Summary
פרוטוקול זה מפרט מונאולייר, שיטה נטולת סרום להפקת ביעילות תאים של hepatocyte מתאי גזע בעלי עוצמה מרבית (hPSCs) בתוך 18 ימים. זה כרוך שישה שלבים כמו hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא ביניים-סוגים כגון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעיים מוחלט, האחורי הקדמי ואת ניצן הכבד ושלתי לפני היווצרות תאים hepatocyte כמו.
Abstract
הכבד מטהר חומרים מזיקים, מפריש חלבונים חיוניים, ומבצע פעילויות מטבולית מפתח, ובכך לקיים חיים. כתוצאה מכך, אי ספיקת כבד-אשר יכול להיגרם על ידי צריכת אלכוהול כרונית, צהבת, הרעלה חריפה, או עלבונות אחרים-הוא מצב חמור שיכול להגיע לדימום, צהבת, תרדמת, ובסופו של דבר מוות. עם זאת, גישות לטיפול בכישלון בכבד, כמו גם מחקרים של תפקוד הכבד ומחלות, היו מעטים בחלקם על ידי חוסר אספקה בשפע של תאי הכבד האנושיים. למטרה זו, פרוטוקול זה מפרט את הבידול היעיל של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך תאים של hepatocyte, מונחה על ידי מפת דרכים התפתחותית המתארת כיצד מצוין גורל הכבד על פני שישה צעדי בידול רצופים. על ידי מניפולציה מסלולים התפתחותיים איתות כדי לקדם בידול הכבד, כדי לדכא במפורש את היווצרות של גורלות תא בלתי רצויים, שיטה זו מפיקה ביעילות אוכלוסיות של ושלתי הכבד האנושי ניצן ו hepatocyte-תאים כמו יום 6 ו -18 של PSC בידול, בהתאמה. הדבר מושג באמצעות שליטה מדויקת באופן זמני של משעולים אותות התפתחותיים, המופעל על ידי מולקולות קטנות וגורמי גדילה במדיום תרבות ללא סרום. הבידול במערכת זו מתרחשת במונאולאיירס ומניב תאים הירופציט המבטאים אנזימים מאפיינים מאופיינים ובעלי יכולת לעבור מודל עכבר של אי ספיקת כבד כרונית. היכולת לייצר ביעילות מספר גדול של תאי כבד אנושיים בתוך מבחנה יש השלכות לטיפול בכשל בכבד, לסינון תרופות, ולמחקרים מכניסטיים של מחלות כבד.
Introduction
המטרה של פרוטוקול זה היא להבדיל ביעילות בתאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך אוכלוסיות מועשר של הכבד ניצן ושלתי ו hepatocyte תאים2. גישה לאספקת מוכן של הכבד האנושי ושלתי ו hepatocyte תאים להאיץ את המאמצים לחקור את תפקוד הכבד ואת המחלות יכול לאפשר טיפולים חדשים השתלת תאים לכשל בכבד3,4, 5. המשך זה הוכיח מאתגרת בעבר מאז hPSCs (אשר כוללים מעובריים והמושרה תאים גזע pluripotent יכול להבדיל לכל תא-סוגי הגוף האנושי; כתוצאה מכך, היה קשה להבדיל באופן בלעדי לאוכלוסיה טהורה של סוג תא אחד, כגון תאי כבד6.
כדי להבדיל בדיוק hPSCs לתוך תאי הכבד, הראשון הוא קריטי להבין לא רק איך תאי הכבד מצוינים אלא גם איך התאים שאינם בתוך הכבד להתפתח. הידע של איך לפתח את התאים שאינם בכבד חשוב לדכא באופן הגיוני את היווצרות של שאינם בכבד במהלך הבידול, ובכך בלעדית המנחה hPSCs לעבר גורל הכבד2. שנית, חיוני להתוות את הצעדים ההתפתחותיים שדרכם hPSCs להבדיל לקראת גורל כבד. ידוע כי hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא מרובים סוגים הידועים כרצף פרימיטיבי (APS), אנדופפיל מוחלט (DE), האחורי הקדמי (PFG) ואת הכבד ניצן ושלתי (LB) לפני יצירת התאים האלה כמו החציט (הפטיטיס). בתחילת העבודה חשף את האותות המציינים את גורל הכבד ואת האותות שדיכא את היווצרות של התאים החלופיים שאינם בכבד (כולל הקיבה, הלבלב, ואת המעיים ושלתי) בכל בחירה התפתחותית השושלת2, מיכל סבן , שמונה.
