Summary
Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.
Abstract
O fígado desintoxica substâncias nocivas, secreta proteínas vitais, e executa as principais atividades metabólicas, sustentando assim a vida. Consequentemente, a insuficiência hepática — que pode ser causada por ingestão crônica de álcool, hepatite, envenenamento agudo ou outros insultos — é uma condição grave que pode culminar em sangramento, icterícia, coma e, eventualmente, morte. Entretanto, as aproximações para tratar a falha de fígado, assim como estudos da função e da doença de fígado, foram stymied na parte pela falta de uma fonte abundante de pilhas humanas do fígado. Para este fim, este protocolo detalha a diferenciação eficiente de pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em Hepatocyte-como pilhas, guiado por um roteiro desenvolvente que descreva como o Fate do fígado está especificado através de seis etapas consecutivas da diferenciação. Manipulando as vias de sinalização do desenvolvimento para promover a diferenciação hepática e para suprimir explicitamente a formação de Fates celulares indesejados, este método gera eficientemente populações de progenitores de gemas hepáticas humanas e células como hepatócitos por dias 6 e 18 de diferenciação do PSC, respectivamente. Isto é conseguido através do controle temporally-preciso de caminhos de sinalização desenvolventes, exercitado por moléculas pequenas e por factores de crescimento em um meio de cultura soro-livre. A diferenciação neste sistema ocorre em monocamadas e produz células hepatócito-like que expressam enzimas de hepatócitos característicos e têm a capacidade de entransplantar um modelo de rato de insuficiência hepática crónica. A capacidade de gerar eficientemente um grande número de células hepáticas humanas in vitro tem ramificações para o tratamento da insuficiência hepática, para a triagem de drogas, e para estudos mecanísticos de doença hepática.
Introduction
A finalidade deste protocolo é diferenciar eficientemente pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em populações enriquecidas de progenitores do botão do fígado e Hepatocyte-como pilhas2. O acesso a um suprimento pronto de progenitores hepáticos humanos e células semelhantes a hepatócitos acelerará os esforços para investigar a função hepática e a doença e poderá permitir novas terapias de transplante celular para insuficiência hepática3,4, a 5. Isso tem provado desafiador no passado desde hPSCs (que incluem células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) pode diferenciar em todos os tipos de células do corpo humano; Conseqüentemente, tem sido difícil diferenciá-los exclusivamente em uma população pura de um único tipo de célula, como as células hepáticas6.
Para diferenciar precisamente hPSCs em pilhas de fígado, primeiramente é crítico compreender não somente como as pilhas de fígado são especificadas mas igualmente como os Cell-Types do não-fígado se desenvolvem. O conhecimento de como as células não-hepáticas se desenvolvem é importante para suprimir logicamente a formação de linhagens não hepáticas durante a diferenciação, orientando, assim, exclusivamente hPSCs para um destino hepático2. Em segundo lugar, é essencial delinear as múltiplas etapas de desenvolvimento através das quais os hPSCs se diferenciam para um destino hepático. Sabe-se que os hPSCs se diferenciam sequencialmente em múltiplos tipos de células conhecidas como a raia primitiva (APS), endoderma definitivo (DE), foregut posterior (PFG) e progenitores de broto hepático (LB) antes de formar células de hepatócitos (HEP). O trabalho mais adiantado revelou os sinais que especificam o Fate do fígado e os sinais que suprimiram a formação de pilha-tipos alternativos do não-fígado (que incluem os progenitors do estômago, os pancreatic, e os intestinais) em cada escolha2do desenvolvimento da linhagem, 7 anos de , a 8.
Coletivamente, esses insights deram origem a um método de monocamada sem soro para diferenciar hPSCs em direção à raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior, progenitores de broto hepático e, finalmente, células tipo hepatócitos2. Globalmente, o método envolve a semeadura de hPSCs em uma monocamada em uma densidade adequada, preparando seis coquetéis de meios de diferenciação (contendo fatores de crescimento e pequenas moléculas que regulam várias vias de sinalização de desenvolvimento), e sequencialmente adicionando esses meios para induzir a diferenciação ao longo de 18 dias. Durante o processo, nenhum de de células é necessário. De notar, porque este método inclui explicitamente sinais que suprimem a formação de células não-fígado-tipos, esta abordagem de diferenciação1 mais eficientemente gera progenitores do fígado e hepatócitos-como células em comparação com existentes métodos de diferenciação2,9,10,11,12. Além disso, o protocolo descrito neste texto possibilita a geração mais rápida de hepatócitos que, em última análise, expressam níveis mais elevados de fatores de transcrição hepática e enzimas do que os produzidos por outros protocolos9,10 , 11 anos de , doze anos.
