Summary
Här, ger vi en detaljerad beskrivning av ett experiment för en analys av bedömning av DNA integritet i stamceller före stamcellstransplantation.
Abstract
Stammen och stem-cell-derived celler har enorm potential som en regenerativ terapi för olika degenerativa sjukdomar. DNA är förrådshuset av genetiska data i alla celler, inklusive stamceller, och dess integritet är grundläggande för dess regenerativ förmåga. Stamceller genomgå forförökningen i labb att uppnå den nödvändiga nummer för transplantation. Accelererad celltillväxt leder till förlust av DNA integritet av ackumulerade metaboliter, såsom reaktiva syre, karbonyl och alkylerande medel. Transplantera dessa celler skulle resultera i dålig engraftment och regenerering av försämrade orgeln. Dessutom omplantering DNA-skadade celler leder till mutationer, DNA instabilitet, cellulära åldras, och möjligen livshotande sjukdomar som cancer. Därför finns det ett omedelbart behov av en kvalitetskontroll metod att bedöma cellens lämplighet för transplantation. Här, tillhandahåller vi stegvisa protokoll för bedömning av DNA integritet stamceller före stamcellstransplantation.
Introduction
Experimentella och kliniska bevis visar att stamcellstransplantation kan måttligt förbättra vänster kammare kontraktila misslyckas hjärtan1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Senaste framstegen har öppnat ytterligare tilltalande möjligheter för kardiovaskulär föryngring. Dessa omfattar uttrycket påtvingad omplanering faktorer i kroppsceller att inducera pluripotency och differentiera dessa inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) i olika hjärt härstamningar, huvudsakligen hjärtmuskelcellen (CM)10, 11 , 12 , 13. de ärftligt materiellt i varje cell, inklusive artificiellt genererade iPSCs och iPSC-derived CM (iPS-CM), är DNA. De genetiska instruktioner lagras i DNA dikterar tillväxt, utveckling och funktion av celler, vävnader, organ och organismer. DNA är inte inert; cell metaboliter, såsom reaktiva syre, karbonyl och kväve arter, och alkylerande medel kan orsaka DNA skada in vitro- och in vivo14,15,16,17. Ännu viktigare, uppstår DNA-skador intuitivt i varje cell, med en betydande frekvens. Om dessa skador inte åtgärdas kommer det leda till DNA mutation, cellulära åldras, förlusten av DNA och cell integritet, och eventuellt sjukdomar, inklusive livshotande cancerformer. Därför är behåller DNA integritet viktigt till en cell, särskilt iPSCs, som har en enorm potential i kliniken.
För att bedöma kvantitet och integritet isolerat genomiskt DNA, finns dyra utrustning tillgänglig på marknaden. Men finns det inga enkla och kostnadseffektiva metoder för att bedöma integriteten DNA i cellerna utan att isolera cellerna. Dessutom är användare-inducerad DNA nedbrytning under DNA isolering en av de stora nackdelarna med att använda dessa metoder. Encelliga gelelektrofores (känd som komet assay)18,19 och γH2A.X immunolabeling8 tekniker är grundläggande synsätt i forskningslaboratorier för bedömning av DNA-skador. Dessa två metoder kräver inte dyr utrustning eller isolerat genomiskt DNA att analysera DNA integritet8,20,21. Eftersom har dessa tekniker utförts med hela celler; användaren-inducerad DNA/RNA/protein nedbrytning under provberedningen kommer inte att påverka dessa protokoll. Här, för att bedöma DNA-skada och DNA skada svar i stammen och stem-cell-derived celler, tillhandahåller vi stegvisa protokoll för att utföra båda komet assay och γH2A.X immunolabeling. Dessutom föreslår vi att kombinera dessa två strategier, en naiv bedömning som kan användas för att bedöma cellens lämplighet för transplantation.
Det komet assay eller encelliga gel elektrofores, åtgärder DNA raster i celler. Celler inbäddade i låg-smältande agaros är lyserat till formuläret nucleoids innehållande supercoiled DNA. Vid elektrofores migrera små bitar av fragmenterade DNA och trasiga DNA-strängar genom agarosgelelektrofores porerna, medan intakta DNA, på grund av sin enorma storlek och deras konjugering med proteinet matrix, kommer att ha en begränsad invandring. Mönstret av färgade DNA i fluorescens Mikroskop härmar en komet. Komet huvudet innehåller intakta DNA och svansen är består av fragment och trasiga DNA-strängar. Fraktionen av DNA-skador kan mätas genom fluorescensintensiteten hos skadade DNA (komet svans) relativt intakta DNA (komet huvud) intensiteten. Parametern svans nu kan beräknas som visas i figur 1.
