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Genetics

Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58971
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una instalación experimental para el análisis de la evaluación de la integridad del ADN en células antes del trasplante de la célula.

Abstract

Vástago y las células derivadas de células madre tienen enorme potencial como terapia regenerativa para diversas enfermedades degenerativas. El ADN es el almacén de la información genética en todas las células, incluyendo células madre, y su integridad es fundamental para su capacidad regenerativa. Las células madre experimentan rápida propagación en los laboratorios para alcanzar el número necesario para el trasplante. Crecimiento acelerado de células conduce a la pérdida de la integridad del ADN por metabolitos acumulados, tales como reactivo oxígeno carbonilo y agentes alquilantes. Transplante de estas células daría lugar a pobres engraftment y regeneración del órgano del deterioro. Por otra parte, el trasplante las células dañadas DNA conduce a mutaciones, inestabilidad del ADN, senescencia celular y posiblemente, mortales enfermedades como el cáncer. Por lo tanto, hay una necesidad inmediata de un método de control de calidad evaluar la idoneidad de la célula para el trasplante. Aquí, le ofrecemos protocolos paso a paso para la evaluación de la integridad del ADN de células antes del trasplante de la célula.

Introduction

Evidencia clínica y experimental demuestra que el trasplante de la célula moderado puede mejorar el rendimiento contráctil del ventrículo izquierdo de no corazones1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Los avances recientes se han abierto más atractivas oportunidades de regeneración cardiovascular; Estos incluyen la expresión forzada de los factores de reprogramación de células somáticas para inducir pluripotencia y distinguir estas células pluripotentes inducidas (iPSC) en diversos linajes cardíacos, lo importante de cardiomiocitos (CM)10, 11 , 12 , 13. el material hereditario en cada célula, incluyendo el iPSCs artificialmente generados y derivados de iPSC CM (iPS-CM), es el ADN. Las instrucciones genéticas almacenadas en el ADN determina el crecimiento, desarrollo y función de las células, tejidos, órganos y organismos. El ADN no es inerte; metabolitos, como el oxígeno reactivo, carbonilo y especies de nitrógeno, la célula y agentes alquilantes puede dañar ADN causa in vitro e in vivo14,15,16,17. Lo importante, daño de la DNA ocurre intuitivamente en cada célula, con una frecuencia significativa. Si no se corrigen estos daños, conducirá a la mutación de la DNA, senescencia celular, la pérdida de integridad de ADN y la célula y posiblemente, enfermedades, entre ellas cánceres mortales. Por lo tanto, conservar la integridad del ADN es esencial para cualquier célula, especialmente iPSCs, que tiene un enorme potencial en la clínica.

Para evaluar la cantidad e integridad del ADN genómico aislado, equipo costoso está disponible en el mercado. Sin embargo, no existen métodos simples y rentables para evaluar la integridad del ADN en las células sin aislar las células. Además, la degradación del ADN inducida por el usuario durante el aislamiento del ADN es uno de los principales inconvenientes en el uso de estos métodos. Las sola célula gel electroforesis (conocido como ensayo cometa)18,19 γH2A.X inmunomarcación8 técnicas y son los enfoques fundamentales en los laboratorios de investigación para la evaluación de daños en el ADN. Estos dos métodos no requieren equipos costosos o ADN genómico aislado para analizar ADN integridad8,20,21. Desde entonces, se han realizado estas técnicas con células enteras; degradación de DNA/RNA/proteína inducida por el usuario durante la preparación de la muestra no afecta a estos protocolos. Para evaluar el daño en el ADN y respuesta del daño de ADN en el tallo y las células derivadas de células madre, presentamos protocolos paso a paso para realizar la inmunomarcación γH2A.X y ensayo de cometa. Por otra parte, la combinación de estos dos enfoques, proponemos una evaluación ingenua que puede utilizarse para evaluar la idoneidad de la célula para el trasplante.

El ensayo cometa, o unicelulares electrophoresis del gel, las medidas de las roturas de ADN en las células. Células encajadas agarosa de bajo punto de fusión son lisis a nucleoids de forma que contengan ADN superenrollado. Sobre electroforesis, pequeños trozos de ADN fragmentado y hebras rotas de ADN migran a través de los poros de agarosa, mientras que el ADN intacto, debido a su enorme tamaño y su conjugación con la proteína de la matriz, tendrá una migración limitada. El patrón de ADN teñido con un microscopio de fluorescencia imita un cometa. La cabeza del cometa contiene ADN intacto y la cola está compuesta de fragmentos y rota filamentos de la DNA. La fracción del daño del ADN puede medirse por la intensidad de la fluorescencia del ADN dañado (cola de cometa) en relación con la intensidad de (cabeza del cometa) ADN intacta. El momento de la cola de parámetro puede calcularse como se muestra en la figura 1.