O protocolo aqui descrito tem algumas vantagens sobre os protocolos de diferenciação atuais. Em primeiro lugar, implica diferenciação monocamada de hPSCs, que é tecnicamente mais simples em comparação com métodos de diferenciação tridimensional, como aqueles que dependem de corpos embrióides13. Em segundo, este método explora um avanço recente por meio de que as pilhas definitivas do endoderme (um precursor adiantado às pilhas de fígado) podem eficientemente e ràpida ser geradas dentro de 2 dias da diferenciação2,7de HPSC, assim permitindo a subsequente produção de hepatócitos com maior pureza. Em terceiro lugar, nas comparações lado a lado, as células do tipo hepatócito produzidas por este método2 produzem mais albumina e expressam níveis mais elevados de fatores de transcrição hepática e enzimas em comparação com os hepatócitos produzidos em outros métodos10, 11,12.
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Protocol
1. preparação de meios de diferenciação
Nota: Refira a tabela de materiais para a informação do fabricante a respeito dos materiais e dos reagentes usados.
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Preparação de suportes de base quimicamente definidos (MDL)
Nota: CDM2, CDM3, CDM4 e CDM5 são meios quimicamente definidos que são usados como mídias de base para diferenciar hPSCs para células hepáticas em vários estágios. A composição dessas mídias pode ser encontrada na tabela 1.- Para fazer CDM2 ou CDM3, prepare uma solução de ações contendo álcool polivinil (PVA). Dissolver 0,5 g de pó de PVA em 50 mL de Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium (IMDM) para gerar um estoque de 10 mg/mL de PVA.
Nota: Como a PVA não se dissolve facilmente, prepare a mistura PVA/IMDM em um balão cônico com agitação contínua a ~ 50 ° c em uma almofada de aquecimento; a agitação pode facilmente ser conseguida usando um agitador magnético. - Depois que o PVA é dissolvido homogeneamente no IMDM, remova a solução de PVA da almofada de aquecimento e deixe-a refrigerar para baixo à temperatura ambiente.
- Use um filtro estéril de 0,2 μm para filtrar a solução de PVA.
- Prepare o CDM2 e o CDM3 combinando o PVA filtrado da etapa 1.1.1 e vários componentes comprados comercialmente, conforme descrito na tabela 1 e na tabela de materiais. Use unidades de filtro estéreis de 0,2 μm para filtrar todas as mídias.
Nota: O meio de base pode ser armazenado a 4 ° c, mas não mais de 2 meses. - Prepare a mídia base restante CDM4 e CDM5 seguindo a tabela 1.
- Para fazer CDM2 ou CDM3, prepare uma solução de ações contendo álcool polivinil (PVA). Dissolver 0,5 g de pó de PVA em 50 mL de Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium (IMDM) para gerar um estoque de 10 mg/mL de PVA.
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Preparação de meios de diferenciação
- Para preparar soluções de ações para as pequenas moléculas e fatores de crescimento, reconstitua-as de acordo com as recomendações dos fabricantes. Para o armazenamento, alíquota em tubos estéreis para reduzir os ciclos de congelamento-degelo e manter a-20 ° c ou como recomendado.
Nota: A composição do meio de diferenciação a ser utilizado em vários estágios de diferenciação é descrita na tabela 2 e nas etapas a seguir. - Para preparar o meio de diferenciação, primeiro descongelar as pequenas moléculas congeladas e/ou fatores de crescimento à temperatura ambiente. Em seguida, alíquota para fora a quantidade exigida de meio de base. Por último, prepare a mídia de diferenciação final adicionando as pequenas moléculas e fatores de crescimento especificados ao meio de base nas concentrações apropriadas (tabela 2).
Nota: O meio de diferenciação recém-preparado deve ser usado idealmente no mesmo dia; caso contrário, ele pode ser armazenado a 4 ° c e usado dentro de três dias. - Usando uma ponta de pipeta, misture o meio de diferenciação várias vezes para garantir que os suplementos sejam distribuídos homogeneamente antes de adicionar o meio às células (por exemplo, adicione 1 mL de meio de diferenciação a cada poço de uma placa de 12 poços.)
- Para preparar soluções de ações para as pequenas moléculas e fatores de crescimento, reconstitua-as de acordo com as recomendações dos fabricantes. Para o armazenamento, alíquota em tubos estéreis para reduzir os ciclos de congelamento-degelo e manter a-20 ° c ou como recomendado.
2. semente hPSCs para placas em densidades definidas para diferenciação
- Plásticos da cultura da pilha do revestimento que serão usados semeando com hPSCs.
- Descongelar a matriz (por exemplo, Geltrex) a 4 ° c durante a noite antes do dia de uso.
- No dia seguinte, diluir a matriz 1:100 adicionando 500 μL da matriz em 50 mL do meio de águia modificada de Dulbecco frio (DMEM)/F12. Desde que a matriz é um hidrogel que polimeriza irreversivelmente em cima da exposição à temperatura ambiente, ao trabalhar com a matriz, mantenha sempre os tubos da matriz e os meios no gelo.
- Nota: A matriz dissolvida 1:100 em DMEM/F12 pode ser armazenada a 4 ° c, mas deve ser usada dentro de 2 meses.
