Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव

Published: June 11, 2019 doi: 10.3791/58975
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine, Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल में 18 दिनों में मानव pluripotent स्टेम सेल (HPSCs) से hepatocyte की तरह कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए एक monolayer, सीरम मुक्त विधि का विवरण. यह छह चरणों पर जोर देता है क्योंकि एचपीएससी ने हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं को बनाने से पहले छह चरणों को क्रमिक रूप से मध्यवर्ती सेल-प्रकारों जैसे आदिम लकीर, निश्चित एंडोडर्म, पीछे की ओर फोरगट और यकृत कली संतति में अंतर किया है।

Abstract

जिगर हानिकारक पदार्थों detoxifies, महत्वपूर्ण प्रोटीन स्रावित करता है, और महत्वपूर्ण चयापचय गतिविधियों को निष्पादित करता है, इस प्रकार जीवन को बनाए रखने. नतीजतन, जिगर की विफलता-जो पुरानी शराब का सेवन, हेपेटाइटिस, तीव्र विषाक्तता, या अन्य अपमान की वजह से हो सकता है- एक गंभीर स्थिति है कि खून बह रहा है, पीलिया, कोमा, और अंत में मौत में खत्म कर सकते हैं. हालांकि, जिगर की विफलता के इलाज के लिए दृष्टिकोण, साथ ही जिगर समारोह और रोग के अध्ययन, मानव जिगर की कोशिकाओं की भरपूर आपूर्ति की कमी से भाग में stymied किया गया है. इस अंत में, इस प्रोटोकॉल में मानव pluripotent स्टेम सेल (एचपीएससी) के कुशल भेदभाव का विवरण हेपेटोसाइट की तरह कोशिकाओं में, एक विकासात्मक रोडमैप द्वारा निर्देशित है जो बताता है कि कैसे जिगर भाग्य लगातार छह भेदभाव चरणों में निर्दिष्ट किया जाता है। जिगर भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए और स्पष्ट रूप से अवांछित सेल भाग्य के गठन को दबाने के लिए विकास संकेत नदेह पथ जोड़ तोड़ करके, इस विधि कुशलतापूर्वक मानव जिगर कली संतति और hepatocyte की तरह कोशिकाओं की आबादी उत्पन्न दिन 6 और पीएससी भेदभाव के 18, क्रमशः. यह एक सीरम मुक्त संस्कृति माध्यम में छोटे अणुओं और विकास कारकों द्वारा लागू विकास संकेतन रास्ते के लौकिक-सटीक नियंत्रण के माध्यम से हासिल की है। इस प्रणाली में भेदभाव monolayers में होता है और पैदावार hepatocyte की तरह कोशिकाओं है कि व्यक्त विशेषता hepatocyte एंजाइमों और पुरानी जिगर की विफलता के एक माउस मॉडल engraft करने की क्षमता है. कुशलतापूर्वक इन विट्रो में मानव जिगर की कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न करने की क्षमता जिगर की विफलता के इलाज के लिए असर है, दवा स्क्रीनिंग के लिए, और जिगर की बीमारी के मशीनी अध्ययन के लिए.

Introduction

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मानव pluripotent स्टेम सेल (एचपीएससी) जिगर कली संतानों और hepatocyte की तरह कोशिकाओं2की समृद्ध आबादी में कुशलता पूर्वक अंतर है. मानव जिगर संतति और hepatocyte की तरह कोशिकाओं की एक तैयार आपूर्ति करने के लिए प्रवेश जिगर समारोह और रोग की जांच करने के प्रयासों में तेजी लाने और जिगर की विफलता के लिए नए सेलुलर प्रत्यारोपण चिकित्सा सक्षम हो सकता है3,4, 5. यह अतीत में चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है के बाद से hPSCs (जो भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल शामिल हैं) मानव शरीर के सभी सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं; फलस्वरूप, उन्हें केवल एकल कोशिका-प्रकार की शुद्ध जनसंख्या में अंतर करनाकठिन हो गया है, जैसे यकृत कोशिकाएं 6।

ठीक जिगर की कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए, पहले यह न केवल कैसे जिगर की कोशिकाओं को निर्दिष्ट कर रहे हैं, लेकिन यह भी कैसे गैर जिगर सेल प्रकार विकसित समझने के लिए महत्वपूर्ण है. कैसे गैर जिगर कोशिकाओं का विकास का ज्ञान भेदभाव के दौरान गैर जिगर वंश के गठन को तार्किक रूप से दबाने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे विशेष रूप से एक जिगर भाग्य2की ओर hPSCs मार्गदर्शन . दूसरा, यह कई विकासात्मक चरणों जिसके माध्यम से hPSCs एक जिगर भाग्य की ओर अंतर वर्णन करने के लिए आवश्यक है. यह ज्ञात है कि एचपीएससी ने हेपेटोसाइट-जैसे कोशिकाओं (एचईपी) बनाने से पहले कई सेल-प्रकारों में क्रमिक रूप से अंतर किया है जिसे आदिम लकीर (एपीएस), निश्चित एंडोडर्म (डीई), पश्च फोर्ट (पीएफजी) और यकृत कली संतति (एलबी) के रूप में जाना जाता है। इससे पहले काम जिगर भाग्य और संकेत है कि वैकल्पिक गैर जिगर सेल प्रकार के गठन को दबा संकेत से पता चला (पेट सहित, अग्नाशय, और आंतों संतति) प्रत्येक विकासवंशी पसंद2पर , 7 , 8.