באופן קולקטיבי, תובנות אלה העניק עלייה ללא סרום, שיטה מונאולייר להבדיל hPSCs לכיוון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעור מוחלט, האחורי הקדמי, הכבד ניצן ושלתי ולבסוף, hepatocyte כמו תאים2. באופן כללי השיטה כרוכה בזריעת hPSCs במונאולייר בצפיפות מתאימה, הכנת שישה קוקטיילים של בידול מדיה (המכיל גורמי גדילה ומולקולות קטנות המתוסתים שיטות איתות התפתחותיות שונות), ו ברציפות הוספת מדיה אלה כדי לגרום לבידול במהלך 18 ימים. במהלך התהליך, אין צורך בשלב ההתיישנות של תאים. של הערה, כי שיטה זו כוללת במפורש אותות לדכא את היווצרות סוגי תאים שאינם של הכבד, גישה זו בידול1 ביתר יעילות יוצר ושלתי כבד ותאים hepatocyte בהשוואה למצב הנמצא בידול שיטות2,9,10,11,12. יתר על כן, הפרוטוקול המתואר בטקסט זה מאפשר את הדור מהר יותר של hepatocytes כי בסופו של דבר לבטא רמות גבוהות יותר של מקדמי שעתוק הכבד ואנזימים מאלה המיוצרים על ידי פרוטוקולים אחרים9,10 , מיכל בן 11 , . שתיים עשרה
לפרוטוקול המתואר כאן יש יתרונות מסוימים בנוגע לפרוטוקולי הבידול הנוכחיים. ראשית, היא כרוכה בבידול מונאולייר של hPSCs, שהוא מבחינה טכנית פשוטה יותר לעומת שיטות בידול תלת ממדיות, כגון אלה המסתמכים על גופים embryoid13. שנית, שיטה זו מנצלת מראש לאחרונה לפיה התאים הניתנים לעור מוחלט (מקודמן מוקדם לתאי הכבד) יכול להיות ביעילות ובמהירות שנוצר בתוך 2 ימים של hpsc בידול2,7, ובכך מאפשר את הבאים ייצור הפטוציטים בטוהר מוגבר. שלישית, בהשוואות זה לצד זה, התאים האחרים המיוצרים על-ידי שיטה זו2 יוצרים אלבומין נוסף ומבטאים רמות גבוהות יותר של גורמי שעתוק בכבד ואנזימים לעומת hepatocyte המיוצרים בשיטות אחרות10, 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת בידול מדיה
הערה: עיין בטבלה של חומרים לקבלת מידע אודות היצרן בנוגע לחומרים וריאגנטים בשימוש.
-
הכנת מדיה בסיסית המוגדרת כימית (CDM)
הערה: CDM2, CDM3, CDM4 ו-CDM5 הם מדיה המוגדרים כימית המשמשים כאמצעי הבסיס להבדיל בין hPSCs תאי הכבד בשלבים שונים. הרכב של מדיה אלה ניתן למצוא בטבלה 1.- כדי להפוך CDM2 או CDM3, להכין פתרון מניות המכיל אלכוהול פוליוויניל (PVA). התמוססות 0.5 g של אבקת PVA ב 50 מ ל של Iscove שונה של בינונית של המדיום (IMDM) כדי ליצור 10 מ"ג/mL מניות PVA.
הערה: מאז PVA אינו מתמוסס בקלות, להכין את התערובת PVA/IMDM בבקבוקון חרוט עם ערבוב רציפה ב ~ 50 ° c על משטח חימום; ערבוב ניתן להשיג בקלות באמצעות מערבב מגנטי. - לאחר PVA מומס הומוגנמית ב IMDM, להסיר את הפתרון PVA מתוך משטח החימום ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
- השתמש במסנן של 0.2 יקרומטר סטרילי כדי לסנן את פתרון pva.
- הכן את ה-CDM2 ו-CDM3 על-ידי שילוב ה-PVA המסונן משלב 1.1.1 ורכיבים שונים שנקנו באופן מסחרי כמתואר בטבלה 1 ובטבלת החומרים. השתמש ביחידות סינון של 0.2 יקרומטר, כדי לסנן את כל המדיה.
הערה: ניתן לאחסן בסיס בסיסי ב-4 ° c אך לא יותר מחודשיים. - הכן את מדיית הבסיס הנותרת CDM4 ו-CDM5 לאחר הטבלה 1.
- כדי להפוך CDM2 או CDM3, להכין פתרון מניות המכיל אלכוהול פוליוויניל (PVA). התמוססות 0.5 g של אבקת PVA ב 50 מ ל של Iscove שונה של בינונית של המדיום (IMDM) כדי ליצור 10 מ"ג/mL מניות PVA.
-
הכנת בידול מדיה
- להכנת פתרונות מניות למולקולות קטנות ולגורמי גדילה, מרכיבים אותם מחדש לפי המלצות היצרנים. לאחסון, סדרת מחלקים לתוך צינורות סטרילי כדי להפחית מחזורי הפשרת הקפאת ולשמור ב-20 ° c או כמומלץ.
הערה: הרכב בידול מדיום לשימוש בשלבי בידול שונים מתואר בטבלה 2 ובשלבים הבאים. - כדי להכין את מדיום בידול, תחילה להפשיר את מולקולות קטנות קפוא ו/או גורמי גדילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש להוציא את הכמות הדרושה של המדיום הבסיסי. אחרון, להכין את התקשורת בידול סופי על ידי הוספת מולקולות קטנות שצוינו וגורמי גדילה למדיום הבסיסי בריכוזים המתאימים (שולחן 2).
הערה: מדיום בידול מוכן לשימוש באופן אידיאלי באותו יום; אחרת ניתן לאחסנו ב -4 ° c ולהשתמש בו תוך שלושה ימים. - באמצעות טיפ פיפטה, לערבב את בינוניות בידול מספר פעמים כדי להבטיח תוספי תזונה מופץ באופן הומוגנטי לפני הוספת המדיום לתאים (למשל, להוסיף 1 מ ל של בידול בינונית לכל טוב של הצלחת 12-טוב.)
- להכנת פתרונות מניות למולקולות קטנות ולגורמי גדילה, מרכיבים אותם מחדש לפי המלצות היצרנים. לאחסון, סדרת מחלקים לתוך צינורות סטרילי כדי להפחית מחזורי הפשרת הקפאת ולשמור ב-20 ° c או כמומלץ.
2. זרע hPSCs על צלחות בצפיפות מוגדרת לבידול
- תאי הפרווה התרבות פלסטיק שישמשו לזריעה עם hPSCs.
- הפשרת המטריצה (למשל, Geltrex) ב -4 ° c בלילה לפני יום השימוש.