- Para revestir uma placa de cultura com a matriz, pipetar a matriz diluída para o número necessário de poços usando apenas o volume suficiente de solução matricial para cobrir a superfície do poço (por exemplo, adicione 0,5 mL de matriz a um poço de uma placa de 12 poços ou 1 mL a um poço de um 6- placa de poço). Se necessário, agitar a placa suavemente para se certificar de que a solução de matriz cobriu totalmente a parte inferior do poço.
- Deixe a placa revestida em matriz numa incubadora de 37 ° c durante pelo menos 60 min. A esta temperatura, a matriz polimeriza para formar uma película fina na parte inferior do poço.
- Nota: As placas Matrix-coated podem ser mantidas na incubadora de 37 ° c e ser usadas no prazo de 3 dias contanto que a matriz não secou acima.
- Aspirar a solução restante da matriz dos poços revestidos imediatamente antes de semear os poços com hPSCs.
- Passaging e semeando as placas revestidas com hPSCsNOTE: o agente da dissociação contem as enzimas que dissociam pilhas e é importante deixar hPSCs no agente da dissociação para tão brevemente de um TimeSpan como possível.
- Para semear placas de cultura matriciais com hPSCs antes da diferenciação, cresça hPSCs indiferenciados para > 70% de confluência no meio mTeSR1 disponível comercialmente (tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante. É fundamental para a passagem hPSCs antes que eles se tornem totalmente confluentes, como hPSCs pode espontaneamente diferenciar em alta confluência.
Nota: hpscs deve ser karyotyped para assegurar-se de que não haja nenhuma anomalia cromossomática antes de usá-las para experiências. Os hpscs usados para este protocolo da diferenciação foram mantidos em meios de mTeSR1 e é como grupos com o EDTA para minimizar anomalias karyotypic. Os hpscs anormais do cariotìpica não devem ser usados para a diferenciação, porque podem proliferar anormalmente rapidamente; assim as densidades Cell-semeando recomendadas aqui não são apropriadas para karyotipicamente-pilhas anormais. - Para semente hPSCs para a diferenciação, aspirar mTeSR1 da placa em grande parte-confluente das culturas de hPSC e adicionar comercialmente comprou o agente da dissociação (tabela dos materiais) para dissociar o hpscs, usando apenas bastante agente da dissociação para cobrir a superfície do bem ou prato em que as células estão crescendo (por exemplo, adicione 0,5 mL do agente de dissociação por poço de uma placa de 12 poços, 1 mL por poço de uma placa de 6 poços ou 3 mL por prato de 10 cm).
- Incubar hPSCs no agente de dissociação a 37 ° c por 5 min ou até que algumas colônias comecem a se destacar. Bata delicadamente a parte inferior do poço/placa diversas vezes; Após vários minutos de dissociação, a maioria das colônias de hPSC deve entrar livremente em suspensão.
- Para desalojar hPSCs dissociados da chapa, adicione 2 mL/poço de DMEM/F12 se trabalhar com uma placa de 6 poços (ou 1 mL/poço se estiver a trabalhar com uma placa de 12 poços) para diluir o agente de dissociação. Use uma pipeta sorológicos de 5 ml para pipeta delicadamente para cima e para baixo várias vezes para lavar fora todas as pilhas da superfície do poço; recolher as células únicas reressuscipended num tubo cónico de 50 mL. Lave a placa uma segunda vez com o mesmo volume de DMEM/F12 para garantir a recuperação de todos os hPSCs.
- Para o tubo cônico 50 mL contendo as células, adicionar DMEM/F12 para diluir o volume original do agente de dissociação por 1:5-1:10 (por exemplo, se o volume original do agente de dissociação foi de 1 mL, ajustar o volume total de suspensão celular para 10 mL com DMEM/F12 para diluir o agente de dissociação em 1:10)
- Centrifugue os hPSCs recolhidos num tubo cônico de 50 mL a 350 x g durante 3 min a 4 ° c a células da pelota.
- Enquanto aguarda as células para pellet, aspirar matriz da placa em que o hPSCS será semeada. Em seguida, adicione quantidades suficientes de mTesR1 suplementados com 1 μM de tiazovivina comercialmente obtida (um inibidor farmacológico da rocha) aos poços destinatários para cobri-los (por exemplo, adicione 0,5 mL mTeSR1 por poço de uma placa de 12 poços ou 1 mL de mTeSR1 por poço de uma placa de 6 poços).
Nota: Thiazovivin em uma baixa concentração é incluído nesta etapa para realçar a única sobrevivência da pilha e daqui a densidade de propagação subseqüente de hPSCs. - Após a centrifugação hPSCs, aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando o hPSCs peletizada na parte inferior do tubo cônico. O sobrenadante contem o agente da dissociação que inibirá a adesão subseqüente de hPSCs e assim, é importante aspirar a grande maioria do sobrenadante antes de prosseguir.