सामूहिक रूप से, इन अंतर्दृष्टि आदिम लकीर, निश्चित endoderm, पीछे foregut, जिगर कली संतति और अंत में, hepatocyte की तरह कोशिकाओं2की ओर hPSCs अंतर करने के लिए एक सीरम मुक्त, मोनोलेयर विधि को जन्म दिया है. कुल मिलाकर विधि एक उचित घनत्व पर एक मोनोलेयर में hPSCs के बोने शामिल है, भेदभाव मीडिया के छह कॉकटेल की तैयारी (विकास कारकों और छोटे अणुओं है कि विभिन्न विकासात्मक संकेतन रास्ते को विनियमित युक्त), और क्रमिक रूप से 18 दिनों के दौरान भेदभाव पैदा करने के लिए इन मीडिया को जोड़ने. इस प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं के पासिंग की आवश्यकता नहीं है। नोट की, क्योंकि इस विधि स्पष्ट रूप से संकेत है कि गैर-जिगर सेल प्रकार के गठन को दबाने भी शामिल है, इस भेदभाव दृष्टिकोण1 और अधिक कुशलता से जिगर संतति और hepatocyte की तरह कोशिकाओं वर्तमान की तुलना से उत्पन्न करता है विभेद नकरने के तरीके2,9,10,11,12. इसके अलावा, इस पाठ में वर्णित प्रोटोकॉल hepatocytes की तेजी से पीढ़ी है कि अंततः अन्य प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित उन लोगों की तुलना में यकृत प्रतिलेखन कारकों और एंजाइमों के उच्च स्तर को व्यक्त सक्षम बनाता है9,10 , 11 , 12.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल वर्तमान भेदभाव प्रोटोकॉल पर कुछ लाभ है. सबसे पहले, यह hPSCs के मोनोलेयर भेदभाव पर जोर देता है, जो तकनीकी रूप से तीन आयामी भेदभाव तरीकों की तुलना में सरल है, जैसे कि वे जो भ्रूणीय निकायों13पर भरोसा करते हैं। दूसरा, इस विधि एक हाल ही में अग्रिम जिससे निश्चित endoderm कोशिकाओं (जिगर की कोशिकाओं के लिए एक प्रारंभिक अग्रदूत) कुशलतापूर्वक और तेजी से hPSC भेदभाव2के 2 दिनों के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है ,7,इस प्रकार बाद को सक्षम करने से शोषण बढ़ी हुई शुद्धता के साथ hepatocytes का उत्पादन. तीसरा, साथ-साथ तुलना में, इस विधि द्वारा उत्पादित hepatocyte की तरह कोशिकाओं2 अधिक ALBUMIN उत्पादन और अन्य तरीकों में उत्पादित hepatocytes की तुलना में यकृत प्रतिलेखन कारकों और एंजाइमों के उच्च स्तर को व्यक्त10, 11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. भेदभाव मीडिया की तैयारी

नोट: उपयोग की जाने वाली सामग्री और अभिकर्मकों के बारे में निर्माता जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें।

  1. आधार रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया (सीडीएम) की तैयारी
    नोट:     CDM2, CDM3, CDM4 और CDM5 रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया है कि विभिन्न चरणों में जिगर की कोशिकाओं के लिए hPSCs differentiating hPSCs के लिए आधार medias के रूप में उपयोग किया जाता है. इन मध्याह्न कोंबियों की संरचना सारणी 1में पाई जा सकती है।
    1. CDM2 या CDM3 बनाने के लिए, polyvinyl शराब (PVA) युक्त एक स्टॉक समाधान तैयार करें। Iscove के संशोधित Dulbecco के मध्यम (IMDM) के 50 एमएल में 0.5 ग्राम PVA पाउडर भंग एक 10 mg/
      नोट: चूँकि पीवीए आसानी से घुल नहीं जाता है, इसलिए पीवीए/आईएमडीएम मिश्रण को एक शंकु फ्लास्क में तैयार करें जिसमें एक हीटिंग पैड पर $ 50 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर हलचल होती है; एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करके हिलाने को आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।
    2. PVA के बाद सजातीय रूप से IMDM में भंग कर दिया है, हीटिंग पैड से PVA समाधान को हटा दें और यह कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. PVA समाधान फ़िल्टर करने के लिए एक बाँझ, 0.2 डिग्री फ़िल्टर का उपयोग करें।
    4. चरण 1.1.1 से फ़िल्टर किए गए PVA और विभिन्न व्यावसायिक रूप से खरीदे गए घटकों को तालिका 1 और सामग्री तालिका में उल्लिखित के रूप में संयोजन करके CDM2 और CDM3 तैयारकरें। सभी मीडिया फ़िल्टर करने के लिए बाँझ, 0.2 डिग्री फ़िल्टर इकाइयों का उपयोग करें।
      नोट: बेस माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन अब से अधिक 2 महीने के लिए।
    5. तालिका 1के बाद शेष आधार मीडिया CDM4 और CDM5 तैयार करें।
  2. भेदभाव मीडिया की तैयारी
    1. छोटे अणुओं और विकास कारकों के लिए शेयर समाधान तैयार करने के लिए, उन्हें निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार पुनर्गठन. भंडारण के लिए, बाँझ ट्यूबों में aliquot फ्रीज-थॉव चक्र को कम करने और -20 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए या के रूप में सिफारिश की।
      नोट: विभिन्न विभेदन अवस्थाओं में प्रयुक्त होने वाले विभेदन माध्यम की संरचना का वर्णन सारणी 2 और निम्नलिखित चरणों में किया गया है।
    2. विभेदन माध्यम तैयार करने के लिए, पहले जमे हुए छोटे अणुओं और/या कमरे के तापमान पर वृद्धि कारकों thaw. इसके बाद, आधार माध्यम की आवश्यक राशि को बाहर कर दिया जाए। अंतिम, उपयुक्त सांद्रता (सारणी2) में निर्दिष्ट छोटे अणुओं और वृद्धि कारकों को आधार माध्यम में जोड़कर अंतिम विभेदन माध्यम तैयार कीजिए।
      नोट: ताजा तैयार भेदभाव माध्यम आदर्श रूप से एक ही दिन इस्तेमाल किया जाना चाहिए; अन्यथा इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और तीन दिनों के भीतर उपयोग किया जा सकता है।
    3. एक पिपेट टिप का उपयोग करना, अलग करने के लिए मध्यम मिश्रण कई बार सुनिश्चित करने के लिए की खुराक समोठ रूप से कोशिकाओं को मध्यम जोड़ने से पहले वितरित कर रहे हैं (उदा., एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए भेदभाव माध्यम के 1 एमएल जोड़ें.)