DNA-skada inducerar fosforyleringen av Histon H2A. X (γH2A.X) på Ser139 av ATM, ATR och DNA-PK kinaser. Fosforylering och rekrytering av H2A. X vid DNA strand raster kallas DNA skador svar (DDR) och händer snabbt efter DNA är skadad. Efter denna process, checkpoint-medierad cellcykelarrest och DNA reparationsprocesser initieras. Efter det framgångsrika slutförandet av DNA-reparation, är γH2A.X defosforyleras och inaktiverat av fosfataser. Långvarig och flera DNA strand raster leda till ansamling av γH2A.X foci i DNA. Detta anger cellens oförmåga att reparera DNA-skador och förlust av DNA integritet. Dessa γH2A.X foci i DNA kan identifieras genom och antalet DDR foci kan räknas med protokollet i avsnitt 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kometen Assay
-
REAGENSBEREDNING
- För låg--smältpunkt agaros, placera 500 mg låg-smältande agaros i 100 mL DNA- / RNA-gratis vatten. Värm flaskan i en mikrovågsugn tills Agarens upplöser. Placera flaskan i 37 ° C vattenbad tills den behövs.
Obs: För vidare läsning, se Azqueta et al., som studerat effekterna av agaros koncentrationen på DNA-återgång tiden och flera elektrofores faktorer23. - Späd SYBR green DNA färgämne i Tris-EDTA (TE)-buffert i förhållandet 1:10,000 att få en 1 x arbetar lager färg lösning. Detta färgämne är ljuskänslig, så förvara det på en mörk plats.
- För cell lysis bufferten, Lös 100 mL lyseringsbuffert (2,5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton x-100) i avjoniserat vatten (DI H2O). Lägg sedan till 10 M NaOH för att justera pH till 10,0. Cool att bufferten 4 ° C.
- För alkaliska DNA-avveckling/elektrofores rinnande bufferten, lös 1 L alkalisk lösning (0.3 M NaOH, 1 mM EDTA) i DI H2O. Cool bufferten till 4 ° C. Kontrollera pH > 13.
- För silicagel komet diabilder, placera några droppar 0,5% agaros på en glasskiva. Omedelbart, med hjälp av den plana ytan av en annan bild, sprida Agarens för att bilda ett tunt lager av agaros beläggning.
Obs: Torr i bilderna innan du använder. - För iPS cellkultur, kort kultur kultur iPS-celler i källaren-membran-matris-coated (se Tabell för material) plattor i mTESR1 odlingsmedium tills konfluens nås.
Obs: Mänskliga-hjärt-fibroblast-härledda iPS-celler användes i detta protokoll. Omprogrammering av iPS cell härledning och odlingsbetingelser beskrivs i senaste artiklarna från vår forskning grupp12,13,21.
- För låg--smältpunkt agaros, placera 500 mg låg-smältande agaros i 100 mL DNA- / RNA-gratis vatten. Värm flaskan i en mikrovågsugn tills Agarens upplöser. Placera flaskan i 37 ° C vattenbad tills den behövs.
-
Provberedning
- Kassera odlingsmediet och tvätta cellerna. Separera celler med avlossning lösning (se Tabell för material). Tvätta cellpelleten med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och resuspendera cellerna i PBS på 1 x 105 celler/mL.
-
Slide provberedning
Obs: Utför följande steg på låg-ljus villkor att undvika ultraviolett-ljus-inducerad cellskador.- Blanda 10 μl cellsuspension och 90 μl av agaros lösning (1:10 baserat) i ett rör. Placera röret i 37 ° C vattenbad att förhindra Agarens stelnar.
- Blanda lösningarna utan att införa luftbubblor och Pipettera 70 μL/spot in i silicagel komet bilden. Använder en pipettspetsen, sprida cell agaros blandningen för att bilda ett tunt lager. Placera bilden i 4 ° C under 15 minuter.
- I en behållare, helt dränka bilden i kalla lyseringsbuffert. Placera behållaren i mörker vid 4 ° C för 1 h.