- Ressuscitem a pelota da pilha em mTeSR1 suplementado com o 1 μM do thiazovivin. Com uma pipeta P1000, triturar suavemente 2-3 vezes para resuspender uniformemente a pelota da pilha em uma única suspensão da pilha. Não triturar excessivamente a pelota da pilha como a força mecânica excessiva danificará hPSCs e conduzirá à sobrevivência pobre da pilha.
- Após a ressuscirepensão dos hpscs, pipete imediatamente 10 μL da suspensão em um hemocitômetro e conte o número de pilhas. É importante para pipetas células para a contagem tão rapidamente quanto possível, como a gravidade levará a hPSCs naturalmente estabelecendo-se na parte inferior do tubo de 50 mL, que irá confundir a contagem de células precisas.
- Ajuste o volume dos hPSCs reressuscipados com mTeSR1 suplementados com tiazovivina para atingir a concentração de células desejada para o revestimento. Por exemplo, depois de ajustar o volume de hPSCs ressuspendido, adicione 0,5 mL da suspensão celular por poço às células de 160.000-250000 de semente em cada poço de uma placa de 12 poços, conseguindo assim um volume total de 1 mL em cada poço (0,5 mL de mídia foi adicionado ao poço na etapa 2.2.7). Se poços maiores ou menores estiverem sendo usados, dimensione números de células/volumes de mídia para cima ou para baixo de acordo.
Nota: É importante para semente hPSCs na densidade de célula indicada. Os hPSCs excessivamente confluentes não diferenciarão os hPSCs eficientes e subconfluentes não sobreviverão bem durante a diferenciação. - Agite a placa em um teste padrão transversal (esquerdo, então direito; para a frente, então para trás) diversas vezes para certificar-se que as pilhas estão distribuídas uniformente através da placa/poço. Não gire a placa em um movimento circular, pois as células se instalarão no centro da placa/poço. Tipicamente, hPSCs começará aderir à superfície do poço dentro de ~ 3-30 min. permita que as pilhas cresçam pelo menos 24 h antes de iniciar a diferenciação.
- Para semear placas de cultura matriciais com hPSCs antes da diferenciação, cresça hPSCs indiferenciados para > 70% de confluência no meio mTeSR1 disponível comercialmente (tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante. É fundamental para a passagem hPSCs antes que eles se tornem totalmente confluentes, como hPSCs pode espontaneamente diferenciar em alta confluência.
3. diferenciação de hPSCs em células Endodérmicas e progenitores hepáticos
- Depois que os hPSCs foram chapeados por pelo menos 24 horas (como descrito na etapa 2.2.12), antes de prosseguir com diferenciação, verific a morfologia das pilhas um microscópio da fase-contraste, com ênfase específica no diâmetro e na densidade de colônias chapeadas de hPSC.
Nota: Idealmente, os grupos devem ser prontamente espaçados e do tamanho e da densidade apropriados durante todo o poço antes da etapa 3,2. Grandes (aproximadamente > 400 μm) ou pequenas colônias (aproximadamente < 200 μm) de hPSCs não são utilizáveis para diferenciação (Figura 4). Os sinais de diferenciação não atuarão uniformemente em grandes colônias de hPSC, levando a uma diferenciação ineficiente. As colônias que são demasiado pequenas não sobrevivem bem durante os primeiros 3 dias da diferenciação de hPSC neste protocolo da diferenciação. Se a densidade de hPSCs semeado estiver correta, as colônias hPSC geralmente formam "pontes" de células entre elas e a confluência geral será ~ 30-50% antes de adicionar meio de diferenciação do dia 1 (Figura 4). - Se os tamanhos da colônia são ideais na etapa 3,1, prossiga ao dia 1 da diferenciação, que implica a diferenciação de hPSCs na raia primitiva anterior (APS).
- Prepare o meio de diferenciação do dia 1 APS misturando todos os reagentes descritos na tabela 2 usando CDM 2 (tabela 1 e seção 1,2) como o meio base. Pipet para misturar várias vezes para garantir a distribuição uniforme dos componentes na mídia.
- Aspirar para remover o thiazovivin suplementado mTeSR1 do hPSCs chapeado e lavar momentaneamente hPSCs com meios de IMDM. Não lave com tampão fosfato salina (PBS) em vez de IMDM, como PBS carece de íons de cálcio (CA2 +) e é, portanto, tóxico para hpscs; Ele vai perturbar a morfologia das células.
- Após a breve lavagem de IMDM, adicione o meio do dia 1 ao hPSCs. Registre a hora e coloque as células de volta na incubadora de 37 ° c
- Continuar com as etapas de diferenciação subsequentes, preparando-se (tabela 2) e adicionando o respectivo meio de diferenciação às células nos respectivos dias (a intervalos de 24 h) de diferenciação em torno da mesma hora do dia (Figura 1). Substitua com mídia fresca diariamente, mesmo que dias consecutivos de diferenciação usem a mesma mídia de diferenciação. Entre as mudanças de mídia, lave as células uma vez com mídia IMDM para remover células mortas e remanescente de componentes médios anteriores.