- למחרת, לדלל את מטריקס 1:100 על ידי הוספת 500 μL של המטריצה לתוך 50 מ ל של בינונית הנשר השונה של העיט שונה למחצה (DMEM)/F12. מאחר והמטריקס הוא הידרוג'ל שאינו מתכלה בחשיפה לטמפרטורת החדר, כשאתה עובד עם המטריקס, תמיד שומר על הצינורות והמדיה של המטריקס בקרח.
- הערה: המטריצה התפרקה 1:100 ב Dמאמ/F12 ניתן לאחסן ב 4 ° צ' אבל יש להשתמש בתוך 2 חודשים.
- כדי לחלוק לוחית תרבות עם המטריצה, פיפטה את המטריצה המדוללת למספר הדרוש של בארות באמצעות כמות מספקת בלבד של פתרון מטריצה כדי לכסות את פני השטח של הבאר (למשל, להוסיף 0.5 mL של מטריצה אחד טוב של הצלחת 12-טוב או 1 מ ל אחד טוב של 6- צלחת הבאר). במידת הצורך, טלטל את הצלחת בעדינות כדי לוודא שפתרון המטריצה כיסה במלואה את החלק התחתון של הבאר.
- השאירו את הצלחת מצופה המטריקס בחממה 37 ° c לפחות 60 דקות. בטמפרטורה זו, המטריקס מדבר ליצירת. סרט דק בתחתית הבאר
- הערה: לוחות מצופה מטריקס ניתן לשמור בחממה 37 ° c ובשימוש בתוך 3 ימים כל עוד המטריצה לא התייבש.
- לאחר שהוא מגיע לזריעת הבארות עם hPSCs.
- הפסעות וזריעת צלחות מצופות באמצעות hPSCsNOTE: סוכן הדיסוציאציה מכיל אנזימים המשתפשים תאים וחשוב להשאיר את hPSCs בסוכן הדיסוציאציה במשך זמן קצר ככל האפשר.
- כדי הזרע מצופה מטריקס לוחות התרבות עם hPSCs לפני בידול, לגדול מובחן hPSCs כדי > 70% שליטה מסחרית הזמינים mTeSR1 בינונית (לוח חומרים) על פי פרוטוקול של היצרן. זה קריטי למעבר hPSCs לפני שהם הופכים מלאה לחלוטין, כמו hPSCs עשוי להבדיל באופן ספונטני במפגש הגבוה.
הערה: hPSCs חייב להיות karyotyped כדי להבטיח כי אין חריגות כרומוזום לפני השימוש בהם עבור ניסויים. HPSCs המשמש את הפרוטוקול בידול היו שמרו במדיה mTeSR1 ו החוצה כגושים עם EDTA כדי למזער את החריגות karyotypic. Karyotypically כלל-hPSCs חריגים לא צריך לשמש לבידול, כפי שהם עשויים להתרבות באופן חריג במהירות; לפיכך, הצפיפות התאית המומלצת כאן אינה מתאימה לתאים בדרך כלל-חריגים. - כדי זרע hPSCs עבור בידול, מתנאת mTeSR1 מן ברובו-confluent לוחית התרבויות ולהוסיף מסחרית לקנות סוכן דיסוציאציה (טבלת חומרים) כדי לנתק את hPSCs, באמצעות סוכן דיסוציאציה מספיק רק כדי לכסות את פני השטח של ה טוב או תבשיל שבו התאים גדלים (למשל, להוסיף 0.5 mL של סוכן הדיסוציאציה לכל טוב של הצלחת 12-באר, 1 מ"ל לכל טוב של 6-טוב צלחת או 3 מ"ל לכל 10 ס מ צלחת).
- דגירה hPSCs בסוכן הדיסוציאציה ב 37 ° c עבור 5 דקות או עד כמה מושבות להתחיל להתנתק. הקש בעדינות על החלק התחתון של הבאר/הלוח מספר פעמים; לאחר מספר דקות של דיסוציאציה, רוב מושבות hPSC צריך לבוא בחופשיות ההשעיה.
- כדי להוציא hPSCs הנתק מהצלחת, להוסיף 2 מ ל/טוב של Dמאמ/F12 אם עובד עם צלחת 6-הבאר (או 1 mL/גם אם עובד עם צלחת 12-באר) כדי לדלל את סוכן הדיסוציאציה. השתמש בפיפטה באורך 5 מ ל בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשטוף את כל התאים מהמשטח של הבאר; לאסוף מושעה תאים בודדים בשפופרת חרוט 50 mL. לשטוף את הצלחת פעם שנייה עם אותו נפח של Dמאמ/F12 כדי להבטיח שחזור של כל hPSCs.
- כדי 50 mL חרוט מכיל את התאים, להוסיף Dמאמ/F12 כדי לדלל את הנפח המקורי של סוכן הדיסוציאציה על ידי 1:5-1:10 (למשל, אם הנפח המקורי של סוכן הדיסוציאציה היה 1 מ ל, להתאים את הנפח הכולל של הבולם הנייד 10 mL עם DMEM/F12 לדלל סוכן הדיסוציאציה בשעה 1:10)
- צנטריפוגה את hPSCs שנאסף ב-50 mL שפופרת חרוט ב 350 x g עבור 3 דקות ב 4 ° צ' כדי תאים גלולה.
- בזמן מחכה התאים כדי גלולה, מhPSCS מטריצה מן הצלחת שבה הזרע יהיה שנזרע. הבא, להוסיף כמויות מספיקות של mTesR1 בתוספת 1 μM של מסחרית השיגה thiazovivin (מעכבי רוק תרופתי) כדי הנמען בארות לכסות אותם (למשל, להוסיף 0.5 mL mTeSR1 לכל טוב של הצלחת 12-טוב או 1 mL של mTeSR1 לכל טוב של צלחת 6-באר).