- Ersätta lyseringsbuffert med kall alkalisk lösning. Kontrollera att bilderna är helt nedsänkt. Placera behållaren i mörker vid 4 ° C i 30 min.
-
Elektrofores
- Placera bilden i en horisontell elektrofores tank. Fyll på vattenbehållaren med kallt alkaliskt elektrofores buffert tills bilderna är helt nedsänkt. Tillämpa spänning på 1 V/cm för 15-30 min.
Obs: Totala spänning = avståndet mellan elektroderna x 1 V - I en behållare, helt dränka bilden i kalla DI H2O. Efter 2 min, ta bort den DI H2O och lägga till färska DI H2O. Upprepa detta steg.
- Ersätta den DI H2O med kall 70% etanol. Vänta 5 min. försiktigt bort bilden, inte luta den och låt den lufttorka.
- När torkat, tillsätt 100 μL av utspädda DNA färgämne till varje plats. Vänta 15 min i rumstemperatur. Använder en FITC-filter i ett epifluorescensmikroskop, ta bilder av 50 till 100 kometer totalt per prov.
- Placera bilden i en horisontell elektrofores tank. Fyll på vattenbehållaren med kallt alkaliskt elektrofores buffert tills bilderna är helt nedsänkt. Tillämpa spänning på 1 V/cm för 15-30 min.
-
Bildanalys och beräkning av resultaten
- Använd den National Institutes of Health's (NIH) för scoring kometer, ImageJ med komet assay plugin (Hämta ImageJ här: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; Ladda ner plugin här: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
Obs: Insticksprogrammet kommer med en PDF-instruktion som innehåller alla detaljer att utföra analysen. Dessutom visas skärmdumpar av komet analysen i Figur 2A-C. Representativa komet bilder av kontroll och doxorubicin (Doxo)-behandlade iPS-celler och kvantifiering av kometerna visas i Figur 3A-C.
- Använd den National Institutes of Health's (NIH) för scoring kometer, ImageJ med komet assay plugin (Hämta ImageJ här: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; Ladda ner plugin här: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
2. DNA skador svar
- Prov och reagens förberedelse
- För en iPS-CM cellkultur, kultur iPS-CM celler i källaren-membran-matris-coated (se Tabell för material) kultur plattor i RPMI medium kompletteras med B-27 (CMM) tills konfluens nås.
Obs: Mänskliga-iPS-cell-derived hjärtmuskelcellerna användes i detta protokoll. Protokollet för iPS celldifferentiering i hjärtmuskelcellerna kan hittas i senaste artiklarna från vår forskning grupp12,13,21. - Utsäde iPS-CMs i kammaren diabilder.
- Kassera odlingssubstratet från iPS-CM brunnarna. Tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin per brunn och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Kontrollera plattan under ett mikroskop för cell avlossning. Tillsätt 1 mL CMM att stoppa trypsin.
- Placera cellsuspension i en 15 mL rör och Centrifugera under 5 minuter vid 4 ° C och 200 x g. Kassera mediet, tillsätt 1 mL CMM och resuspendera cellerna. Räkna cellerna och justera celltalet Erhåll 20 x 105 celler i 1,6 mL av CMM.
- Utsäde 200 µL cellsuspension per brunn 8-väl avdelning Skjut (se Tabell för material). Tryck på bilden försiktigt för att sprida cellerna runt brunnen och inkubera vid 37 ° C.
- För iPS-CM doxorubicin behandling, kassera odlingssubstratet från iPS-CM brunnarna. Tvätta cellerna med PBS. Behandla cellerna med 1 μM doxorubicin och CMM för 4 h. aspirera på medellång och tvätta cellerna med PBS.
- För det blockerande buffert, förbereda 10 mL bovint serumalbumin (BSA) lösning som innehåller 3% BSA och 0,05% Triton x-100. För att förbereda 10 mL blockerande buffert, tillsätt 1 mL normal åsna serum till 9 mL beredd BSA lösning.
- För primär antikropp lösningen, tillsätt 1 μL av anti-kanin phospho-histonglykoprotein H2A. X (Ser139) antikroppar mot 200 μl blockerande buffert.
- För sekundär antikropp blandningen, tillsätt 1 μL varje fluorokrom-konjugerad anti-kanin sekundär antikropp, DAPI och fluorokrom-konjugerad phalloidin 200 μl blockerande buffert.