Daño del ADN induce la fosforilación de la histona H2A. X (γH2A.X) en Ser139 por quinasas ATM, ATR y DNA-PK. La fosforilación y la contratación de H2A. X en roturas del filamento de ADN se llama ADN daños respuesta (DDR) y ocurre rápidamente después de ADN está dañado. Después de este proceso, detención del ciclo celular mediada por el checkpoint y ADN se inician los procesos de reparación. Después de la realización de la reparación del ADN, γH2A.X es defosforilaciones e inactivado por fosfatasas. Prolongada y múltiples roturas del filamento del ADN conducen a la acumulación de focos γH2A.X en el ADN. Esto indica la incapacidad de la célula para reparar el daño en el ADN y la pérdida de integridad de ADN. Pueden identificarse estos focos γH2A.X en el ADN y el número de focos DDR puede contarse utilizando el protocolo en la sección 2.

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Protocol

1. ensayo cometa

  1. Preparación del reactivo
    1. De agarosa de bajo punto de fusión, 500 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 100 mL de DNA / RNA-libre del agua. Calentar el frasco en el microondas hasta que la agarosa se disuelva. Coloque la botella en un baño de agua de 37 ° C hasta que se necesite.
      Nota: Para mayor información, véase Azqueta et al., quienes estudiaron los efectos de la concentración de agarosa en el momento de desenrollar ADN y varios factores de electroforesis23.
    2. Diluir el colorante verde de SYBR ADN en tampón Tris-EDTA (TE) en una proporción de 1: 10,000 para obtener un 1 x de solución stock de colorante. Este colorante es sensible a la luz, así que guárdela en un lugar oscuro.
    3. Para el tampón de lisis celular, disolver 100 mL de tampón de lisis (2.5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Tritón X-100) en agua desionizada (DI H2O). A continuación, añadir 10 M NaOH para ajustar el pH a 10,0. Enfriar la solución a 4 ° C.
    4. Para el búfer de ejecución de ADN-desenrollar, electroforesis alcalino, disolver 1 L de solución alcalina (NaOH de 0,3 M, 1 mM EDTA) en DI H2O. enfriar la solución a 4 ° C. Asegúrese de que el pH > 13.
    5. Para diapositivas de cometa prerrevestidos, coloque unas pocas gotas de 0.5% agarosa sobre un portaobjetos de vidrio. Inmediatamente, con la superficie plana de otra diapositiva, difundir la agarosa para formar una capa delgada de la capa de agarosa.
      Nota: Seque el portaobjetos antes de usar.
    6. Para cultivo de células iPS, brevemente las células iPS de cultura en sótano revestido de matriz de la membrana (véase Tabla de materiales) de la cultura placas mTESR1 medio de cultivo hasta llega a confluencia.
      Nota: Las células iPS derivadas de fibroblastos cardiacos humanos fueron utilizadas en el presente Protocolo. La reprogramación de la derivación de células iPS y condiciones de cultivo se describe en los artículos más recientes de nuestro grupo de investigación12,13,21.
  2. Preparación de la muestra
    1. Descartar el medio de cultivo y lavar las células. Disociar las células con solución de separación (véase Tabla de materiales). Lavar el precipitado de células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y resuspender las células en PBS 1 x 105 células/ml.
  3. Preparación de portaobjetos de la muestra
    Nota: Realice los siguientes pasos bajo condiciones de poca luz para evitar el daño celular inducido por la luz ultravioleta.
    1. Mezclar 10 μL de suspensión celular y 90 μL de solución de agarosa (1:10 ratio) en un tubo. Coloque el tubo en un baño de agua de 37 ° C para impedir la solidificación de la agarosa.
    2. Mezclar las soluciones sin introducir burbujas de aire y pipeta 70 μL/spot el portaobjetos recubiertos cometa. Utilizando una pipeta, Esparza la mezcla de agarosa de la célula para formar una capa delgada. Coloque el portaobjetos en 4 ° C por 15 minutos.
    3. En un recipiente totalmente sumerja el portaobjetos en tampón de lisis frío. Coloque el recipiente en la oscuridad a 4 ° C durante 1 h.
    4. Vuelva a colocar el tampón de lisis con solución alcalina fría. Asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas. Coloque el recipiente en la oscuridad a 4 ° C por 30 minutos.
  4. Electroforesis
    1. Colocar el portaobjetos en un tanque de electroforesis horizontal. Llene el tanque con el tampón de electroforesis alcalina fría hasta que las diapositivas estén completamente sumergidas. Aplique tensión a 1 V/cm durante 15 a 30 minutos.
      Nota: Total de tensión = distancia entre los electrodos x 1 V
    2. En un recipiente, sumerja completamente el portaobjetos en frío DI H2O. Después de 2 minutos, quite el DI H2O y añada fresca DI H2O. Repita este paso.
    3. Reemplace el DI H2O con etanol frío al 70%. Esperar 5 minutos suavemente quitar la corredera, no lo incline y déjelo secar al aire.
    4. Una vez seco, añada 100 μL de colorante diluido de ADN a cada lugar. Esperar 15 min a temperatura ambiente. Usando un filtro FITC en un microscopio de epifluorescencia, tomar imágenes de cometas de 50 a 100 en total por muestra.
  5. Análisis de imágenes y cálculo de los resultados
    1. Anotando los cometas, los institutos nacionales de salud (NIH) utilizar ImageJ con plugin de ensayo cometa (descargar ImageJ aquí: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; descarga el plugin aquí: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      Nota: El plugin viene con un PDF de instrucciones que contiene todos los datos para realizar el análisis. Además, imágenes del análisis del cometa se muestran en la Figura 2A-C. Imágenes del cometa representante de control y doxorrubicina (Doxo)-células iPS tratada y la cuantificación de los cometas se muestran en la Figura 3A-C.