2. भेदभाव के लिए निर्धारित घनत्व पर प्लेट्स पर बीज एचपीएससी

  1. कोट सेल संस्कृति प्लास्टिक कि hPSCs के साथ बोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    1. मैट्रिक्स (उदा., Geltrex) उपयोग के दिन से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर था।
    2. अगले दिन, ठंड Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) / मैट्रिक्स के बाद से एक hydrogel है कि irreversibly कमरे के तापमान के संपर्क में polymerizes, जब मैट्रिक्स के साथ काम कर रहा है, हमेशा बर्फ पर मैट्रिक्स ट्यूबों और मीडिया रखना.
    3. नोट: DMEM/F12 में भंग मैट्रिक्स 1:100 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है लेकिन 2 महीने के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    4. मैट्रिक्स के साथ एक संस्कृति प्लेट कोट करने के लिए, अच्छी तरह से की सतह को कवर करने के लिए मैट्रिक्स समाधान की सिर्फ पर्याप्त मात्रा का उपयोग कर कुओं की आवश्यक संख्या में पतला मैट्रिक्स pippette (उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली या 1 एमएल एक अच्छी तरह से एक 6- के लिए मैट्रिक्स के 0.5 एमएल जोड़ें अच्छी तरह से प्लेट). यदि आवश्यक हो, तो प्लेट को धीरे से हिलाकर यह सुनिश्चित करें कि मैट्रिक्स समाधान पूरी तरह से अच्छी तरह से नीचे आ गया है।
    5. मैट्रिक्स लेपित प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम 60 मिनट के लिए छोड़ दें। इस तापमान पर, मैट्रिक्स अच्छी तरह से नीचे एक पतली फिल्म बनाने के लिए polymerizes.
    6. नोट: मैट्रिक्स लेपित प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है और 3 दिनों के भीतर उपयोग किया जा सकता है जब तक मैट्रिक्स सूख नहीं गया है।
    7. एचपीएससी के साथ कुओं को बोने से तुरंत पहले लेपित कुओं से शेष मैट्रिक्स समाधान को प्रेरित करें।
  2. HPSCsNOTE के साथ लेपित प्लेटों को पास करना और सीडिंग करना: वियोजन एजेंट में एंजाइम होते हैं जो कोशिकाओं को अलग करते हैं और संभव के रूप में एक टाइमपैन की कमी के लिए विच्छेदन एजेंट में एचपीएससी को छोड़ना महत्वपूर्ण है।
    1. भेदभाव से पहले hPSCs के साथ मैट्रिक्स लेपित संस्कृति प्लेटों बीज करने के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध mTeSR1 मध्यम (सामग्री कीतालिका) में undifferentiated hPSCs और 70% संगम हो जाना। यह पारित करने के लिए महत्वपूर्ण है इससे पहले कि वे पूरी तरह से confluent हो जाते हैं, के रूप में hPSCs स्वतः उच्च संगम पर अंतर कर सकते हैं.
      नोट: hPSCs उन्हें प्रयोगों के लिए उपयोग करने से पहले कोई गुणसूत्र असामान्यताएं हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए karyotyped किया जाना चाहिए. इस भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया hPSCs mTeSR1 मीडिया में बनाए रखा गया था और EDTA के साथ clumps के रूप में पारित करने के लिए karyotypic असामान्यताओं को कम से कम. Karyopetically-असामान्य एचपीएससी भेदभाव के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे असामान्य रूप से जल्दी से बढ़ सकता है; इस प्रकार यहाँ अनुशंसित कोशिका-बीज घनत्व कारयोआमत-असामान्य कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
    2. भेदभाव के लिए एचपीएससी को बीज देने के लिए, काफी हद तक-अनुकूल एचपीएससी संस्कृतियों की प्लेट से एस्पायर एम टी एस आर 1 और एचपीएससी को अलग करने के लिए वाणिज्यिक रूप से खरीदे गए वियोजन एजेंट (सामग्री की तालिका) को जोड़ने के लिए, बस पर्याप्त वियोजन एजेंट का उपयोग करके सतह को कवर करने के लिए अच्छी तरह से या पकवान जिस पर कोशिकाओं बढ़ रहे हैं (उदा., एक 12 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह से प्रति वियोजन एजेंट के 0.5 एमएल जोड़ें, एक 6 अच्छी तरह से थाली या प्रति 10 सेमी पकवान 3 एमएल के प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल).
    3. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या कुछ कालोनियों अलग शुरू जब तक वियोजन एजेंट में इनक्यूबेट एचपीएससी। अच्छी तरह से प्लेट के नीचे कई बार नल; कई मिनट के विघटन के बाद, अधिकांश एचपीएससी कालोनियों को स्वतंत्र रूप से निलंबित कर देना चाहिए।
    4. अलग hPSCs को प्लेट से अलग करने के लिए, डिमEM/F12 के 2 एमएल/वेल को 6-वेल प्लेट (या 1 एमएल/वेल के साथ काम करने पर) जोड़ें ताकि वियोजन एजेंट को पतला किया जा सके। अच्छी तरह से की सतह से सभी कोशिकाओं को धोने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे कई बार पिपेट करने के लिए एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें; एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में resuspended एकल कोशिकाओं को इकट्ठा. सभी एचपीएससी की वसूली सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को DMEM/F12 की एक ही मात्रा के साथ दूसरी बार धो लें।
    5. कोशिकाओं युक्त 50 एमएल शंकु ट्यूब में, 1:5-1:10 द्वारा वियोजन एजेंट की मूल मात्रा को पतला करने के लिए DMEM/F12 जोड़ें (उदा., यदि वियोजन एजेंट की मूल मात्रा 1 एमएल थी, तो सेल निलंबन की कुल मात्रा को DMEM/F12 के साथ 10 एमएल तक समायोजित करें 1:10 पर वियोजन एजेंट
    6. गोली कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में एकत्र hPSCs centrifuge।
    7. कोशिकाओं के लिए गोली के लिए प्रतीक्षा करते समय, थाली जिसमें hPSCS बीज हो जाएगा से aspirate मैट्रिक्स. इसके बाद, उन्हें कवर करने के लिए प्राप्तकर्ता कुओं के लिए व्यावसायिक रूप से प्राप्त thiazovivin (एक औषधीय रॉक अवरोध करनेवाला) के 1 $M के साथ पूरक mTesR1 की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें (उदा., एक 12-अच्छी प्लेट या एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 0.5 एमएल एम टी ई एस आर 1 जोड़ें)।
      नोट: एक कम एकाग्रता पर Thiazovivin एकल सेल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए इस कदम पर शामिल है और इसलिए hPSCs के बाद बोने घनत्व.
    8. अपकेंद्रण एचपीएससी के बाद, ध्यान से supernatant aspirate, शंकु ट्यूब के तल पर गोलीदार एचपीएससी छोड़ने. सुपरनेटेंट में वियोजन एजेंट होता है जो एचपीएससी के बाद आसंजन को रोकता है और इस प्रकार, आगे बढ़ने से पहले अधिकांश सुपरनेटेंट को प्रेरित करना महत्वपूर्ण है।
    9. mTeSR1 में सेल गोली को पुन: निलंबित करें जो थियाज़ोविजिन के 1 डिग्री एम के साथ पूरक है। एक p1000 पिपेट के साथ, धीरे triturate 2-3 बार समान रूप से एक सेल निलंबन में सेल गोली resuspend करने के लिए. सेल गोली को अधिक न करें क्योंकि अत्यधिक यांत्रिक बल एचपीएससी को नुकसान पहुंचाएगा और खराब सेल अस्तित्व का कारण बन जाएगा।
    10. एचपीएससी के पुन: निलंबन के बाद, तुरंत एक हेमोसाइटोमीटर में निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस पिपेट और कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। यह जितनी जल्दी हो सके गिनती के लिए pipette कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, गुरुत्वाकर्षण के रूप में hPSCs स्वाभाविक रूप से 50 एमएल ट्यूब के नीचे में बसने के लिए नेतृत्व करेंगे, जो सटीक सेल गिनती उलझन में होगा.
    11. चढ़ाना के लिए वांछित सेल एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए thiazovivin-पूरक mTeSR1 के साथ resuspended hPSCs की मात्रा समायोजित करें। उदाहरण के लिए, पुन: निलंबित hPSCs की मात्रा को समायोजित करने के बाद, एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 160,000-250,000 कोशिकाओं बीज के लिए सेल निलंबन के 0.5 एमएल जोड़ें, इस प्रकार प्रत्येक अच्छी तरह से में 1 एमएल की कुल मात्रा को प्राप्त करने (0.5 एमएल मीडिया के कदम 2.2.7) में अच्छी तरह से जोड़ा गया था. यदि बड़े या छोटे कुओं का उपयोग किया जा रहा है, तो तदनुसार सेल संख्याओं/मीडिया की मात्रा ऊपर या नीचे स्केल करें।
      नोट: संकेत ित सेल घनत्व पर एचपीएससी को बीज देना महत्वपूर्ण है। अति-प्रभावित एचपीएससी कुशलता से अंतर नहीं करेगा और भेदभाव के दौरान कम-से-कम प्रभावित एचपीएससी अच्छी तरह से जीवित नहीं रहेगा।
    12. प्लेट को क्रॉस पैटर्न में हिलाएं (बाएं, फिर दाएं; आगे, फिर पीछे) कई बार यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को प्लेट/वेल में समान रूप से वितरित किया जाता है। प्लेट को एक वृत्ताकार गति में घुमाएं नहीं, क्योंकि कोशिकाएं प्लेट के केंद्र में व्यवस्थित होंगी/ आमतौर पर, एचपीएससी $ 3-30 मिनट के भीतर कुएं की सतह का अनुशमन करना शुरू कर देगा। कोशिकाओं को भेदभाव की शुरुआत करने से पहले कम से कम 24 घंटे तक बढ़ने दें।

