiert werden, abhängig von der Bildauflösung.
    7. Wählen Sie im Analyse-Module, IdentifyPrimaryObjects (siehe Abbildung 5F für Einstellungen des Moduls).
      Hinweis: Optimieren Sie diese Werte, um sicherzustellen, dass der ganze Kern ausgewählt ist. Nach diesem Schritt kann der Computer zurückbleiben.
    8. Wählen Sie im Analyse-Module, glatt (siehe Abbildung 5 Einstellungen des Moduls).
      Hinweis: Diesen Wert müssen optimiert werden, abhängig von der Bildauflösung.
    9. Wählen Sie im Analyse-Module, EnhanceOrSuppressFeatures (siehe Abbildung 5 H für die Einstellungen des Moduls).
    10. Wählen Sie im Analyse-Module, IdentifyPrimaryObjects (siehe Abbildung 5I für Einstellungen des Moduls).
      Hinweis: Optimieren Sie diese Werte um sicherzustellen, dass die Tränenpünktchen ausgewählt. Nach diesem Schritt kann der Computer wieder zurückbleiben.
      1. Wählen Sie im Analyse-Module, RelateObjects (siehe Abbildung 5J für Einstellungen des Moduls). Wählen Sie im Analyse-Module, ClassifyObjects (siehe Abbildung 5 K für die Einstellungen des Moduls). Wählen Sie im Analyse-Module, ExportToSpreadsheet (siehe Abbildung 5 L für die Einstellungen des Moduls).
      2. Klicken Sie auf Analysieren Bilder auf der linken Bodenplatte Bildanalyse durchführen. In den erfolgreichen Abschluss der Analyse werden mehrere Bilder erzeugt (Abb. 6A-F).
        Hinweis: Benutzer sollten diese Bilder für die spätere Verwendung speichern.
      3. Beachten Sie die CSV-Datei mit den quantitativen Daten zur weiteren Analyse, die erzeugt und in den entsprechenden Speicherort auf dem Computer gespeichert. In der Tabelle MyExpt_Imagegenannt haben Spalten B und D die Anzahl der Kerne, die bis zu fünf und mehr Tränenpünktchen, bzw. haben. Hinzufügen von Spalten B und D, um die Gesamtzahl der Kerne zu erhalten.
    11. Wiederholen Sie Schritt 2.3.3 - 2.3.8 für alle Bilder (ändern Sie den MyExpt_ Dateinamen vor jeder Analyse). Parzellen können zur Bewertung von DNA-Integrität, vorgenommen werden, wie in Abbildung 4dargestellt.

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Representative Results

Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gezüchtet wurden, und DNA-Schäden und der Schweif Moment, die als Maß für die DNA-Integrität verwendet wurden, wurden von Comet Assay untersucht. iPS-Zellen wurden in niedrigen Schmelzpunkt Agarose eingebettet und auf einen Objektträger gelegt. Die Zellen wurden, dann mit Lyse Puffer, gefolgt von einer alkalischen Lösung, supercoiled DNA erhalten behandelt. Ausgedehnt wurden electrophoresed und Kometen wurden durch DNA-Farbstoff (Abbildung 1A-D) visualisiert. Die Kometen waren, anschließend mit ImageJ, mit dem Comet-Assay-Plugin (Abbildung 2A-C) analysiert.

Menschliche iPS-Zellen wurden mit Doxo, DNA-Schäden zu induzieren und als Positivkontrolle verwendet werden behandelt. Repräsentative Mikrographen Kometen aus Doxo behandelt und aufbereitetem iPS-Zellen sind in Abbildung 3Adargestellt. IPS-Zellen, als Bruch von DNA-Schäden und Schweif Moment fand eine basale Menge an DNA-Schäden. Jedoch erwartet die Doxo Behandlung der DNA-Schäden in iPS-Zellen als erhöht (Abb. 3 bC). Dies zeigt, dass der Comet-Assay zur DNA-Integrität nicht nur in somatischen Zellen18,19 , sondern auch in pluripotente Stammzellen21Beurteilung herangezogen werden kann.