- För en iPS-CM cellkultur, kultur iPS-CM celler i källaren-membran-matris-coated (se Tabell för material) kultur plattor i RPMI medium kompletteras med B-27 (CMM) tills konfluens nås.
- Immunolabeling
- Tvätta cellerna tre gånger med PBS och tillsätt 200 μl av nylagade 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) till varje brunn. Fixa cellerna för 20 min i mörker vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 200 μl blockerande buffert per brunn och block i 30 min i en fuktig kammare vid rumstemperatur. Ta bort det blockerande buffert och tillsätt 200 μl av primär antikropp lösning. Inkubera i 45 min i en mörk, fuktig kammare vid rumstemperatur. Sedan Tvätta brunnarna tre gånger med PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 200 μl av sekundär antikropp mix. Inkubera i 45 min i en mörk, fuktig kammare vid rumstemperatur. Sedan Tvätta brunnarna tre gånger med PBS. Tvätta med DI H2O innan du monterar dem med antifade. Placera ett täckglas och lagra bilder i mörker vid 4 ° C.
- Använda ett epifluorescensmikroskop, ta tre till fem bilder av slumpmässiga fält per prov, som visas i figur 4Aoch vidare till bildanalys.
- Räkna av de DDR foci
- Hämta och installera CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).
- Obs: Bildbehandling i denna studie utfördes med hjälp av CellProfiler version 2.1.1. Handledning för CellProfiler som användes kan hittas någon annanstans (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & list = PL7CC87670239B4D10). Om en nyare version av CellProfiler används, kan rörledningen kräva mindre anpassningar.
- Hämta den pipeline punctae_gH2AX.cpipe. Välj fil > Importera > Pipeline från filen och välj punctae_gH2AX.cpipe.
- Dra-och-släpp den mapp som innehåller de förvärvade bilderna av γH2A.X foci till fönstret fillistan i avsnittet Input moduler/bilder för analys (figur 5A). Följ sedan instruktionerna som visas i Figur 5A-L.
- Ange följande parametrar för bilderna:
- Dra den önskade bilden för analys till fillistan. Under Input modules, Välj bilder (se figur 5A för modulinställningar). Välj Metadata i Input modules, (se figur 5B för modulinställningar). I Input modules, väljer du NamesAndTypes (se figur 5 c för modulinställningar).
- För grupper, Välj ingen. I analysen moduler, väljer du ColorToGray (se figur 5 d för modulinställningar).
- I analysen moduler, Välj slät (se figur 5E modulinställningar).
Obs: Detta värde kan behöva optimeras, beroende på bildens upplösning. - I analysen moduler, väljer du IdentifyPrimaryObjects (se figur 5F för modulinställningar).
Obs: Optimera dessa värden för att kontrollera hela kärnan är markerad. Efter detta steg, kan datorn släpar. - I analysen moduler, Välj slät (se figur 5 g för modulinställningar).
Obs: Detta värde kan behöva optimeras, beroende på bildens upplösning. - I analysen moduler, väljer du EnhanceOrSuppressFeatures (se figur 5 H för modulinställningar).
- I analysen moduler, väljer du IdentifyPrimaryObjects (se figur 5I för modulinställningar).
Obs: Optimera dessa värden för att kontrollera att punctae är markerade. Efter detta steg, kan datorn släpar igen.- I analysen moduler, väljer du RelateObjects (se figur 5J för modulinställningar). I analysen moduler, väljer du ClassifyObjects (se figur 5 K för modulinställningar). I analysen moduler, väljer du ExportToSpreadsheet (se figur 5 L för modulinställningar).
- Klicka på Analysera bilder på den nedre vänstra panelen att utföra bildanalys. På det framgångsrika fullbordandet av analysen, flera bilder genereras (Figur 6A-F).
Obs: Användarna bör spara dessa bilder för framtida referens. - Observera den CSV-fil som innehåller kvantitativa data för vidare analys som genereras och sparas på lämplig plats på datorn. I kalkylbladet kallas MyExpt_Imagekommer kolumnerna B och D har antalet kärnor som har upp till fem och mer punctae, respektive. Lägg till kolumnerna B och D för att få det totala antalet kärnor.