הערה: Thiazovivin בריכוז נמוך כלול בשלב זה כדי לשפר את ההישרדות התא היחיד ומכאן את צפיפות הזריעה הבאה של hPSCs. - לאחר תפרידו hPSCs, בזהירות מזהם את supernatant, עוזב את הhPSCs בתחתית הצינור החרוט. Supernatant מכיל סוכן דיסוציאציה אשר לעכב את הדבקה הבאים של hPSCs ולכן, חשוב לבשל את הרוב הגדול של supernatant לפני שתמשיך.
- השהה מחדש את הגלולה הסלולרית בmTeSR1 עם 1 μM של thiazovivin. עם p1000 tte, בעדינות קצוצות 2-3 פעמים כדי להשעות באופן שווה את הגלולה לתא לתוך השעיה תא יחיד. לא מעל-triturate את הגלולה התא כמו כוח מכני מוגזם נזק hPSCs ולהוביל להישרדות התא המסכן.
- לאחר השעיית מחדש של hPSCs, הפיפטה מיד 10 μL של ההשעיה לתוך המטמטר ולספור את מספר התאים. חשוב להתאים את התאים לספירה מהר ככל האפשר, כמו כוח הכבידה יוביל hPSCs באופן טבעי להתיישב לתוך החלק התחתון של שפופרת 50 mL, אשר יהיה לבלבל ספירת תאים מדויקת.
- להתאים את עוצמת הקול של hPSCs מחדש עם thiazovivin-שיושלם mTeSR1 כדי להשיג את הריכוז הרצוי התא לציפוי. לדוגמה, לאחר התאמת עוצמת הקול של hPSCs מחדש, להוסיף 0.5 mL של השעיית התא לתאים 160000-250000 הזרע לתוך כל טוב של הצלחת 12-באר, ובכך להשיג נפח כולל של 1 mL בכל באר (0.5 mL של מדיה נוספה היטב בשלב 2.2.7). אם נעשה שימוש בבארות גדולות או קטנות יותר, שינוי קנה מידה של מספרי תאים/אמצעי אחסון מדיה למעלה או למטה בהתאם.
הערה: חשוב לזרע hPSCs על צפיפות התא שצוין. מדי-confluent hPSCs לא להבדיל ביעילות תחת-confluent hPSCs לא ישרוד היטב במהלך בידול. - טלטל את הצלחת בתבנית צולבת (משמאל, לאחר מכן ימינה; קדימה, ואז אחורה) מספר פעמים כדי לוודא שתאים מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת/טוב. אל מערבולת את הצלחת בתנועה מעגלית, כמו התאים יהיה ליישב במרכז הצלחת/טוב. בדרך כלל, hPSCs יתחיל לדבוק פני השטח של הבאר בתוך ~ 3-30 min. אפשר לתאים לצמוח לפחות 24 שעות לפני התחלת בידול.
- כדי הזרע מצופה מטריקס לוחות התרבות עם hPSCs לפני בידול, לגדול מובחן hPSCs כדי > 70% שליטה מסחרית הזמינים mTeSR1 בינונית (לוח חומרים) על פי פרוטוקול של היצרן. זה קריטי למעבר hPSCs לפני שהם הופכים מלאה לחלוטין, כמו hPSCs עשוי להבדיל באופן ספונטני במפגש הגבוה.
3. הבידול של hPSCs לתוך תאים אנדועורי והכבד ושלתי
- לאחר hPSCs מצופה לפחות 24 שעות (כמתואר בשלב 2.2.12), לפני שתמשיך עם בידול, לבדוק את המבנה של התאים תחת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, עם דגש ספציפי על קוטר וצפיפות של מושבות hPSC מצופה.
הערה: באופן אידיאלי, הגושים צריכים להיות מרווחים בקלות ובגודל המתאים וצפיפות בכל רחבי הבאר לפני שלב 3.2. גדול (כ > 400 μm) או מושבות קטנות (כ < 200 μm) של hPSCs אינם שמישים לבידול (איור 4). אותות הבדלה לא יפעלו באופן שווה ברחבי המושבות hPSC גדולים, המובילים לבידול לא יעיל. מושבות כי הם קטנים מדי לא לשרוד היטב במהלך 3 הימים הראשונים של הבידול hPSC בפרוטוקול זה בידול. אם הצפיפות של hPSCs הזרע נכון, מושבות hPSC לעתים קרובות טופס "גשרים" של תאים ביניהם לבין המפגש הכולל יהיה ~ 30-50% לפני הוספת יום 1 בידול בינוני (איור 4). - אם גדלי המושבה הם אידיאליים בשלב 3.1, המשך ליום 1 של בידול, אשר כרוך בבידול של hPSCs לתוך פס פרימיטיבי קדמי (APS).
- להכין יום 1 APS בידול בינוני על ידי ערבוב כל ריאגנטים המתואר בטבלה 2 באמצעות Cdm 2 (טבלה 1 וסעיף 1.2) כמדיום הבסיס. Pipet לערבב מספר פעמים כדי להבטיח אפילו הפצה של הרכיבים במדיה.
- מנושף כדי להסיר את thiazovivin שיושלם mTeSR1 מן hPSCs מצופה ולשטוף בקצרה hPSCs עם מדיה IMDM. אין לשטוף עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) במקום IMDM, כמו PBS חסר יוני סידן (Ca2 +) ולכן הוא רעיל hPSCs; זה יהיה לשבש את מורפולוגיה התא.