3. एंडोडरमल सेल और लिवर संतति में एचपीएससी का भेदभाव

  1. के बाद hPSCs कम से कम 24 घंटे के लिए चढ़ाया गया है (जैसा कि चरण 2.2.12 में वर्णित), भेदभाव के साथ आगे बढ़ने से पहले, एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की जांच, व्यास और प्लेट्ड HPSC कालोनियों के घनत्व पर विशेष जोर के साथ.
    नोट: आदर्श रूप में, clumps आसानी से स्थान और कदम 3.2 से पहले अच्छी तरह से भर में उचित आकार और घनत्व की होनी चाहिए. hPSCs के बड़े (लगभग gt;400 $m) या छोटी कालोनियों (लगभग और lt;200 $m) भेदभाव के लिए प्रयोग करने योग्य नहीं हैं (चित्र 4)। बड़े एचपीएससी कालोनियों में भेदभाव के संकेत समान रूप से कार्य नहीं करेंगे, जिससे अक्षम भेदभाव होगा। कालोनियों कि बहुत छोटे हैं अच्छी तरह से इस भेदभाव प्रोटोकॉल में एचपीएससी भेदभाव के पहले 3 दिनों के दौरान जीवित नहीं है। यदि बीज एचपीएससी का घनत्व सही है, तो एचपीएससी कालोनियों में अक्सर उनके बीच कोशिकाओं के "पुल" का निर्माण होगा और दिन 1 अंतरिता माध्यम जोड़ने से पहले समग्र संगम $30-50% होगा (चित्र 4)।
  2. यदि कॉलोनी आकार चरण 3.1 में आदर्श हैं, तो भेदभाव के 1 दिन के लिए आगे बढ़ें, जिसमें पूर्वकाल आदिम लकीर (एपीएस) में एचपीएससी के भेदभाव पर जोर दिया जाता है।
  3. आधार माध्यम के रूप में CDM 2 (तालिका 1 और अनुभाग 1.2) का उपयोग करतालिका 2 में उल्लिखित सभी अभिकर्मकों को मिलाकर दिन 1 एपीएस विभेदन माध्यम तैयार करें. पाइप्ट मीडिया में घटकों का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए कई बार मिश्रण करने के लिए।
  4. प्लेटेड एचपीएससी से थियाजोविविन पूरक mTeSR1 को हटाने के लिए और संक्षेप में IMDM मीडिया के साथ hPSCs धोने के लिए। आईएमडीएम के बजाय फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) से न धोएं, क्योंकि पीबीएस में कैल्शियम आयनों (सीए2 +) की कमी है और इस प्रकार एचपीएससी के लिए विषाक्त है; यह कोशिका आकारिकी को बाधित करेगा।
  5. संक्षिप्त आईएमडीएम धोने के बाद, एचपीएससी में दिन 1 माध्यम जोड़ें। समय और स्थान कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रिकॉर्ड करें
  6. (सारणी 2) तैयार करके और दिन के उसी समय के आस-पास अंतर के संबंधित दिनों (24 ज अंतरालों पर) पर कक्षों में संबंधित विभेदमाध्यम माध्यम को जोड़कर बाद के भेदभाव के चरणों को जारी रखें (चित्र 1) । ताजा मीडिया दैनिक के साथ बदलें, भले ही भेदभाव के लगातार दिन एक ही भेदभाव मीडिया का उपयोग करें. मीडिया परिवर्तनों के बीच, मृत कोशिकाओं और पिछले मध्यम घटकों के अवशेष को हटाने के लिए IMDM मीडिया के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं।
  7. के रूप में भेदभाव जिगर कली चरण से परे प्रगति, सेल संख्या में वृद्धि और इसलिए, थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए और अधिक मीडिया जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि भेदभाव कारकों और पोषक तत्वों की मात्रा सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, 12-अच्छी तरह से के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 एमएल भेदभाव माध्यम जोड़ें, लेकिन भेदभाव के बाद के दिनों पर बाद के भेदभाव मीडिया के 1.5-2 एमएल जोड़ें (दिन 7 से 18 अंतर) के बाद के दिनों में।

4. इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा एंडोडरमल सेल और लिवर संतति की विशेषता