- Enquanto a diferenciação progride além do estágio do botão do fígado, os números de pilha aumentam e daqui, adicionam mais meios a cada poço da placa para assegurar-se de que a quantidade de fatores e de nutrientes da diferenciação não seja limitando. Por exemplo, adicione 1 mL de meio de diferenciação a cada poço de 12-bem inicialmente nos dias 1 a 6 de diferenciação, mas adicione 1,5-2 mL de meios de diferenciação subsequentes nos dias posteriores de diferenciação (dias 7 a 18 de diferenciação).
4. caracterização de células Endodérmicas e progenitores hepáticos por imunocoloração
- Prepare o tampão de bloqueio: 10% de soro de burro + 0,1% Triton X100 em soro fisiológico tamponado de fosfato deionizado (DPBS).
- Prepare o tampão de coloração: 1% de soro de burro + 0,1% Triton X100 no DPBS.
- Aspirar meio de células em placa de 12 poços.
- Adicionar 4% paraformaldeído (em DPBS) para 15 min à temperatura ambiente para fixar as células e, em seguida, lave as células duas vezes com DPBS.
- Adicionar buffer de bloqueio para 1 h à temperatura ambiente para bloquear e permeabilizar as células fixas.
- Aspirar a solução de bloqueio e adicionar anticorpo primário diluído em tampão de coloração. (Ver tabela de materiais para rácios de diluição de anticorpos.)
- Manchar as células durante a noite a 4 ° c.
- Células de lavagem três vezes com 0,1% Triton X100 em DPBS.
- Adicione a mancha secundária do anticorpo no amortecedor de coloração para 1 h na temperatura ambiente. (Ver tabela de materiais para diluições de anticorpos secundários.)
- Remova o anticorpo secundário e adicione DAPI por 5 minutos à temperatura ambiente para conduzir a contratura nuclear.
- Lave duas vezes com 0,1% Triton X100 no DPBS para remover o excesso de anticorpos e DAPI.
- Conduza a microscopia de fluorescência com um Zeiss Observer D1. Alternativamente, armazene a placa em 4 ° c até que a imagem latente esteja executada. Para obter os resultados esperados, consulte a Figura 3.
5. caracterização de progenitores hepáticos por fluorescência ativada célula-classificação (FACS) análise
Nota: Use FACS para quantificar precisamente a percentagem de células LB diferenciadas AFP + que emergem no dia 6 de diferenciação. Siga os mesmos passos para quantificar a percentagem de hepatócitos diferenciados ALB + por dia 18 de diferenciação.
- Conjugar um anticorpo anti-AFP.
- Adicione R-phycoerythrin ao anticorpo anti-AFP em uma concentração de (0,55 μg/μL) usando o kit de conjugação de R-phycoerythrin (ver tabela de materiais).
Nota: Assegure-se de que os anticorpos sejam purificados e reconstituídos em tampões que não contenham aminas. Assegure-se de que a quantidade de anticorpo usada em uma reação de rotulagem deva ser menos do que a quantidade de PE (isto é, 60 μg do anticorpo com 100 μg do PE). A má conjugação de anticorpos pode levar a resultados não confiáveis. - Adicione 1 μL de reagente modificador para 10 μL de anticorpo a ser rotulado. Misture suavemente.
- Retire a mistura de R-PE (100 μL) e pipetar a mistura acima diretamente no material liofilizado do R-PE.
- Coloque a tampa de volta e deixe o frasco de pé para 3 h no escuro à temperatura ambiente.
- Após incubação por 3 h ou mais, adicionar 1 μL de reagente de quencher para 10 μL de anticorpo utilizado. O conjugado pode ser usado após 30 min.
- Armazenar anticorpos conjugados a 4 ° c.
- Lave hPSCs diferenciados ou não diferenciados no formato 6-well com DMEM/F12.
- Trate brevemente com o agente da dissociação (1 mL/poço em uma placa de 6 poços) por 5 minutos na temperatura ambiente até que as pilhas desanexem. Colher e manchar tanto hPSC indiferenciado e células progenitoras do fígado diferenciadas de forma idêntica e analisar paralelamente no mesmo experimento para garantir a especificidade da coloração de anticorpos.
- Bata suavemente o prato de Petri para separar as células. Use uma pipeta P1000 para separar as células da placa e coletar células em um tubo cônico 50 mL. Assegure-se de que as pilhas tenham destacado na maior parte antes de prosseguir com a etapa seguinte. Subseqüentemente, lave poços duas vezes mais com o amortecedor 1xDPBS para coletar pilhas residuais.
- No tubo cônico 50mL, diluir o agente de dissociação em ~ 5 volumes de 1x DPBS buffer. Triturar rigorosamente 3-4 vezes com uma pipeta P1000 para garantir que todas as células são dissociadas em células individuais.