- לאחר שטיפת IMDM קצרה, להוסיף יום 1 בינוני hPSCs. הקלט את הזמן והמקום תאים בחזרה לחממה 37 ° c
- המשך בשלבי הבידול הבאים על-ידי הכנת (טבלה 2) והוספת המדיום בידול בהתאמה לתאים בימים המתאימים (במרווחים של 24 שעות) של בידול סביב אותו הזמן של היום (איור 1). החלף עם מדיה טרייה מדי יום, גם אם ימים רצופים של בידול להשתמש באותו מדיה בידול. בין שינויי מדיה, שטוף תאים פעם אחת עם מדיית IMDM כדי להסיר תאים מתים ושארית של רכיבים בינוניים קודמים.
- כמו בידול מתקדם מעבר לשלב ניצן הכבד, מספרי התאים להגדיל ולכן, להוסיף מדיה יותר לכל הטוב של הצלחת כדי להבטיח את כמות גורמי בידול וחומרים מזינים לא מגביל. לדוגמה, להוסיף 1 mL בידול בינוני לכל טוב של 12-ובכן בתחילה בימים 1 עד 6 של בידול אבל להוסיף 1.5-2 מ ל של מדיה בידול הבאים בימים מאוחרים יותר של בידול (ימים 7 עד 18 של בידול).
4. אפיון תאים אנדועורי והכבד ושלתי על ידי כתמים חיסוני
- הכנת מאגר חוסם: 10% חמור סרום + 0.1% טריטון X100 ב מלוחים באגירה של פוספט (DPBS).
- הכן מאגר כתמים: 1% הנסיוב החמור + 0.1% טריטון X100 ב DPBS.
- מרוב מדיום מתאים. בצלחת של 12 ומטה
- להוסיף 4% פאראפורמלדהיד (ב DPBS) עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן תאים ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS.
- הוסף מאגר חסימה עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לחסום ולחלחל לתאים הקבועים.
- מדלל את הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדן העיקרי מדולל במאגר מכתים. (ראה טבלת חומרים לדילול של נוגדנים).
- הכתם את התאים לילה ב 4 ° c.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 0.1% טריטון X100 ב DPBS.
- הוסף כתם נוגדן משני במאגר מכתים עבור 1 h בטמפרטורת החדר. (ראה טבלת חומרים לדילול נוגדנים משניים.)
- הסר את הנוגדן המשני והוסף DAPI עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבצע כתמים גרעיניים.
- לשטוף פעמיים עם 0.1% טריטון X100 ב-DPBS כדי להסיר נוגדן עודף DPBS.
- התנהלות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית עם Zeiss משקיף D1. לחילופין, תוכלו לאחסן את צלחת החנות ב -4 מעלות צלזיוס עד לביצוע ההדמיה. לקבלת תוצאות צפויות, ראה איור 3.
5. אפיון של הכבד ושלתי על ידי תא המופעל פלואורסצנטית-מיון (FACS) ניתוח
הערה: השתמש FACS כדי בדיוק לכמת את אחוז AFP + הבדיל תאים LB הצצים ביום 6 של בידול. בצע את אותם צעדים כדי לכמת את אחוז ה-ALB + מובחנים hepatocytes ביום 18 של בידול.
- המשלים נוגדן אנטי AFP.
- להוסיף R-phycoerythrin כדי נוגדן נגד AFP בריכוז של (0.55 μg/μL) באמצעות ערכת הקונקוארירין R-phyco, (ראה טבלת חומרים).
הערה: ודא שהנוגדנים מטוהרים ומחדש במאגרים שאינם מכילים amines. ודא כי כמות הנוגדן המשמש תגובת תיוג חייב להיות פחות מהסכום של PE (כלומר, 60 μg של נוגדן עם 100 μg של PE). בניין מסכן של נוגדנים עלול. להוביל לתוצאות לא אמינות - הוסף 1 μL של צירוף משנה עבור 10 μL של נוגדן שניתן לתייג. מערבבים בעדינות.
- הסר את שילוב ה-R-PE (100 μL) ופיפטה את התערובת שלעיל ישירות לחומר ה-R-PE.
- הניחו את הכובע בחזרה והשאירו את המבחנה עומדת במקום 3 בחושך בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה עבור 3 שעות או יותר, להוסיף 1 μL של כמובן מגיב עבור 10 μL של נוגדנים בשימוש. ניתן להשתמש במשלים לאחר 30 דקות.
- החנות נוגדן מצומדת ב -4 ° c.
- לשטוף הבדיל או מובחן hPSCs ב 6-היטב בפורמט עם Dמאמ/F12.
- התייחס בקצרה עם סוכן הדיסוציאציה (1 mL/גם בצלחת 6-באר) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עד שהתאים מתנתק. הקציר והכתם הן מובחן hPSC והבדיל בתאי הכבד תאים זהים ולנתח במקביל באותו ניסוי כדי להבטיח ספציפיות של כתמי נוגדנים.
- הקש בעדינות על צלחת פטרי כדי לנתק תאים. השתמש בפיפטה p1000 כדי לנתק את התאים מהצלחת ולאסוף תאים בשפופרת חרוט 50 mL. ודא שהתאים מנותקים בעיקר לפני שתמשיך בשלב הבא. לאחר מכן, לשטוף בארות פעמיים יותר עם מאגר 1xDPBS לאסוף תאים שיורית.
- בצינור החרוט 50mL, לדלל את הסוכן הדיסוציאציה ב ~ 5 כרכים של מאגר DPBS 1x. Triturate בקפדנות 3-4 פעמים עם p1000 הצינורות כדי להבטיח את כל התאים הם הנתק לתוך תאים בודדים.