  1. बफर अवरुद्ध तैयार करें: 10% गधा सीरम + 0.1% Triton X100 deionized फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (DPBS) में।
  2. धुंधला बफर तैयार करें: DPBS में 1% गधा सीरम + 0.1% Triton X100.
  3. 12-अच्छी प्लेट में कोशिकाओं से Aspirate माध्यम.
  4. कक्षों को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (DPBS में) जोड़ें और फिर DPBS के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
  5. ब्लॉक और निश्चित कोशिकाओं permebilize करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए अवरुद्ध बफर जोड़ें।
  6. अवरुद्ध समाधान Aspirate और प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला बफर में पतला जोड़ें. एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के अनुपात के लिए सामग्री की तालिका देखें.)
  7. कोशिकाओं को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर दाग दें।
  8. DPBS में 0.1% Triton X100 के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो एं.
  9. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए धुंधला बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी दाग जोड़ें। (माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लिए सामग्री की तालिका देखें.)
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और परमाणु counterstain का संचालन करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए DAPI जोड़ें।
  11. अतिरिक्त एंटीबॉडी और DAPI को दूर करने के लिए DPBS में 0.1% Triton X100 के साथ दो बार धो लें।
  12. एक ज़ीस प्रेक्षक D1 के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का संचालन करें। वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग किया जाता है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस में प्लेट की दुकान। अपेक्षित परिणामों के लिए, चित्र 3देखें.

5. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल-सॉर्टिंग (FACS) विश्लेषण द्वारा लिवर संतति की विशेषता

नोट: AFP+ विभेदित LB कोशिकाओं के प्रतिशत को ठीक से निर्धारित करने के लिए FACS का उपयोग करें जो भेदभाव के 6 दिन से उभरने के लिए। एएलबी + विभेदित hepatocytes के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक ही चरणों का पालन करें 18 अंतर के दिन.

  1. एक विरोधी एएफपी एंटीबॉडी संयुग्मी.
  2. आर-फाइकोएरिथ्रिन कंजुकेशन किट का उपयोग करके (0.55 ग्राम/जेडएल) की सांद्रता में एंटी-एएफपी एंटीबॉडी में आर-फाइकोरिथ्रिन जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एंटीबॉडी शुद्ध कर रहे हैं और बफ़र्स कि amines शामिल नहीं में पुनर्गठन कर रहे हैं. सुनिश्चित करें कि लेबलिंग प्रतिक्रिया में उपयोग किए गए एंटीबॉडी की मात्रा पीई की मात्रा से कम होनी चाहिए (यानी, पीई के 100 डिग्री ग्राम के साथ एंटीबॉडी का 60 डिग्री ग्राम)। एंटीबॉडी के खराब संयोजन अविश्वसनीय परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  3. एंटीबॉडी के 10 डिग्री सेल्सियस के लिए संशोधक अभिकर्मक का 1 $ल जोड़ें जिन्हें लेबल किया जाना है। धीरे से मिलाएं.
  4. आर-पीई मिश्रण (100 डिग्री सेल्सियस) निकालें और ऊपर मिश्रण को सीधे लाइओफिलाइज्ड आर-पीई सामग्री में पिपेट करें।
  5. टोपी वापस प्लेस और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 3 एच के लिए खड़े शीशी छोड़ दें।
  6. 3 ज या उससे अधिक के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, इस्तेमाल किए जाने वाले एंटीबॉडी के 10 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 $L को क्वेन्चर अभिकर्मक जोड़ें। संयुग्मी का उपयोग 30 मिनट के बाद किया जा सकता है।
  7. संयुग्मी एंटीबॉडी को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. DMEM/F12 के साथ 6-वेल प्रारूप में विभेदित या अलग-अलग एचपीएससी को धोएं।
  9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए वियोजन एजेंट (1 एमएल/वेल में 6-वेल प्लेट) के साथ संक्षिप्त रूप से व्यवहार करें जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं। फसल और दाग दोनों अलग-अलग एचपीएससी और विभेदित यकृत संतति कोशिकाओं को समान रूप से और एक ही प्रयोग में समानांतर में विश्लेषण करने के लिए एंटीबॉडी धुंधला की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए।
  10. कोशिकाओं को अलग करने के लिए पेट्री डिश को धीरे से टैप करें। प्लेट से कोशिकाओं को अलग करने और एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक p1000 पिपेट का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं ज्यादातर अगले कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले अलग कर दिया है. बाद में, अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 1xDPBS बफर के साथ दो बार कुओं धोने।
  11. 50mL शंकु ट्यूब में, 1x DPBS बफर के 5 संस्करणों में वियोजन एजेंट पतला. सभी कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए एक p1000 पिपेट के साथ कड़ाई से 3-4 बार Triturate.
    नोट: यह centrifugation या clumps से पहले एकल कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है बाद में आसानी से अलग नहीं किया जा सकता है. हालांकि, इस सेल अखंडता को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में अधिक-triturate नहीं है। कोशिकाओं की संख्या की गणना और एंटीबॉडी अनुपात है, जो पहले से कम से कम पृष्ठभूमि और अधिकतम संकेत का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है करने के लिए कोशिकाओं की सिफारिश अनुपात का उपयोग करें.
  12. सेंट्रीफ्यूज शंकु नली जिसमें सेल निलंबन 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
  13. देखभाल के साथ supernatant प्रेरित सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए.
  14. सेल पेलेट को स्थिर कर के बाद एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर ठीक करने के लिए सेल पेर्पे को अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें। 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए ध्यान दें। इसके अलावा, इस कदम पर एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब के उपयोग सेल गोली ट्यूब के वी के आकार-कॉर्नर पर जमा करने के लिए सक्षम बनाता है, washes के दौरान सेल हानि को कम करने.
  15. प्रत्येक गोली को 1.8 एमएल perm/wash बफर के साथ दो बार धो लें। एक p1000 पिपेट के साथ 6 बार मिश्रण पिपेट द्वारा perm/wash बफर में सेल गोली को अच्छी तरह से पुन: सेट करें। फिर, अपकेंद्रण, सुपरनेंट को हटा दें और 1.8 एमएल perm/wash बफर के साथ धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ।
  16. perm/wash बफर में सेल गोली को पुन: निलंबित करें ताकि 100 डिग्री सेल्सियस/व्यक्तिगत दाग हो और बाद में सेल निलंबन को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाए।
    नोट: एंटीबॉडी धुंधला करने से पहले इस कदम पर एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। कोशिकाओं का सकल दाग नहीं किया जाएगा और इस तरह FACS विश्लेषण उलझन में होगा. इसके अलावा, इस कदम पर एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब के उपयोग सेल गोली ट्यूब के वी के आकार-कॉर्नर पर जमा करने के लिए सक्षम बनाता है, washes के दौरान सेल हानि को कम करने.
  17. FACS बफर में कोशिकाओं को निलंबित करने के बाद, उन्हें व्यक्तिगत 2 एमएल ट्यूबों में alicot (दोनों unstained नियंत्रण और एंटीबॉडी दाग नमूने के लिए).
  18. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 150,000 कोशिकाओं प्रति 150,000 कोशिकाओं के प्रति एंटी-एएफपी-पीई 0.33 जेडएल के साथ दाग। उदाहरण के लिए, 100 डिग्री सेल्सियस व्यक्तिगत दाग के लिए, दाग निम्नानुसार: 0.33 डिग्री सेल्सियस ए-एएफपी पीई और 100 डिग्री सेल्सियस perm/ p200 पिपेट के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित अच्छी तरह से भी धुंधला सुनिश्चित करने के लिए.
    नोट: केवल पिपेट-मिक्स और भंवर नहीं है क्योंकि यह प्रोटीन स्थिरता को कम कर सकता है।
  19. 1-2 एमएल पर्म/वॉश बफर (1.9 एमएल/व्यक्तिगत दाग) में कोशिकाओं को दो बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर अपकेंद्रित्र। पर्याप्त धोने सुनिश्चित करने के लिए पर्म/वॉश बफर के 1-2 एमएल से कम नहीं के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    नोट: केवल पिपेट मिश्रण और भंवर नहीं है क्योंकि यह प्रोटीन स्थिरता को कम कर सकता है। अपकेंद्रण के बाद, aspirate supernatant ध्यान से कोशिकाओं को disloding से रोकने के लिए और एंटीबॉडी ले-ओवर को कम करने और एक अधिक पूर्ण धोने सुनिश्चित करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा supernatant को दूर करने के लिए।
  20. Perm/wash बफर के 300 डिग्री एल में प्रत्येक धोया गोली resuspend और यह एक FACS ट्यूब में एक 100 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से तनाव के लिए कोशिकाओं के बड़े clumps बाहर FACS विश्लेषण से पहले तनाव.
  21. पीई चैनल पर एक FACS Aria प्रवाह साइटोमेट्री पर कोशिकाओं का विश्लेषण करें। प्रत्येक व्यक्ति के दाग के लिए कम से कम 10,000 घटनाओं का विश्लेषण करें, और FSC-A/SSC-A विश्लेषण के आधार पर घटनाओं को पार्स करें, FSC-W/FSC-H पर गैटिंग द्वारा सेल एकल का चयन करें, इसके बाद एसएससी-एच/एसएससी-डब्ल्यू।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ए पीएस भेदभाव के 24 एच के बाद, कालोनियों आम तौर पर एक अलग रूपी कालोनियों उज्ज्वल सीमा है कि आम तौर पर एचपीएससी कालोनियों का खतना के नुकसान के साथ संगत की तुलना में एक अलग आकृति विज्ञान को अपनाने जाएगा। Morphologically, आदिम लकीर कोशिकाओं आम तौर पर उग्र सीमाओं है और अधिक फैल रहे हैं और hPSCs की तुलना में कम कॉम्पैक्ट-यह एक उपकला से mesenchymal संक्रमण के उत्तेजक के रूप में pluripotent epiblast कोशिकाओं अंतर और आदिम में प्रवेश विवो में लकीर. यदि भेदभाव से पहले एचपीएससी का कॉलोनी आकार बहुत बड़ा था, तो एक अति-उठाया केंद्र होगा जिसमें अलग-अलग कोशिकाएं शामिल हैं। इस तरह के बड़े clumps युक्त संस्कृति को खारिज कर दिया जाना चाहिए, के रूप में इन अलग कॉलोनी केन्द्रों बाद भेदभाव उलझन में होगा. यदि सही आकार और घनत्व के clumps चढ़ाया गया था, ए पीएस भेदभाव अत्यधिक reproduible और वर्दी है, एक 99.3 $0.1% MIXL1-Gfp+ आदिम लकीर जनसंख्या पैदा (MIXL1 एक आदिम लकीर मार्कर है)7. ध्यान दें कि कुछ सेल मौत ए पीएस भेदभाव के 24 एच के बाद मनाया जाता है।