Nota: É imperativo para gerar células individuais antes de centrifugação ou aglomerados subsequentemente não pode ser dissociado com facilidade. No entanto, não triturar mais como isso pode danificar a integridade celular. Conte o número de células e use a proporção recomendada de células para a relação de anticorpos, que foi previamente otimizado para o fundo mínimo e detecção de sinal máximo. - Centrifugue o tubo cônico que contem a suspensão da pilha em 300 x g por 5 minutos em 4 ° c.
- Aspirar o sobrenadante com cuidado para não perturbar o pellet celular.
- Reressuscite a pelota da pilha completamente no amortecedor da fixação/Perm para gerar uma suspensão da único-pilha e fixar no gelo em 4 ° c por 20 minutos. nota para transferir para um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Além disso, o uso de um tubo do microcentrifugador de 2 mL nesta etapa permite que a pelota da pilha deposite no canto em forma de V do tubo, minimizando a perda da pilha durante Washes.
- Lave cada pellet com 1,8 mL de Perm/tampão de lavagem duas vezes. Resuspend a pelota da pilha completamente no amortecedor do perm/lavagem pela pipeta que mistura 6 vezes com uma pipeta P1000. Em seguida, centrifugue, retire o sobrenadante e repita o processo de lavagem com 1,8 mL de Perm/tampão de lavagem.
- Reressuscitem a pelota da pilha no amortecedor do perm/lavagem de modo que haja 100 μL/mancha individual e transfira subseqüentemente a suspensão da pilha em um tubo do microcentrifugador de 2 mL.
Nota: É imperativo gerar uma suspensão da único-pilha nesta etapa antes da mancha do anticorpo. Os agregados das pilhas não serão manchados e assim conterão a análise de FACS. Além disso, o uso de um tubo do microcentrifugador de 2 mL nesta etapa permite que a pelota da pilha deposite no canto em forma de V do tubo, minimizando a perda da pilha durante Washes. - Após suspender as células no tampão FACS, alíquota-as em tubos individuais de 2 ml (para o controlo não manchado e amostras manchadas de anticorpos).
- Mancha com anti-AFP-PE 0,33 μL por 150.000 células por 30 min à temperatura ambiente no escuro. Por exemplo, para uma mancha de 100 μL individual, mancha da seguinte forma: 0,33 μL de a-AFP PE e 100 μL de Perm/tampão de lavagem. Ressuspender as células com pipeta P200 bem para garantir mesmo a coloração.
Nota: Apenas pipeta-Misture e não vórtice, pois isso pode reduzir a estabilidade da proteína. - Lavar, suspender as células duas vezes em 1-2 mL de Perm/tampão de lavagem (1,9 mL/mancha individual) e centrifugar a 800 x g por 5 min a 4 ° c. Lave as células com não menos de 1-2 mL de Perm/tampão de lavagem para garantir uma lavagem suficiente.
Nota: Apenas misture a pipeta e não vórtice, pois isso pode reduzir a estabilidade da proteína. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante com cuidado para evitar que as células Desalojem e removam o máximo de sobrenadante possível para minimizar o transporte de anticorpos e garantir uma lavagem mais completa. - Resuspend cada pelota lavada em 300 μL do amortecedor do perm/Wash e Coe-o através de um filtro do μm 100 em um tubo de FACS para forçar para fora grandes aglomerados das pilhas antes da análise de FACS.
- Analise as células em uma citometria de fluxo de FACS Aria no canal PE. Analise um mínimo de 10.000 eventos para cada mancha individual e analise eventos em virtude da análise FSC-a/SSC-a, selecione camisolas de células por gating em FSC-w/FSC-h seguido de SSC-h/SSC-w.
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Representative Results
Após 24 h de diferenciação de APS, as colônias geralmente adotam uma morfologia diferente do que as colônias não diferenciadas concomitantes com uma perda da borda brilhante que circunscreve tipicamente colônias de hPSC. Morfologicamente, células de raia primitiva geralmente têm bordas irregulares e são mais disseminadas e menos compactas do que hPSCs-isso é evocativo de uma transição epitelial-mesenquimais como células de epiblastos pluripotentes diferenciam e entram no primitivo raia in vivo. Se o tamanho da colônia de hPSCs antes da diferenciação era muito grande, haverá um centro overtly-levantado que compreende as pilhas indiferenciadas. As culturas que contêm tais aglomerados grandes devem ser rejeitadas, porque estes centros indiferenciados da colônia conterão a diferenciação subseqüente. Se os aglomerados do tamanho e da densidade corretos foram chapeados, a diferenciação de APS é altamente reprodutível e uniforme, gerando um 99.3 ± 0.1% MIXL1-GFP+ população primitiva da raia (MIXL1 é um marcador primitivo da raia)7. Note-se que alguma morte celular é observada após 24 h de diferenciação da APS.