- Upprepa steg 2.3.3 - 2.3.8 för alla bilder (ändra MyExpt_ filnamnet före varje analys). Tomter kan göras för att bedöma DNA integritet, som visas i figur 4 c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller odlades och de DNA-skadan och svans nu, som användes som ett mått på DNA integritet, analyserades av komet assay. iPS-celler var inbäddade i låg--smältpunkt agaros och placeras på en glasskiva. Cellerna, sedan behandlades med lyseringsbuffert, följt av en alkalisk lösning, att få supercoiled DNA. Nucleoids var electrophoresed och kometer var visualiserat av DNA dye (figur 1A-D). Kometer, sedan analyserades med ImageJ, med hjälp av komet assay plugin (figur 2A-C).
Mänskliga iPS-celler behandlades med Doxo att inducera DNA-skador och ska användas som positiv kontroll. Representativ micrographs av kometer från Doxo-behandlade och nontreated iPS-celler visas i figur 3A. En basal mängd DNA-skador hittades i iPS-celler, uttryckt som en bråkdel av DNA skada och svans ögonblick. Dock förväntat den Doxo behandling ökade de DNA-skadan i iPS-celler som (figur 3BC). Detta visar att komet analysen kan användas för att bedöma DNA integritet inte bara i kroppsceller18,19 , men också i pluripotenta stamceller21.
Nymalen differentierade iPS hjärtmuskelcellerna (iPS-CMs), iPS-CMs odlade för 6 månader (långvarig kultur [PC]) och iPS-CMs behandlas med Doxo utsattes för γH2A.X immunolabeling. Representativ micrographs av γH2A.X immunolabelling visas i figur 4A (nedre-förstoring) och figur 4B (högre förstoring). Antalet γH2A.X foci (DDR foci) (punctae) i varje kärna är kvantifierade, med CellProfiler med anpassade pipelinemoduler (figur 5A-L). Procentandelen av celler som är positiva för γH2A.X indelas i atomkärnor med noll till fem punctae och atomkärnor med mer än 10 punctae. I kontroll iPS-CM, mer än 90% av cellerna hade mindre än fem DDR foci per atomkärnor, och sammanlagt mindre än 10% av cellerna hade fler än sex DDR foci per atomkärnor (figur 4 c, kontroll [Ctrl]). iPS-CMs odlade i 6 månader hade mindre än 90% celler med mindre än fem DDR foci per atomkärnor, och totalt mer än 13% av cellerna hade fler än sex DDR foci per atomkärnor (figur 4 c, PC), medan den Doxo-behandlade iPS-CM visade mindre än 80% av cellerna med les s än fem DDR foci per atomkärnor, och totalt ca 24% av cellerna hade fler än sex DDR foci per atomkärnor (figur 4 c, Doxo). Dessa data visar tydligt att långvarig cellkultur och Doxo behandling framkalla betydande DNA-skador i iPS-CMs och är inte lämpliga för stamcellstransplantation.
Figur 1: Schematisk komet analysens. (A) Mix cellsuspension med låg--smältpunkt agaros och (B) placera den på en glasskiva. (C) behandla det med cell lyseringsbuffert, följt av en alkalisk lösning, att få nucleoids innehållande supercoiled DNA. (D) Electrophorese och fläcken DNA med DNA SYBR gröna färgämne. (E) Schematisk bild av intakt (vänster) och skadat DNA (höger, komet form). (F) formel för att beräkna en bråkdel av DNA skada och svans nu. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DNA skador och svans ögonblick kvantifiering av ImageJ. (A-C) ««««ImageJ skärmdumpar, med komet analys plugin visar ett urval av komet huvud och svans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Doxorubicin inducerar DNA-skador i mänskliga IPSC. (A), DNA skador i behandlade med doxorubicin (Doxo) och nontreated (kontroll) iPS-celler, analyseras med komet-analys. (B) bråkdel av DNA-skador (n = 3) och (C) svans ögonblick (n = 63 kometer) kvantifieras med komet-analys. Behandling med doxorubicin, en DNA-infoga agent, ökat betydligt fraktionen av DNA skada och svans ögonblick i iPS-celler. Data är medel ± SEM. *P < 0,05, Student är oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: DNA skador svar i iPS-derived hjärtmuskelcellerna. (A), DNA skador svar markör γH2A.X identifieras av immunofluorescens i behandlade med doxorubicin (Doxo) och nontreated (kontroll) iPS-hjärtmuskelcellerna samt långvarig kultur iPS-hjärtmuskelcellerna (PC). (B) högre förstoring av γH2A.X (grön punctae) märkning