הערה: הכרחי ליצור תאים בודדים לפני הצנטריפוגה או הגושים, לאחר מכן לא ניתן לנתק בקלות. עם זאת, לא מעל triturate זה עלול לגרום נזק לשלמות התא. ספור את מספר התאים והשתמש בחלק המומלץ של תאים ליחס הנוגדן, שכבר עבר אופטימיזציה עבור רקע מינימלי וזיהוי אותות מרביים. - צינורית צנטריפוגה המכילה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- מרוב דאגה לא להפריע. לגלולה הסלולרית
- השהה מחדש את כדורית התאים באופן יסודי במאגר קיבוע/סלסול כדי ליצור השעיה תא בודד ולתקן על הקרח ב -4 ° c עבור 20 דקות. הערה כדי להעביר לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL. יתר על כן, שימוש של 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה בשלב זה מאפשר את הגלולה תא להפקיד בצורת V-בפינה של הצינור, מזעור אובדן התאים במהלך שוטף.
- לשטוף כל גלולה עם 1.8 mL של סלסול/לשטוף מאגר פעמיים. השהה מחדש את כדורית התאים באופן יסודי ב סלסול/לשטוף מאגר על ידי פיפטה ערבוב 6 פעמים עם p1000. אז, צנטריפוגה, להסיר supernatant ולחזור על תהליך השטיפה עם 1.8 mL של סלסול/לשטוף מאגר.
- השהה מחדש את כדורית התאים בתוך סלסול/לשטוף מאגר כך יהיה 100 μL/כתם בודד ולאחר מכן להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL.
הערה: זה הכרחי ליצור השעיה תא בודד בשלב זה לפני כתמים נוגדן. אגרגטים של תאים לא יהיה מוכתם וכך יהיה לבלבל את ניתוח FACS. יתר על כן, שימוש של 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה בשלב זה מאפשר את הגלולה תא להפקיד בצורת V-בפינה של הצינור, מזעור אובדן התאים במהלך שוטף. - לאחר השעיית תאים מחדש במאגר ה-FACS, מחלקים אותם לצינורות בודדים מ-mL (הן מכתמים בלתי מוכתמים והן מדגימות נוגדנים מוכתמות).
- כתם עם anti-AFP-PE 0.33 μL לכל 150,000 תאים עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לדוגמה, עבור כתם בודד 100 μL, כתם כדלקמן: 0.33 μL של a-AFP PE ו 100 μL של מאגר סלסול/לשטוף. להשעות את התאים עם p200 היטב כדי להבטיח אפילו כתמים.
הערה: רק פיפטה-מערבבים ולא מערבולת כי זה עשוי להפחית את יציבות החלבון. - לשטוף, להשעות מחדש את התאים פעמיים ב 1-2 mL של סלסול/לשטוף מאגר (1.9 mL/בודדים כתם) ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לשטוף תאים עם לא פחות מ 1-2 mL של פרם/לשטוף מאגר כדי להבטיח כביסה מספקת.
הערה: רק פיפטה לערבב ולא מערבולת כי זה עשוי להפחית את יציבות החלבון. לאחר תפרידו, מטפי את supernatant בקפידה כדי למנוע מתאים לבטל לינה ולהסיר כמו supernatant הרבה ככל האפשר כדי למזער את הנוגדן לבצע-over ולהבטיח שטיפת מלאה יותר. - השהה מחדש כל גלולה שטף ב 300 μl של סלסול/לשטוף מאגר ומסננים אותו דרך מסנן 100 יקרומטר לתוך צינור facs כדי להתאמץ גושים גדולים של תאים לפני ניתוח facs.
- לנתח את התאים בזרם האריה FACS הזרימה cy, בערוץ PE. לנתח מינימום של 10,000 אירועים עבור כל כתם בודד, ואירועים ניתוח על ידי המוסריות של FSC-A/מדינת-מדינת-באמצעות ניתוח, בחר את תא הסינגטים על-ידי בדיקה על FSC-W/FSC-H ולאחר מכן מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-וואט-W.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר 24 שעות של בידול APS, המושבות בדרך כלל לאמץ מורפולוגיה שונה מאשר מושבות מובחן במקביל עם אובדן של גבול בהיר כי בדרך כלל להקיף המושבות hPSC. מורפולוגית, בתאי פס פרימיטיבי בדרך כלל יש גבולות משונן והם התפשטה יותר ופחות קומפקטי מ hPSCs-זה מעורר המעבר אפיתל-to-mesenchal כמו בתאי הפיצוץ epiuriבתאים להבדיל וכניסה לתוך פרימיטיבי רצף בvivo. אם גודל המושבה של הhPSCs לפני הבידול היה גדול מדי, יהיה מרכז גלוי לעין הכוללת תאים מובחן. יש להיפטר מתרבויות המכילות גושים גדולים כאלה, מכיוון שמרכזי המושבה הללו לא יוכלו לבלבל ביניהם. אם הגושים של הגודל והצפיפות הנכונים היו מצופים, APS בידול הוא מאוד מאוד ואחיד, יצירת 99.3 ± 0.1% MIXL1-Gfp+ האוכלוסייה ברצף פרימיטיבי (MIXL1 הוא סמן הרצף הפרימיטיבי)7. שים לב כי כמה מוות תאים נצפתה לאחר 24 שעות של בידול APS.