Pelo dia 2 da diferenciação, as pilhas primitivas da raia diferenciaram-se em pilhas definitivas do endoderme do dia 2, a maioria vasta de que expressam SOX17 (Figura 2) e FOXA2. Em dezenas de experimentos independentes com 14 linhas de hESC e hiPSC (incluindo H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 e HUF58C4), essa abordagem de forma escalonável, consistente e eficiente gerou populações de endoderma definitivas puras (94,0% ± 3,1%)7. Este método para gerar endoderma definitivo de hpscs rende umas porcentagens mais elevadas de populações CXCR4+PDGFRA- endodermal comparadas a outras aproximações doendoderm-formando2,14.
No 3º dia de diferenciação, o endoderma se diferenciou em progenitores foregut que aparecem em forma poligonal (Figura 1). Mais tarde, por 6 dias de diferenciação, os progenitores do foregut diferenciam-se em progenitores do botão do fígado que expressam AFP, TBX3, e HNF4A (Figura 3). Através de três linhas de hESC (H1, H7, H9 hESCs), este método gera o dia 6 AFP+ progenitores hepáticos forma a uma eficiência de 89.0 ± 3,1% (Figura 2). Finalmente, após 18 dias da diferenciação do fígado de hPSCs, albumina+ Hepatocyte-como as pilhas aparecem. Morfologicamente, aparecem epiteliais, formando bordas brilhantes que lembram os canalículos biliares (Figura 1). Nesta fase, o citoplasma do dia 18 hepatócitos derivados de hPSC aparece mais escuro que o núcleo (Figura 1).
Figura 1: esquema de estratégia de diferenciação e morfologia de hPSCs indiferenciados, diferenciando endoderma e células como hepatócitos. Processo de diferenciação e cronograma foram mostrados. Abreviaturas: d = dia, hPSC = células-tronco pluripotentes humanas, APS = raia primitiva anterior, DE = endoderma definitivo, PFG = foregut posterior, LB = progenitores de broto hepático, HP = progenitores de hepatócitos, HEP = hepatócitos como células. Barra de escala = 400 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: percentual do dia 1 MIXL1 + raia primitiva, dia 2 SOX17 + endoderma definitivo (def), dia 6 progenitores de broto de fígado AFP + e populações de hepatócitos Alb + como demonstrado pelo FACS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de imunocoloração do dia 6 progenitores hepáticos. hPSC foram diferenciados primeiramente em progenitors do botão do fígado, que foram immunomanchado para fatores da transcrição do botão do fígado HNF4A (vermelho), TBX3 (verde) assim como o marcador cytoplasmic do botão do fígado AFP (vermelho). Os núcleos foram contracorados com DAPI (azul) para avaliar o número total de células. Barra de escala = 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: densidade de propagação de células de hPSCs. Densidade baixa (esquerda) e apropriada (média e direita) das células semeadas. Barra de escala = 1.000 μm. Seta aponta para "pontes" entre colônias de células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meio de base | Composição do meio de base |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% lipídios concentrados, 0,7 μg/mL insulina recombinante humana, 15 μg/mL de transferrina, 18 nM 1-tioglicerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% lipídios concentrados, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% lipídios concentrados, 15 μg/mL de transferrina |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tabela 1: composição dos meios quimicamente definidos CDM2, CDM3, CDM4, e CDM5.
| Estágios de diferenciação | Duração | Fatores | Doses | Meio de base |
| Dia 1 raia primitiva | 1 dia de trabalho | Activina | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 μM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nanômetro | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dia 2 endoderma definitivo | 1 dia de trabalho | Activina | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nanômetro | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nanômetro | |||
| Dia 3 foregut posterior | 1 dia de trabalho | A83-01 | 1 μM | |
| O TTNPB | 75 nanômetro | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Dia 6 progenitores do Bud do fígado | de 2 dias | Activina | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| 1 dia de trabalho | Activina | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 μM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskolin | 1 μM | |||
| Dia 12 progenitores hepáticos | de 6 dias | BMP4 | 10 μg/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Dexametasona | 10 μM | |||
| Forskolin | 10 μM | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 μM | |||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulina | 10 μg/mL | |||
| dia 18 hepatócitos | de 6 dias | Dexametasona | 10 μM | |
| Forskolin | 10 μM | CDM4 ou | ||
| Ro4929097 | 2 μM | CDM5 | ||
| AA2P | 200 μg/mL | |||
| Insulina | 10 μg/mL |
Tabela 2: composição dos meios de diferenciação.