2. respuesta del daño de ADN

  1. Preparación de muestra y reactivo
    1. Para un cultivo de células iPS-CM, cultura iPS-CM células en sótano revestido de matriz de la membrana (véase Tabla de materiales) placas en Medio RPMI suplementado con B-27 (CMM) hasta llega a confluencia.
      Nota: Cardiomiocitos derivados de células iPS humanos fueron utilizados en el presente Protocolo. El protocolo de diferenciación de las células iPS en cardiomiocitos puede encontrarse en artículos recientes de nuestro grupo de investigación12,13,21.
    2. IPS-CMs en diapositivas de la cámara de la semilla.
      1. Descartar el medio de cultivo de los pozos de iPS-CM. Lavar las células 3 veces con PBS.
      2. Añada 1 mL de tripsina 0.25% por pozo e incubar a 37 ° C por 5 min Verifique la placa bajo un microscopio para la separación de la célula. Añadir 1 mL de CMM para detener la tripsina.
      3. Coloque la suspensión en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 4 ° C y 200 x g. Descartar el medio, agregar 1 mL de CMM y resuspender las células. Contar las células y ajustar la cuenta de célula para obtener 20 x 105 células en 1,6 mL de CMM.
      4. Semilla 200 μL de suspensión de células por pocillo de la cámara del pozo 8 Deslice (véase Tabla de materiales). Toque el portaobjetos suavemente para extender las células alrededor del pozo e incubar a 37 ° C.
    3. Para el tratamiento de doxorrubicina de iPS-CM, desechar el medio de cultivo de los pozos de iPS-CM. Lavar las células con PBS. Tratar las células con 1 doxorrubicina μM y CMM para 4 h. Aspire el medio y lavar las células con PBS.
    4. Para el amortiguador de bloqueo, prepare 10 mL de solución de albúmina de suero bovino (BSA) que contiene 3% de BSA y 0.05% Tritón X-100. Para preparar 10 mL de solución amortiguadora de bloqueo, agregar 1 mL de suero normal de burro a 9 mL de solución preparada de BSA.
    5. Para la solución de anticuerpo primario, añadir 1 μL de anti-rabbit phospho-histona H2A. X (Ser139) anticuerpo a 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo.
    6. Para la mezcla del anticuerpo secundario, añadir 1 μL de anticuerpo secundario de anti-conejo conjugado con fluorocromo DAPI y conjugado con fluorocromo phalloidin a 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo.
  2. Inmunomarcación
    1. Lavar las células 3 veces con PBS y añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% recién preparada (PFA) a cada pocillo. Fijar las células durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Lavar las células con PBS.
    2. Retirar el PBS y añadir 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo por el bien y el bloque de 30 minutos en una cámara de vapor a temperatura ambiente. Retire el amortiguador de bloqueo y añadir 200 μL de solución de anticuerpo primario. Incubar durante 45 minutos en una cámara oscura, humidificada a temperatura ambiente. Luego, lavar los pocillos 3 veces con PBS.
    3. Retirar el PBS y añadir 200 μL de mezcla de anticuerpo secundario. Incubar durante 45 minutos en una cámara oscura, humidificada a temperatura ambiente. Luego, lavar los pocillos 3 veces con PBS. Lave con DI H2O antes de montar con preservador de fluorescencia. Coloque un cubreobjetos y guardar las diapositivas en la oscuridad a 4 ° C.
    4. Usando un microscopio de epifluorescencia, tomar tres a cinco imágenes de campos al azar por ejemplo, como se muestra en la Figura 4Ay proceder al análisis de la imagen.
  3. Recuento de los focos DDR