ביום 2 של בידול, התאים הפרימיטיביים ברצף יש הבדיל לתוך יום 2 בתאי עור אנדוסופית, הרוב המכריע של אשר לבטא SOX17 (איור 2) ו FOXA2. בעשרות ניסויים עצמאיים עם 14 שורות hESC ו היפנוסק (כולל H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 ו-HUF58C4), גישה זו באופן בלתי עקבי, בעקביות וביעילות שנוצרו אוכלוסיות מוחלטת טהור הסופי (94.0% ± 3.1%)7. שיטה זו כדי ליצור אנדופיל מוחלט מ hPSCs תשואות אחוזים גבוהים יותר של אוכלוסיות CXCR4+pdgfra- העור לעומת הגישות האחרות של האנדופיל2,14.
ביום השלישי של הבידול, הבדיל האנדועור לושלתי המעי הקדמי שנראה מצולע בצורה (איור 1). מאוחר יותר, על ידי 6 ימים של בידול, המעי הקדמי ושלתי להבדיל ניצן הכבד ושלתי להביע AFP, TBX3, ו HNF4A (איור 3). על פני שלושה קווי hESC (H1, H7, H9 hESCs), שיטה זו מייצרת יום 6 AFP+ הכבד ושלתי טופס ביעילות של 89.0 ± 3.1% (איור 2). לבסוף, לאחר 18 ימים של בידול כבד מ hPSCs, אלבומין+ hepatocyte תאים מופיעים. מורפולוגית, הם מופיעים אפיתל, ויוצרים גבולות בהירים המזכירים של המרה קאנאליאולי (איור 1). בשלב זה, הציטופלסמה של היום 18 Hepatocytes הנגזר מופיע כהה יותר מאשר הגרעין (איור 1).
איור 1: סכמטית של אסטרטגיה בידול ומורפולוגיה של hPSCs מובחן, הבחנה אנדועור ו hepatocyte תאים כמו. תהליך הבידול וציר הזמן הוצגו. קיצורים: d = day, hPSC = האדם בתאי גזע רב עוצמה, APS = פס פרימיטיבי קדמי, DE = באנדופפיל מוחלט, PFG = האחורי במעי, LB = הכבד ניצן ושלתי, HP = hepatocyte ושלתי, הפטיטיס = hepatocyte כמו תאים. סרגל קנה מידה = 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אחוז היום 1 MIXL1 + הרצף הפרימיטיבי, יום 2 SOX17 + מוחלט (def) אנדועור, יום 6 AFP + הכבד ניצן ושלתי ו-ALB ואוכלוסיות hepatocyte כפי שמוצג על ידי FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח חיסוני של יום 6 ושלתי הכבד. hPSC היו הבדיל הראשון לתוך הכבד ניצן ושלתי, אשר היו מוכתם בכבד ניצן שעתוק גורמים HNF4A (אדום), TBX3 (ירוק), כמו גם cytoplasmic כבד ניצן סמן AFP (אדום). גרעינים היו מוכתמים נגד DAPI (כחול) כדי להעריך את מספר התא הכולל. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צפיפות התא זריעת hPSCs. נמוך (משמאל) וצפיפות התאים המתאימה (האמצעית והימנית). סרגל קנה מידה = 1,000 μm. חץ מצביע על "גשרים" בין מושבות של תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| בסיס בסיסי | הרכב מדיום בסיס |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% שומנים מרוכזים, 0.7 μg/mL האדם רקומביננטי אינסולין, 15 μg/mL מועבר, 18 ננומטר 1-thioglycerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% שומנים מרוכזים, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% שומנים מרוכזים, 15 μg/mL Transferrin |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% גלוטמקס |
טבלה 1: הרכב של מדיה מוגדרת כימית CDM2, CDM3, CDM4, ו CDM5.
| שלבי בידול | משך | גורמים | נות | בסיס בסיסי |
| יום 1-רצף פרימיטיבי | יום אחד | פעילות | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 μM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| יום 2 עור מוחלט | יום אחד | פעילות | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| היום 3 האחורי הקדמי | יום אחד | A83 | 1 μM | |
| מיכל הגנה | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| יום 6 כבד ניצן ושלתי | 2 ימים בלבד | פעילות | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| פורסאולין | 1 μM | |||
| יום אחד | פעילות | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| פורסאולין | 1 μM | |||
| יום 12 ושלתי הכבד | שישה ימים | BMP4 | 10 μg/mL | |
| OSM | 10 ng/mL | |||
| דקסמטסון | 10 μM | |||
| פורסאולין | 10 μM | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 מיקרומטר | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| אינסולין | 10 μg/mL | |||
| יום 18 הפטציטים | שישה ימים | דקסמטסון | 10 μM | |
| פורסאולין | 10 μM | CDM4 או | ||
| Ro4929097 | 2 מיקרומטר | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| אינסולין | 10 μg/mL |
שולחן 2: הרכב בידול מדיה.