på platserna för DNA-skador i iPS-CMs. (C) kvantifiering av DDR foci, analyseras med CellProfiler med anpassade pipelinemoduler. Data är medel ± SD; n = 3 till 4. P < 0,05, Student är oparade t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: automatiserad DNA skador svar analys av CellProfiler. (A-L) Skärmdumpar av CellProfiler med angivna inställningar för att importera bilderna, och automatiserad identifiering och kvantifiering av γH2A.X punctae i iPS-CMs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: automatiserad DNA skador svar analys av CellProfiler. (A-F) Dataavbildningar genereras av CellProfiler vid slutförandet av bildanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA integritet porträtterar cellernas integritet. Celler med skadat DNA är ofta stress och så småningom förlorar sin integritet. Stamceller och stamceller-cell-derived celler som sprids i syfte att transplantation integritet är rektor för cellerna att utföra deras önskad funktion. Transplantation av celler med skadat DNA skulle resultera i en dålig engraftment hastighet och prestanda av cell8,20. Att undersöka DNA integritet före stamcellstransplantation är därför en nödvändig kvalitetskontroll protokoll. Här beskriver vi två kostnadseffektiva metoder, nämligen den komet assay och γH2A.X immunofluorescens märkning, för att bedöma de DNA-skador och kvalitet av stamceller och stamceller-cell-derived celler.
En viktig orsak till cellulärt åldrande tros vara ansamling av DNA-skador i cellerna. Med komet-analys, analyserade Al-Baker et al. DNA skador i unga och senescent mänskliga dermal fibroblaster22. Tidigare har vi visat att stolpsättning DNA skador-fri hjärt stamceller isoleras från en transgen mus som p53 höjdes engraftment i mottagande organ8. Nyligen har visat vi rollen av p53 transkription domänen i DNA skador reparationsmekanismer i mänskliga iPS celler21. I båda studierna har vi anställt både den komet assay och γH2A.X immunofluorescens märkning metoder för att bedöma de DNA-skadan i stamceller. Båda dessa metoder är kostnadseffektiva och kan utföras med grundläggande labbutrustning. Ett irriterande kritiska problem som vi ofta upplevt är agar stelnar i pipetten och rör. Vi övervinna problemet genom prewarming alla rör och tips före pipettering agaros. Medan komet analysen tar 2 dagar att slutföra, kan optimerad γH2A.X immunofluorescens märkning förfarandet fyllas i under 4 h.
Mänskliga iPS cellkulturer med mer än 10% DNA-skador, mätt med komet analysen, inte effektivt differentieras till hjärtmuskelcellerna (inga data anges) i vitro. Komet analysen är känslig och dynamisk bedömning av DNA-skador i stamceller. DNA integritet bedömningar i vissa celler, till exempel iPS-derived hjärtmuskelceller, är dock besvärligt med komet assay pågrund av cellerna. Hjärtmuskelcellerna är berikad med troponin, sarcomeric proteiner och de utsöndrade extracellulära matrix proteinerna. Denatureringen dessa komplexa strukturer att göra supercoiled är DNA och dess reproducerbarhet tvivelaktiga. Viktigast av allt, 25% till 40% av mänskliga hjärtmuskelceller är binucleated25, och dessa procentsatser varierar i iPS-derived hjärtmuskelcellerna. Sedan cellväggen är störd i komet-analysen, är exakt bedömning av andelen DNA-skadade celler omöjligt. Därför, när det gäller iPS-CMs, γH2A.X immunofluorescens märkning förfarandet att bedöma DNA-skador är ett förenklat alternativ för komet analysen.
Baserat på dessa resultat och de från tidigare publikationer av vår grupp8,20,21, vi föreslår att, om det finns mer än 10% DNA-skador, bedömas av komet assay eller mindre än 90% av cellerna har noll till fem DDR Foci, då kulturen ska diskvalificeras för stamcellstransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds delvis av nationella hjärta, lungor och blod Institute bidrag RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 och UO1-HL-134764 (till J. Zhang) och av amerikanska hjärtat Association vetenskapliga utveckling Grant 17SDG33670677 (till R. Gitta).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