    1. Descargar e instalar CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
    2. Nota: Procesamiento de imágenes en este estudio se realizan con CellProfiler versión 2.1.1. Tutoriales de CellProfiler que se utilizaron se pueden encontrar en otros lugares (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & lista = PL7CC87670239B4D10). Si se utiliza una versión más reciente de CellProfiler, la tubería podría requerir adaptaciones menores.
    3. Descargar la tubería punctae_gH2AX.cpipe. Seleccione archivo > importar > tubería desde el archivo y elija punctae_gH2AX.cpipe.
    4. Arrastrar y soltar la carpeta que contiene las imágenes adquiridas de focos γH2A.X a la ventana de lista de archivos en la sección de Módulos de entrada/imágenes para el análisis (figura 5A). A continuación, siga las instrucciones como se muestra en la Figura 5A-L.
    5. Definir los siguientes parámetros para las imágenes:
      1. Arrastre la imagen deseada para el análisis de la lista de archivos. En módulos de entrada, seleccione imágenes (ver figura 5A para ajustes del módulo). En los módulos de entrada, seleccione metadatos (ver figura 5B para ajustes del módulo). En los módulos de entrada, seleccione NamesAndTypes (véase la figura 5 para los ajustes del módulo).
      2. Para grupos, seleccione no. En los módulos de análisis, seleccione ColorToGray (véase la figura 5 para los ajustes del módulo).
    6. En los módulos de análisis, seleccione suave (ver figura 5E para ajustes del módulo).
      Nota: Este valor deba ser optimizada, dependiendo de la resolución de la imagen.
    7. En los módulos de análisis, seleccione IdentifyPrimaryObjects (ver figura 5F para ajustes del módulo).
      Nota: Optimizar estos valores para asegurarse de que está seleccionado el núcleo entero. Después de este paso, el ordenador puede retrasarse.
    8. En los módulos de análisis, seleccione suave (ver figura 5 para la configuración del módulo).
      Nota: Este valor deba ser optimizada, dependiendo de la resolución de la imagen.
    9. En los módulos de análisis, seleccione EnhanceOrSuppressFeatures (ver figura 5 H para ajustes del módulo).
    10. En los módulos de análisis, seleccione IdentifyPrimaryObjects (véase figura 5I para ajustes del módulo).
      Nota: Optimizar estos valores para asegurarse de que seleccionan a lo punctae. Después de este paso, el ordenador puede retrasarse otra vez.
      1. En los módulos de análisis, seleccione RelateObjects (véase figura 5J para ajustes del módulo). En los módulos de análisis, seleccione ClassifyObjects (ver figura 5 K para la configuración del módulo). En los módulos de análisis, seleccione ExportToSpreadsheet (ver figura 5 L para ajustes del módulo).
      2. Haga clic en Analizar imágenes en el panel izquierdo de la parte inferior para realizar análisis de imagen. En la realización del análisis, se generan varias imágenes (Figura 6A-F).
        Nota: Los usuarios deben guardar estas imágenes para referencia futura.
      3. Nota el archivo .csv que contiene datos cuantitativos para su análisis posterior que es generado y guardado en la ubicación apropiada en el equipo. En la hoja de cálculo denominada MyExpt_Image, columnas B y D tendrá el número de núcleos que tienen hasta cinco y más punctae, respectivamente. Añadir columnas B y D para obtener el número total de núcleos.
    11. Repita el paso 2.3.3 - 2.3.8 para todas las imágenes (cambiar el nombre de archivo MyExpt_ antes de cada análisis). Parcelas pueden hacerse para evaluar la integridad del ADN, como se muestra en la figura 4.