| עיה | הסיבה האפשרית | פתרון מוביל |
| תאים במרכז המושבה אינם מבדילים | i) גודל המושבה היה גדול במידה רבה, תאים באמצע המושבות הגדולות לא היו נגישים לאותות בידול | i) בדוק את ספירת התאים הtechnqiue. |
| ii) חלוקה אחידה של הגושים הממוזגים במרכז הבאר (או הפריפריה), ויוצרים מושבות גדולות מאוד. | ii) מטלטל את הצלחת בצורה מרובת-ידיים כדי לפזר באופן שווה את הגושים במהלך הציפוי, ולבדוק במיקרוסקופ לפני הכנסתם לחממה. | |
| iii) התאים קיבלו מספיק אותות בידול | iii) להוסיף כמויות מתאימות של בידול מדיה: להוסיף 1 מ ל של בינוני בכל טוב בצלחת 12-טוב ו-3 מ"ל לכל טוב בצלחת 6-באר | |
| יעילות ירודה של בידול | i) התחלת תרבות התא הבדיל חלקית | i) השתמש באצווה חדשה באיכות גבוהה של hPSCs מובחן |
| ii) המושבות היו מאוד בצפיפות, ויצרו גיליון תאים שוטף | ii) תאי הזרע וספירת התאים המדויק לבידול, וטלטול אחיד כדי להפיצה | |
| iii) מדיה שיורית ואותות לא רצויים לא נשטפו עקב כביסה בלתי מספקת | iii) mTeSR1 או מדיה השראה משלב קודם של בידול, יחסמו בידול; לשטוף תאים עם IMDM לפני הוספת בידול בינוני | |
| iv) כביסה קשה מדי; תנאי כביסה לא הולמים משבשים באופן חמור את מורפולוגיה התא | iv) לפני הוספת הבחנה בינונית , שטוף בקצרה עם imdm. שימוש ב-DPBS (או מדיה עם מדיה מסוגים שונים או קרים) או כביסה מורחבת, עלול לפגוע במבנה התאים ובכדאיות | |
| v) תקופה ממושכת או מקוצרת של שלבי בידול, ארוך או קצר יותר ממומלץ. | v) לדבוק בתזמונים המומלצים עבור כל שלב של בידול. |
שולחן 3: בעיות פוטנציאליות והגורמים האפשריים והפתרונות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מאפשרת את הדור של אוכלוסיות מועשר של ושלתי הכבד ניצן, ולאחר מכן התאים של hepatocyte, מ hPSCs. היכולת ליצור אוכלוסיות מועשר של תאי כבד אנושיים חשובה לניצול מעשי של תאים כאלה. השיטות הקודמות להפקת hepatocytes מ hPSCs הניבו אוכלוסיות תאים טמא המכיל הן הכבד והן תאים שאינם בכבד, על השתלת לתוך מכרסמים, הניבו עצם וסחוס בנוסף לרקמת הכבד15. מכאן שדיכוי מפורש של בידול שאינו כבד הוא קריטי להפקת אוכלוסיות כבד מועשר שעשויות להתאים למגוון יישומים.
בעיקר, ציפוי מבוקרת של hPSCs בשלב הראשון מאוד חיוני עבור יעיל בידול הזרם. חשוב למדויק צלחת hPSCs בצפיפות מסוימת עבור בידול, ו כדי להפיץ באופן שווה את hPSCs אלה על פני הבאר או הצלחת במהלך תהליך של ציפוי. לדוגמה, עבור כל באר של 12-היטב צלחת, seed 160,000 כדי 250,000 hPSCs לכל טוב; בסך הכל, זה הכרחי כדי לבדוק את צפיפות התא הזריעה וכיצד לבחון בסופו של דבר את צפיפות התא המתאימה לכל קו תא (איור 4). אם hPSCs רבים מדי, הם יוצרים מושבות גדולות, אשר ישפיעו לרעה על יעילות הבידול, כאשר תאים באמצע המושבות הגדולות נגישים פחות לאותות הבדלה בהשוואה לתאים הסמוכים לפריפריה; בנוסף, מושבות של גדלים הטרוגנית יציגו בעיות דומות. אם צפיפות התא נמוכה מדי (למשל, מתחת 200,000 תאים/טוב של 12-באר צלחת), אז לא יכול להיות חומר מספיק לבידול ומוות תאים נרחב ניתן לצפות. השיטה להזדקנות וזריעה שתוארה לעיל יוצרת בעקביות גושים hPSC בגודל המתאים עבור בידול במורד הזרם.
מגבלה אחת של שיטה זו היא כי תאים hepatocyte שנוצר אינם זהים הפטוציטים בוגרים, כמו תאים הנגזרים hPSC עדיין לבטא את סמן הכבד בוגר AFP. יתר על כן, פעילות CYP3A4 אנזימטית היא כ 55 פעמים נמוך יותר בתאים אלה hPSC-נגזר הופק בהשוואה לעומת האדם הראשי בוגרים hepatocyte. האתגר המגיע יהיה להבשיל אלה hepatocyte הנגזרות התאים הנגזרים לתוך המלא, מבוגרים כמו תאים. מגבלה שנייה היא שהבידול היעיל תלוי מאוד בצפיפות ההתחלתית של התאים ולכן, חשוב מאוד לזרע בדחיסות המומלצת ולפזר אותם באופן שווה על פני הצלחת (שולחן 3).
בסך הכל, פרוטוקול זה מייצר הכבד ניצן ושלתי ו hepatocyte תאים כמו ב89.0 ± 3.1% טוהר לפחות 3 שורות hPSC. שנית, התאים של hepatocyte הביעו אנזימים בכבד, הפריש אלבומין האנושי והביע רמות גבוהות יותר של גנים בכבד מאשר תאים שנוצרו באמצעות גישות בידול. בסופו של דבר, התאים hepatocyte כתוצאה לא רק מציגים פונקציות hepatocyte מסוימים בלתי מתורבת, אבל החשוב ביותר הם יכולים לתפקד במידה מסוימת vivo, כפי שהם יכולים לעבור מודל העכבר של פציעה בכבד כרונית ולשפר לטווח קצר הישרדות2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים בינג Lim לדיונים ומכון סטנפורד עבור ביולוגיה של תאי גזע & רפואה רגנרטיבית לתמיכה בתשתיות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית (DISC2-10679) ואת סטנפורד-UC ברקלי מכון תאי גזע של המכון (ל L.T.A. ו K.M.L.) ואת סטנפורד בקמן המרכז לרפואה מולקולרית וגנטית, כמו גם אנונימי, משפחות בקסטר ודיג'נובה (ל-K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
- Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
- Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
- Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
- Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
- Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
- Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
- Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
- Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
- Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).