Frisch differenziert iPS Kardiomyozyten (iPS-CMs), iPS-CMs kultivierten für 6 Monate (verlängerte Kultur [PC]) und iPS-CMs mit Doxo behandelt, γH2A.X Immunolabeling ausgesetzt waren. Repräsentative Mikrographen γH2A.X Immunolabelling sind in Abbildung 4A (untere-Vergrößerung) und Abbildung 4 b (höhere Vergrößerung) dargestellt. Die Anzahl der γH2A.X Herde (DDR Herde) (Tränenpünktchen) in jedem Zellkern werden quantifiziert, mit CellProfiler mit benutzerdefinierten Pipeline Module (Abbildung 5A-L). Der Anteil der Zellen, die positiv für γH2A.X sind sind in Kernen mit Null bis fünf Tränenpünktchen und Kerne mit mehr als 10 Tränenpünktchen eingeteilt. In der Steuerung iPS-CM mehr als 90 % der Zellen hatte weniger als fünf DDR-Herde pro Kerne, und insgesamt weniger als 10 % der Zellen hatte mehr als sechs DDR-Herde pro Kerne (Abbildung 4, Steuerung [STRG]). iPS-CMs für 6 Monate kultiviert hatte weniger als 90 % Zellen mit weniger als fünf DDR-Schwerpunkten pro Kerne und insgesamt mehr als 13 % der Zellen hatten mehr als sechs DDR-Herde pro Kerne (Abbildung 4, PC), während die Doxo behandelt iPS-CM weniger als 80 % der Zellen mit Les zeigte s als fünf DDR-Herde pro Kerne und insgesamt etwa 24 % der Zellen hatten mehr als sechs DDR-Herde pro Kerne (Abbildung 4, Doxo). Diese Daten zeigen, dass längere Zellkultur und Doxo Behandlung erhebliche DNA-Schäden in iPS-CMs zu induzieren und eignen sich nicht für Stammzelltransplantation.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische des Comet-Assays. (A) Mix die Zellsuspension mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und (B) legen Sie es auf einen Objektträger. (C) mit Zelle Lysis Puffer, gefolgt von einer alkalischen Lösung zu ausgedehnt mit supercoiled DNA zu behandeln. (D)-Elektrophorese und beflecken die DNA mit SYBR green DNA-Farbstoff. (E) schematische Darstellung der intakt (links) und beschädigte DNA (rechts, Komet Form). (F) Formel zu einen Bruchteil des DNA-Schäden und Tail Augenblicks zu berechnen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: DNA-Schäden und Tail Moment Quantifizierung von ImageJ. (A-C) Screenshots von ImageJ, mit dem Comet-Analyse-Plugin zeigt eine Auswahl der Komet Kopf und Schwanz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Doxorubicin DNA-Schäden im menschlichen iPS-Zellen induziert. (A) DNA-Schäden in Doxorubicin behandelt (Doxo) und aufbereitetem (Kontrolle) iPS-Zellen, mit dem Comet-Assay analysiert. (B) Teil der DNA-Schäden (n = 3) und (C) Rute Moment (n = 63 Kometen) quantifiziert mit der Comet-Assay. Behandlung mit Doxorubicin, eine DNA-verschuppen Agent deutlich erhöht den Bruchteil von DNA-Schäden und Schweif Moment in iPS-Zellen. Daten sind Mittel ± SEM. *P < 0,05, Student der ungepaarten t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: DNA-Schäden Reaktion bei iPS-abgeleitete Herzmuskelzellen. (A) DNA Beschädigung Antwort Marker γH2A.X durch Immunfluoreszenz Doxorubicin behandelt (Doxo) und aufbereitetem (Kontrolle) iPS-Kardiomyozyten identifiziert sowie verlängerte Kultur iPS-Kardiomyozyten (PC). (B) höhere Vergrößerung des γH2A.X (grüne Tränenpünktchen) Kennzeichnung an den Standorten von DNA-Schäden in iPS-CMs. (C) Quantifizierung der DDR Herde, mit CellProfiler mit benutzerdefinierten Pipeline Module analysiert. Daten sind Mittel ± SD; n = 3 bis 4. P < 0,05, Student der ungepaarten t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: automatisierte Antwort Schadensanalyse DNA durch CellProfiler. (A-L) Screenshots von CellProfiler mit festgelegten Einstellungen für den Import der Bilder und die automatisierte Identifizierung und Quantifizierung der γH2A.X Tränenpünktchen in iPS-cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: automatisierte Antwort Schadensanalyse DNA durch CellProfiler. (A-F) Daten-Images erzeugt durch CellProfiler am Ende der Bildanalyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