भेदभाव के 2 दिन तक, आदिम लकीर कोशिकाओं दिन 2 निश्चित endoderm कोशिकाओं में विभेदित है, जिनमें से विशाल बहुमत व्यक्त SOX17 (चित्र 2) और FOXA2. 14 HESC और hiPSC लाइनों के साथ स्वतंत्र प्रयोगों के दर्जनों में (H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 और HUF58C4), इस दृष्टिकोण स्केलेबल, लगातार और कुशलता से शुद्ध निश्चित एंडोर्म आबादी उत्पन्न (94.0% 3.1%)7. hPSCs से निश्चित एंडोडडर्म उत्पन्न करने के लिए इस विधि CXCR4+PDGFRA- एंडोडर्म आबादी के उच्च प्रतिशत की पैदावार अन्य endoderm बनाने दृष्टिकोण2,14की तुलना में .

विभेद के 3 दिन तक अंत:द्वार ने अग्रसंत्यजनकों में विभेद ित किया है जो बहुभुजीय आकृति में प्रकट होते हैं (चित्र 1)। बाद में, भेदभाव के 6 दिनों तक, फोरगुट संतति कर्ता एएफपी, टीबीएक्स3 और एचएनएफ4ए (चित्र3) को व्यक्त करते हुए यकृत कली जनकमें अंतर करते हैं। तीन HESC लाइनों के पार (H1, H7, H9 H9 HESCs), इस विधि दिन उत्पन्न करता है 6 एएफपी+ जिगर संतति फार्म 89.0 की दक्षता पर $3.1% (चित्र 2). अंत में, एचपीएससी से यकृत विभेद के 18 दिनों के बाद, ALBUMIN+ hepatocyte की तरह कोशिकाओं दिखाई देते हैं। Morphologically, वे उपकला दिखाई देते हैं, उज्ज्वल सीमाओं पित्त canaliculi की याद ताजा बनाने (चित्र1) . इस अवस्था में, दिन के कोशिकाद्रव्य 18 एचपीएससी व्युत्पन्न हेपाटोसाइट्स नाभिक से अधिक गहरा दिखाई देते हैं (चित्र1)।