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Representative Results

Se cultivaron células madre humanas pluripotentes inducidas, y el daño en el ADN y el momento de la cola, que fueron utilizados como una medida de la integridad del ADN, fueron analizados por el ensayo cometa. las células iPS eran incrustadas en agarosa de bajo punto de fusión y coloca en un portaobjetos de vidrio. Las células, entonces, trataron con tampón de lisis, seguido por una solución alcalina, para la obtención de ADN superenrollado. Nucleoids fue electrophoresed y cometas fueron visualizados por tinte de ADN (figura 1A-D). Los cometas, a continuación, se analizaron con ImageJ, usando el plugin de ensayo cometa (figura 2A-C).

Las células iPS humanas fueron tratadas con Doxo para inducir daño en el ADN y para ser utilizado como control positivo. Microfotografías representativas de cometas de células iPS Doxo-tratada y no tratada se muestran en la Figura 3A. Una cantidad basal de daño del ADN fue encontrada en las células iPS, expresadas como una fracción de momento cola y daño de ADN. Sin embargo, la Doxo tratamiento aumenta el daño de la DNA en células iPS como espera (figura 3BC). Esto demuestra que el análisis del cometa puede utilizarse para evaluar la integridad del ADN en las células somáticas18,19 , sino también en las células de vástago de pluripotent21.

Recién distinguido cardiomiocitos iPS (iPS-CMs), iPS-CMs cultivadas para 6 meses (cultura prolongada [PC]) y tratados con Doxo iPS-CMs fueron sometidos a γH2A.X inmunomarcación. Microfotografías representativas de immunolabelling γH2A.X se muestran en la Figura 4A (bajos aumentos) y Figura 4B (mayor aumento). El número de focos γH2A.X (focos DDR) (punctae) en cada núcleo se cuantifican, con CellProfiler de módulos de canalización personalizado (figura 5A-L). El porcentaje de células positivas para γH2A.X se clasifican en núcleos con cero a cinco punctae y núcleos con más de 10 punctae. En el control iPS-CM, más del 90% de las células tenían menos de cinco focos DDR por núcleos y un total de menos del 10% de las células tenía más de seis focos DDR por núcleos (figura 4, control [Ctrl]). iPS-CMs cultivados durante 6 meses tuvieron menos del 90% de células con menos de cinco focos DDR por núcleos y un total de más de 13% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleos (figura 4, PC), mientras que los tratados con Doxo iPS-CM menos del 80% de las células con les s de cinco focos DDR por núcleos y un total de cerca del 24% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleos (figura 4, Doxo). Esta información muestra claramente que cultivo celular prolongada y tratamiento Doxo inducen daños significativos del ADN en iPS-CMs y no son aptos para trasplante de la célula.

Figure 1
Figura 1: esquema del ensayo cometa. (A) mezclar la suspensión de células con agarosa de bajo punto de fusión y (B) colocarla en un portaobjetos de vidrio. (C) tratar con tampón de lisis celular, seguido por una solución alcalina, para obtener nucleoids que contiene ADN superenrollado. Electrophorese (D) y el ADN con tinte verde de SYBR ADN de la mancha. (E) esquema de intacta (izquierda) y el ADN dañado (derecho, forma de cometa). (F) fórmula para calcular una fracción del ADN daños y cola de momento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: cuantificación de ADN daños y cola de momento por ImageJ. (A-C) Imágenes de ImageJ, con el plugin de análisis del cometa que muestra una selección de la cabeza del cometa y la cola. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: doxorrubicina induce daño de la DNA en las células iPS humanas. (A) ADN daños en tratados con doxorrubicina (Doxo) y las células del iPS no tratada (control), analizadas mediante el análisis del cometa. (B) fracción del daño de la DNA (n = 3) y (C) momento de cola (n = 63 cometas) cuantificó usando el análisis del cometa. El tratamiento con doxorrubicina, un agente intercalantes de ADN, aumentó significativamente la fracción de momento cola y daño de DNA en células iPS. Los datos son medios ± SEM. *P < 0.05, estudiante de desapareado t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: respuesta del daño de ADN en los cardiomiocitos derivados de iPS. Marcador de respuesta (A) ADN daño γH2A.X identificados por inmunofluorescencia en tratados con doxorrubicina (Doxo) y no tratada (control) iPS-cardiomiocitos como prolongada cultura iPS-cardiomiocitos (PC). Aumento mayor (B) de γH2A.X (punctae verde) etiquetado en los sitios de lesión del ADN en iPS-focos CMs. (C) cuantificación de DDR, analizados CellProfiler con módulos de canalización personalizado. Los datos son medio ± SD; n = 3 a 4. P < 0.05, estudiante de desapareado t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: automatizado de análisis de la respuesta de daño del ADN por CellProfiler. (A-L) Imágenes de CellProfiler con la configuración especificada para la importación de las imágenes y la identificación automatizada y la cuantificación de γH2A.X punctae en iPS-CMs. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: automatizado de análisis de la respuesta de daño del ADN por CellProfiler. (A-F) Imágenes de datos generadas por CellProfiler al finalizar el análisis de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Integridad del ADN retrata la integridad celular. Las células con ADN dañado están con frecuencia en tensión y eventualmente pierden su integridad. La integridad de la madre y las células derivadas de células madre que están propagándose con el fin de trasplante es principal para las células realizar su función deseada. Transplante de células con ADN dañado resultaría en una tasa de pobres engraftment y rendimiento de la celda8,20. Por lo tanto, examinar la integridad del DNA antes de trasplante de la célula es un protocolo de control de calidad necesario. Aquí describimos dos enfoques rentables, es decir, el cometa γH2A.X y ensayo inmunofluorescencia etiquetado, para evaluar el daño de la DNA y la calidad del vástago y las células derivadas de células madre.