DNA-Integrität schildert Zelle Integrität. Zellen mit beschädigter DNA sind häufig in Stress und schließlich ihre Integrität zu verlieren. Die Integrität der Stiel und Stamm-abgeleitete Zellen, die zum Zweck der Transplantation wird propagiert werden ist für die Zellen ihre gewünschte Funktion ausführen. Transplantation von Zellen mit beschädigter DNA führt zu einer schlechten Engraftment Rate und Leistung der Zelle8,20. Daher ist die Untersuchung der DNA-Integrität vor Stammzelltransplantation ein notwendigen Qualitätskontrolle-Protokoll. Hier beschreiben wir zwei kostengünstige Ansätze, nämlich der Comet-Assay und γH2A.X Immunfluoreszenz etikettieren, um die DNA-Schäden und die Qualität der Stammzellen und Stamm-abgeleitete Zellen zu beurteilen.

Eine der Hauptursachen der Zellalterung wird angenommen, dass die Anhäufung von DNA-Schäden in den Zellen. Mit der Comet-Assay, analysiert Al-Baker Et Al. die DNA-Schäden in jungen und alternde Menschen dermalen Fibroblasten22. Zuvor haben wir gezeigt, dass Topfen DNA beschädigungsfreie Herz-Vorläuferzellen von p53 transgenen Maus isoliert erhöht die Rate der Engraftment in der Host-Orgel-8. Vor kurzem haben wir die Rolle des Geschäftsfeldes p53 werden in DNA Reparatur Schadensmechanismen im menschlichen IPS-Zellen21gezeigt. In beiden Studien haben wir beide die Comet-Assay und γH2A.X Immunfluoreszenz Kennzeichnung Methoden zur Bewertung von DNA-Schäden in Stammzellen eingesetzt. Beide Methoden sind kostengünstig und mit grundlegenden Laborausrüstung durchgeführt werden können. Ein lästiges kritische Problem, das wir oft erlebt wird Agarose erstarren in der Pipette und Röhren. Wir überwinden dieses Problem durch prewarming alle Rohre und Tipps vor dem Pipettieren Agarose. Während der Comet-Assay bis zu 2 Tage in Anspruch nimmt, kann das optimierte γH2A.X Immunfluoreszenz Kennzeichnung Verfahren in unter 4 h abgeschlossen werden.

Menschliche iPS Zellkulturen mit mehr als 10 % DNA-Schäden, die durch die Comet-Assay gemessen nicht effizient zu unterscheiden in Herzmuskelzellen (Daten nicht gezeigt) in Vitro. Der Comet-Assay ist empfindlich und dynamisch bei der Bewertung von DNA-Schäden in Stammzellen. DNA-Integrität Bewertungen in bestimmten Zellen, wie iPS-abgeleitete Herzmuskelzellen sind jedoch umständlich durch Comet Assay aufgrund der Art der Zellen. Die Herzmuskelzellen sind mit Troponin, zugeschrieben, und die sekretierten extrazelluläre Matrixproteine angereichert. Denaturierung dieser komplexen Strukturen zu supercoiled sind DNA und ihrer Reproduzierbarkeit fragwürdig. Am wichtigsten ist, 25 % bis 40 % der menschlichen Kardiomyozyten sind binucleated25, und diese Prozentsätze variieren in Kardiomyozyten iPS abgeleitet. Da die Zellwand in der Comet-Assay gestört ist, ist die genaue Einschätzung der der Anteil der DNA-beschädigte Zellen unmöglich. Daher ist γH2A.X Immunfluoreszenz Kennzeichnung Verfahren zur Bewertung von DNA-Schäden bei iPS-CMs, eine vereinfachte Alternative für die Comet-Assay.

Basierend auf diesen Ergebnissen und denen aus früheren Veröffentlichungen von unserer Gruppe8,20,21, empfehlen wir, dass, wenn es mehr als 10 gibt % DNA-Schäden, anhand der Comet-Assay oder weniger als 90 % der Zellen haben null bis fünf DDR Herde, dann die Kultur sollte für Stammzelltransplantation disqualifiziert.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch nationale Herz-, Lungen- und Blut-Institut Stipendien RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 und UO1-HL-134764 (an J. Zhang) und durch die American Heart Association wissenschaftliche Development Grant 17SDG33670677 (zu R. Kannappan).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		 Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Genetik Ausgabe 143 DNA-Integrität DNA-Schäden iPS-Zellen Comet-Assay γH2A.X Herzzellen Stammzelltransplantation
Beurteilung Stem Cell DNA-Integrität für kardiale Zelltherapie
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Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

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