Figure 1
चित्रा 1: विभेदन रणनीति और अलग-अलग एचपीएससी की आकृति विज्ञान, विभेदकारी एंडेडर और हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं का स्फुटिक। भेदभाव की प्रक्रिया और समयरेखा दिखाई गई। संक्षिप्त संक्षिप्त: घ दिन, hPSC - मानव pluripotent स्टेम सेल, एपीएस - पूर्वकाल आदिम लकीर, डे - निश्चित endoderm, PFG - पीछे की ओर foregut, LB ] जिगर कली संतति, हिमाचल प्रदेश ] hepatocyte संतति, HEPtocyte संतानों, HEP ] hepatocyte कोशिकाओं की तरह. स्केल बार $ 400 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दिन का प्रतिशत 1 MIXL1 + आदिम लकीर, दिन 2 SOX17 + निश्चित (डेफ) एंडोडर्म, दिन 6 एएफपी + जिगर कली जनक और ALB + hepatocyte आबादी के रूप में FACS द्वारा दिखाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दिन 6 जिगर संतति के इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण। एचपीएससी को पहले जिगर की कली संतनिचर में विभेदित किया गया था, जो यकृत कली प्रतिलेखन कारकों HNF4A (लाल), टीबीएक्स3 (हरा) के साथ-साथ साइटोप्लाज्मिक लिवर कली मार्कर एएफपी (लाल) के लिए प्रतिरक्षा प्रदान किए गए थे। कुल सेल संख्या का आकलन करने के लिए न्यूक्लिय को डीएपीआई (नीले) के साथ मुकाबला किया गया था। स्केल बार $ 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एचपीएससी का सेल सीडिंग घनत्व। कम (बाएं) और उपयुक्त (मध्य और दाएँ) बीज कोशिकाओं का घनत्व. स्केल बार $ 1,000 $m. तीर कोशिकाओं की कालोनियों के बीच "पुल" को इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बेस मध्यम आधार माध्यम की संरचना
सीडीएम2 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% केंद्रित लिपिड, 0.7 डिग्री/
सीडीएम3 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% केंद्रित लिपिड, 10% KOSR
सीडीएम4 1:1 IMDM/F12, 1% केंद्रित लिपिड, 15 g/
सीडीएम5 CMRL, 10% KOSR, 1% ग्लूटामैक्स

तालिका 1: रासायनिक रूप से परिभाषित मीडिया CDM2, CDM3, CDM4, और CDM5 की संरचना।

भेदभाव चरणों अवधि कारकों खुराक बेस मध्यम
दिन 1 आदिम स्ट्रीक 1 दिन एक्टिविन 100 एनजी/
CHIR99201 3 $M सीडीएम2
पीआई 103 50 एनएम
FGF2 10 एनजी/
2 दिन निश्चित एंडोडर्म 1 दिन एक्टिविन 100 एनजी/
डीएम 3189 250 एनएम सीडीएम2
पीआई 103 50 एनएम
तीसरा दिन पोस्टर फोरगुट 1 दिन ए83-01 1 $M
टी.टी.एन.पी.बी. 75 एनएम सीडीएम3
BMP4 30 एनजी/
FGF2 10 एनजी/
दिन 6 जिगर बड संतान 2 दिन एक्टिविन 10 एनजी/
C59 1 $M सीडीएम3
BMP4 30 एनजी/
फोर्सकोलिन 1 $M
1 दिन एक्टिविन 10 एनजी/
CHIR99201 1 $M सीडीएम3
BMP4 30 एनजी/
फोर्सकोलिन 1 $M
दिन 12 हेपेटिक जनक 6 दिन BMP4 10 ग्राम/
Osm 10 एनजी/
डेक्सामेथासोन 10 डिग्री मी.
फोर्सकोलिन 10 डिग्री मी. सीडीएम4
रो4929097 2 $M
AA2P 200 ग्राम/
इंसुलिन 10 ग्राम/
दिन 18 हेपेटोसाइट्स 6 दिन डेक्सामेथासोन 10 डिग्री मी.
फोर्सकोलिन 10 डिग्री मी. CDM4 या
रो4929097 2 $M सीडीएम5
AA2P 200 ग्राम/
इंसुलिन 10 ग्राम/

तालिका 2: भेदभाव मीडिया की संरचना.

समस्या संभावित कारण प्रोफर्ड समाधान
कॉलोनी के केंद्र में कोशिकाओं में अंतर नहीं है i) कालोनी का आकार अत्यधिक बड़ा था, बड़ी कालोनियों के बीच में कोशिकाओं भेदभाव संकेतों के लिए सुलभ नहीं थे i) चेक सेल गिनती technqiue.
ii) क्लंप का असमान वितरण जो कुएं के केंद्र में एक साथ विलय हो गया (या इसकी परिधि), बहुत बड़ी कालोनियों का निर्माण ii) प्लेट को एक क्रॉस फैशन में हिलाएं ताकि चढ़ाना के दौरान क्लंप को समान रूप से वितरित किया जा सके, और इसे इनक्यूबेटर में रखने से पहले माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें।
iii) कोशिकाओं को अपर्याप्त भेदभाव संकेत प्राप्त हुए iii) विभेदक मीडिया की पर्याप्त मात्रा जोड़ें: एक 12-वेल प्लेट में 12-वेल प्लेट में 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से और 6-वेल प्लेट में 3 एमएल प्रति अच्छी तरह से जोड़ें
भेदभाव की खराब दक्षता i) सेल संस्कृति आंशिक रूप से विभेदित शुरू करना i) अलग-अलग एचपीएससी के एक नए, उच्च गुणवत्ता वाले बैच का उपयोग करें
ii) कालोनियों बहुत घने बीज थे, कोशिकाओं की एक confluent चादर बनाने ii) बीज कोशिकाओं और गणना कोशिकाओं भेदभाव के लिए सही है, और उन्हें वितरित करने के लिए समान रूप से हिला
iii) अपर्याप्त धुलाई के कारण अवशिष्ट मीडिया और अवांछित सिग्नल ों को धोया नहीं गया iii) अवशिष्ट mTeSR1 या भेदभाव के पिछले चरण से प्रेरण मीडिया भेदभाव ब्लॉक होगा; विभेदक माध्यम जोड़ने से पहले आईएमडीएम के साथ धोने कोशिकाओं
iv) बहुत कठोर कपड़े धोने; अनुचित धोने की स्थिति गंभीर रूप से सेल आकारिकी को बाधित करेगा iv) या तो भेदभाव माध्यम जोड़ने से पहले, IMDM के साथ संक्षेप में धो लें. DPBS का उपयोग (या विभिन्न osmolarity या ठंड मीडिया के साथ मीडिया) या विस्तारित धोने, सेल आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता समझौता होगा
v) भेदभाव चरणों की लंबी या छोटी अवधि, लंबे समय तक या अनुशंसित से कम। v) भेदभाव के प्रत्येक चरण के लिए अनुशंसित समय का पालन करें।

तालिका 3: संभावित समस्याओं और उनके संभावित कारणों और समाधान.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस विधि जिगर कली संतति की समृद्ध आबादी की पीढ़ी सक्षम बनाता है, और बाद में hepatocyte की तरह कोशिकाओं, hPSCs से. मानव जिगर की कोशिकाओं की समृद्ध आबादी उत्पन्न करने की क्षमता ऐसी कोशिकाओं के व्यावहारिक उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है. पिछले तरीकों hPSCs से hepatocytes उत्पन्न करने के लिए दोनों जिगर और गैर जिगर कोशिकाओं है कि, कृन्तकों में प्रत्यारोपण पर, जिगर के ऊतकोंकेअलावा हड्डी और उपास्थि 15 उपज युक्त अशुद्ध कोशिका आबादी मिले. इसलिए गैर-जिगर भेदभाव का स्पष्ट दमन समृद्ध जिगर आबादी है कि अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयुक्त हो सकता है उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है.