| Problema | Razão possível | Solução proffered |
| Células no centro da colônia não diferenciam | i) o tamanho da colônia era excessivamente grande, as células no meio de grandes colônias não eram acessíveis a sinais de diferenciação | i) verificar a contagem de células technqiue. |
| II) distribuição desigual de aglomerados que se fundem no centro do poço (ou sua periferia), formando colônias muito grandes | II) agitar a placa de forma transversal para distribuir os aglomerados uniformemente durante o revestimento, e verificar um microscópio antes de colocá-lo na incubadora | |
| III) as células receberam sinais de diferenciação insuficientes | III) adicionar volumes adequados de meios de diferenciação: adicionar 1 mL de meio por poço em uma placa de 12 poços e 3 mL por poço em uma placa de 6 poços | |
| Má eficiência de diferenciação | i) iniciar a cultura celular parcialmente diferenciada | i) usar um novo lote de alta qualidade de hPSCs não diferenciado |
| II) colônias foram muito densamente semeadas, formando uma folha confluente de células | II) células de semente e células de contagem com precisão para diferenciação, e agitar uniformemente para distribuí-los | |
| III) os meios residuais e os sinais indesejados não foram lavados devido à lavagem inadequada | III) a mTeSR1 residual ou os meios de indução da fase anterior de diferenciação bloquearão a diferenciação; células de lavagem com IMDM antes de adicionar meio de diferenciação | |
| IV) lavagem muito dura; condições de lavagem inapropriadas interromperão severamente a morfologia celular | IV) antes de adicionar um meio de diferenciação, lave brevemente com imdm. O uso de DPBS (ou meios com osmolaridade diferente ou meios frios) ou a lavagem prolongada, comprometerá a morfologia e a viabilidade da pilha | |
| v) período prolongado ou encurtado de estágios de diferenciação, maior ou menor do que o recomendado. | v) respeitar os horários recomendados para cada estágio de diferenciação. |
Tabela 3: potenciais problemas e suas possíveis causas e soluções.
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Discussion
Este método permite a geração de populações enriquecidas de progenitores do botão do fígado, e subseqüentemente Hepatocyte-como pilhas, de hPSCs. A capacidade de gerar populações enriquecidas de células hepáticas humanas é importante para a utilização prática de tais células. Métodos prévios para gerar hepatócitos de hPSCs produziram populações de células impuras contendo células hepáticas e não hepáticas que, após transplante em roedores, produziram osso e cartilagem além do tecido hepático15. Daqui a supressão explícita da diferenciação do não-fígado é crítica para gerar as populações enriquecidas do fígado que puderam ser apropriadas para uma variedade de aplicações.
Notavelmente, o chapeamento controlado de hPSCs na primeira etapa é essencial para a diferenciação a jusante eficiente. É importante para placa com precisão hPSCs em uma determinada densidade para diferenciação, e distribuir uniformemente esses hPSCs através do poço ou placa durante o processo de chapeamento. Por exemplo, para cada poço de uma placa de 12 poços, semente 160.000 a 250.000 hPSCs por poço; em geral, é imperativo para titular a densidade de semeadura da célula e, em última análise, testar a densidade celular que é apropriada para cada linha celular (Figura 4). Se muitos hPSCs forem semeados por poço, eles formarão grandes colônias, o que afetará negativamente as eficiências de diferenciação, pois as células no meio das grandes colônias são menos acessíveis aos sinais de diferenciação comparados às células próximas à periferia; colônias de tamanhos heterogêneos também apresentarão problemas semelhantes. Se as densidades da pilha são demasiado baixas (por exemplo, abaixo de 200.000 pilhas/poço de uma placa de 12 poços), a seguir pode não haver suficiente material para a diferenciação e a morte de pilha extensiva pode ser observada. O método de de e semeadura descrito acima consistentemente gera aglomerados HPSC de tamanho adequado para diferenciação a jusante.
Uma limitação deste método é que as células de hepatócitos geradas não são idênticas aos hepatócitos adultos, já que as células derivadas de hPSC ainda expressam o marcador de fígado imaturo AFP. Além disso, a atividade enzimática do CYP3A4 é aproximadamente 55 vezes menor nestas células de hepatócitos derivados de hPSC em comparação com hepatócitos humanos primários adultos. Um desafio que se aproxima será amadurecer estas células de hepatócitos derivadas de hPSC em células de pleno direito, como adultas. Uma segunda limitação é que a diferenciação eficiente é extremamente dependente da densidade inicial das células e, portanto, é muito importante para a semente na densidade recomendada e para dispersá-los uniformemente através da placa (tabela 3).
Globalmente, este protocolo produz progenitores de broto hepático e células como hepatócitos em 89.0 ± 3,1% de pureza em pelo menos 3 linhas hPSC. Em segundo, Hepatocyte-como pilhas expressaram enzimas do fígado, albumina humana secretado e expressaram uns níveis mais elevados de genes do fígado do que as pilhas geradas usando aproximações existentes da diferenciação. Finalmente, as células resultantes de hepatócitos não só exibem certas funções de hepatócitos in vitro, mas o mais importante que podem funcionar até certo ponto in vivo, pois podem entransplantar um modelo de rato de lesão hepática crónica e melhorar a sobrevivência a curto prazo2 .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Bing Lim para discussões e do Stanford Institute for Stem Cell Biology & medicina regenerativa para suporte de infra-estrutura. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de medicina regenerativa da Califórnia (DISC2-10679) e pelo Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (para L.T.A. e K.M.L.) e o centro de Stanford Beckman para medicina molecular e genética, bem como o Anonymous, Famílias de Baxter e de DiGenova (a K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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