Una causa importante de envejecimiento celular se cree que la acumulación de daño en el ADN en las células. Utilizando el ensayo cometa, Al-Baker et al analizaron el daño de la DNA en fibroblastos dérmicos humanos jóvenes y senescentes22. Previamente, hemos demostrado que trasplante cardiaco de libre de daños de ADN células progenitoras aisladas de un ratón transgénico p53 incrementó la tasa de injerto en el órgano anfitrión del8. Recientemente, hemos demostrado el papel del dominio de transactivación de p53 en mecanismos de reparación de daños de ADN de las células iPS humanas21. En ambos estudios, hemos empleado tanto la inmunofluorescencia γH2A.X y ensayo de cometa etiquetado metodologías para evaluar los daños de la DNA en las células de vástago. Ambos estos métodos son rentables y se pueden realizar con equipo de laboratorio básico. Un problema crítico que a menudo experimentamos es agarosa de solidificación en la pipeta y tubos. Superar este problema por precalentamiento todos los tubos y puntas antes de agarosa pipeteo. Mientras que el análisis del cometa tarda hasta 2 días para completar, el optimizado procedimiento etiquetado de inmunofluorescencia γH2A.X puede completarse en menos de 4 h.

Cultivos de células iPS humanas con más de 10% daño de la DNA, medido por el ensayo cometa, no eficientemente distinguió en cardiomiocitos (datos no mostrados) en vitro. El ensayo cometa es sensible y dinámica en la evaluación de daños en el ADN de las células madre. Sin embargo, las evaluaciones de integridad de ADN de ciertas células, como cardiomiocitos derivados de iPS, son engorrosas por ensayo cometa debido a la naturaleza de las células. Los cardiomiocitos se enriquecen con troponina, sarcomeric proteínas y las proteínas de matriz extracelular secretada. Desnaturalizar estas estructuras complejas para hacer superenrollado el ADN y su reproductibilidad son cuestionables. Lo más importante, 25% a 40% de cardiomiocitos humanos son binucleadas25, y estos porcentajes varían en los cardiomiocitos derivados de iPS. Puesto que la pared celular se interrumpe en el análisis del cometa, la evaluación precisa del porcentaje de células con ADN dañado es imposible. Por lo tanto, en el caso de iPS-CMs, el γH2A.X inmunofluorescencia etiquetado evaluar daños en el ADN es una alternativa simple para el análisis del cometa.

Basado en estos resultados y los de las publicaciones anteriores de nuestro grupo8,20,21, sugerimos que, si hay más de 10% daño de la DNA, evaluada por el ensayo cometa, o menos del 90% de las células tienen de cero a cinco DDR focos, entonces la cultura debe ser descalificado por trasplante de la célula.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado en parte por el corazón nacional, pulmón y sangre Instituto becas to1-HL-99507, HL-114120 131017 HL, HL138023 y UO1-HL-134764 (a J. Zhang) y por el americano corazón Asociación científica desarrollo Grant 17SDG33670677 (a R. Kannappan).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG		 Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories		 711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca
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Miller, J. M., Mardhekar, N. M.,… More

Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

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