विशेष रूप से, बहुत पहले कदम पर hPSCs के नियंत्रित चढ़ाना कुशल बहाव भेदभाव के लिए आवश्यक है. भेदभाव के लिए एक निश्चित घनत्व पर एचपीएससी को सही ढंग से प्लेट करना, और प्लेटिंग की प्रक्रिया के दौरान इन एचपीएससी को अच्छी तरह से या प्लेट में समान रूप से वितरित करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से बीज के लिए, बीज 160,000 करने के लिए 250,000 hPSCs प्रति अच्छी तरह से; कुल मिलाकर, कोशिका बोने के घनत्व को अनुचित करना और अंततः प्रत्येक कोशिका रेखा के लिए उपयुक्त कोशिका घनत्व का परीक्षण करना अनिवार्य है (चित्र4)। यदि बहुत अधिक एचपीएससी को अच्छी तरह से वरीयता दी जाती है, तो वे बड़ी कॉलोनियों का निर्माण करेंगे, जो भेदभाव क्षमता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करेंगे, क्योंकि बड़ी कालोनियों के बीच में कोशिकाओं को परिधि के पास कोशिकाओं की तुलना में भेदभाव संकेतों के लिए कम सुलभ हैं; विषमांगी आकार की कालोनियों में भी इसी तरह के मुद्दे पेश होंगे। यदि सेल घनत्व बहुत कम हैं (उदाहरण के लिए, 200,000 कोशिकाओं से नीचे / ऊपर वर्णित पासिंग और सीडिंग विधि लगातार डाउनस्ट्रीम विभेदन के लिए उपयुक्त आकार के एचपीएससी क्लंप्स उत्पन्न करती है।

इस विधि की एक सीमा यह है कि उत्पन्न hepatocyte की तरह कोशिकाओं वयस्क hepatocytes के समान नहीं हैं, के रूप में hPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं अभी भी अपरिपक्व जिगर मार्कर एएफपी व्यक्त करते हैं. इसके अलावा, CYP3A4 एंजाइमी गतिविधि प्राथमिक वयस्क मानव hepatocytes की तुलना में इन hPSC व्युत्पन्न hepatocyte की तरह कोशिकाओं में लगभग 55 गुना कम है. एक आने वाली चुनौती इन एचपीएससी व्युत्पन्न हेप्टोसाइट जैसे कोशिकाओं को पूर्ण रूप से विकसित, वयस्क जैसे कोशिकाओं में परिपक्व करने के लिए होगी। दूसरी सीमा यह है कि कुशल विभेदकोशिकाओं के प्रारंभिक घनत्व पर अत्यंत निर्भर है और इसलिए अनुशंसित घनत्व पर बीजप्राप्त करना और उन्हें प्लेट (सारणी 3) में समान रूप से तितर-बितर करना बहुत महत्वपूर्ण है।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल जिगर कली संतान और hepatocyte की तरह कोशिकाओं का उत्पादन 89.0 पर 3.1% शुद्धता कम से कम 3 hPSC लाइनों में. दूसरा, hepatocyte की तरह कोशिकाओं जिगर एंजाइमों व्यक्त, मानव ALBUMIN स्रावित और वर्तमान भेदभाव दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्पन्न कोशिकाओं की तुलना में जिगर जीन के उच्च स्तर व्यक्त की. अंत में, परिणामी hepatocyte की तरह कोशिकाओं न केवल इन विट्रो में कुछ hepatocyte कार्यों का प्रदर्शन, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात वे विवो में कुछ हद तक कार्य कर सकते हैं, के रूप में वे पुरानी जिगर की चोट के एक माउस मॉडल engraft और अल्पकालिक अस्तित्व में सुधार कर सकते हैं2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम चर्चा के लिए बिंग लिम और स्टेम सेल जीव विज्ञान और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए बुनियादी ढांचे के समर्थन के लिए स्टैनफोर्ड संस्थान धन्यवाद. यह काम पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (DISC2-10679) और स्टैनफोर्ड-यूसी बर्कले Siebel स्टेम सेल संस्थान (L.T.A. और K.M.L.) और स्टैनफोर्ड Beckman परमाणु और आनुवंशिक चिकित्सा के लिए केंद्र के रूप में अच्छी तरह से बेनामी, Baxter और DiGenova परिवारों (के.एम.एल.) के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Geltrex Thermofisher Scientific A1569601
1:1 DMEM/F12 Gibco 11320033
0.2 μm pore membrane filter Millipore GTTP02500
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850
Thiazovivin Tocris Bioscience 3845
 Accutase Gibco or Millipore  Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31765035
KOSR, Knockout serum replacement Thermofisher Scientific 10828028
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich   P8136
Transferrin  Sigma-Aldrich   10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermofisher Scientific 11905031
Human Activin R&D 338-AC
CHIR99201 Tocris 4423
PI103 Tocris 2930/1
Human FGF2 R&D 233-FB
DM3189 Tocris 6053/10
A83-01 Tocris 2939/10
Human BMP4 R&D 314-BP
C59 Tocris 5148
TTNPB Tocris 0761/10
Forskolin Tocris 1099/10
Oncostatin M R&D 295-OM
Dexamethasone Tocris 1126
Ro4929097 Selleck Chem S1575
AA2P Cayman chemicals 16457
Human recombinant Insulin Sigma-Aldrich   11061-68-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
  2. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  3. Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
  4. Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
  5. Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
  6. Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  9. Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
  10. Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
  11. Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
  12. Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
  13. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  14. Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
  15. Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).

Tags

विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 148 मानव pluripotent स्टेम सेल कुशल भेदभाव एंडोडर्म जिगर संतति hepatocyte
लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loh, K. M., Palaria, A., Ang, L. T.… More

Loh, K. M., Palaria, A., Ang, L. T. Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells. J. Vis. Exp. (148), e58975, doi:10.3791/58975 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter