Vi præsenterer her, en protokol for at designe og fremstille nanostrukturerede porøs silicium (PSi) film som nedbrydeligt bærere af den nerve vækstfaktor (NGF). Neuronal differentiering og udvækst af PC12 celler og mus dorsalrods ganglion (DRG) neuroner er karakteriseret ved behandling med NGF-loaded PSi luftfartsselskaber.
Trods den store potentiale af NGF til behandling af neurodegenerative sygdomme, dens terapeutiske administration repræsenterer en betydelig udfordring, som proteinet ikke krydse blod – hjerne barrieren, på grund af dets kemiske egenskaber, og dermed kræver langsigtet levering til hjernen til at have en biologisk virkning. Dette arbejde beskriver fabrikation af nanostrukturerede PSi film som nedbrydeligt bærere af NGF for vedvarende levering af denne følsomme protein. PSi luftfartsselskaber er specielt skræddersyet til at opnå høj lastning effektivitet og kontinuerlig frigivelse af NGF for en periode på fire uger, samtidig bevare sin biologiske aktivitet. Opførsel af NGF-PSi luftfartsselskaber som en NGF levering system er undersøgt in vitro- ved at undersøge deres evne til at fremkalde neuronal differentiering og udvækst af PC12 celler og dissocierede DRG neuroner. Cellernes levedygtighed i pæn og NGF-loaded PSi luftfartsselskaber er evalueret. Bioactivity af NGF frigivet fra PSi luftfartsselskaber er i forhold til den konventionelle behandling af gentagne gratis NGF administrationer. PC12 celledifferentiering er analyseret og karakteriseret ved måling af tre forskellige morfologiske parametre af differentierede celler; a antallet neurites uddrager af soma (ii) den samlede neurites længde og (iii) antallet forgrening punkter. PC12 celler behandles med NGF-PSi luftfartsselskaber viser en dyb differentiering i hele perioden frigivelse. Desuden viser DRG neuronale celler dyrkes med NGF-PSi luftfartsselskaber en omfattende neurite indledning, svarende til neuroner behandlet med gentagne gratis NGF administrationer. De studerede afstemmelige luftfartsselskaber demonstrere de langsigtede implantater til NGF udgivelse med terapeutiske potentiale for neurodegenerative sygdomme.
NGF er afgørende for udvikling og vedligeholdelse af neuroner i det perifere nervesystem (PNS)1 og spiller en afgørende rolle for overlevelse og funktion af basale forhjernen kolinerge neuroner i det centrale nervesystem (CNS)2. Dens høje farmakologiske potentiale til behandling af centrale neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers og Parkinsons, er blevet bredt påvist med kliniske forsøg i øjeblikket i fremskridt3,4,5, 6. Den største udfordring i levering af NGF til CNS er bosat i sin evne til at krydse blod-hjerne barrieren (BBB), når systemisk administreres7. Derudover NGF modtagelighed for hurtig Enzymatisk nedbrydning gengiver sin korte half-life og væsentligt begrænser dens terapeutiske Brug8,9. Derfor er der en udækket udfordring at designe fremføringsmidler, som giver mulighed for en langvarig og kontrolleret frigivelse af NGF på en sikker måde. Forskellige NGF leveringssystemer, herunder polymer-baserede systemer, har været undersøgt10,11,12,13,14,15, 16 , 17. frigivelse profiler af disse systemer var ofte præget af en særskilt indledende brast efterfulgt af en langsom kontinuerlig frigivelse, hvor i den sidste fase frigivelse sats var betydeligt lav i forhold til de oprindelige burst11 ,18,19. Derudover inaktivering af protein af de sure nedbrydningsprodukter af polymerer (f.eks., poly(lactic-co-glycolic) syre) eller tab af NGF bioactivity under indkapsling processen blev observeret med dette systems20.
Nanostrukturerede PSi er kendetegnet ved flere tiltalende egenskaber, herunder dets høje overfladeareal, store porøse volumen, biokompatibilitet og afstemmelige nedbrydelighed i kropsvæsker, predestining det til en lovende drug delivery platform21, 22,23,24,25,26,27,28. Korrekt udvælgelse af betingelserne for dens anodization giver mulighed for at nemt tilpasse PSi strukturelle egenskaber (f.eks., porøsitet og pore størrelse) for skræddersy drug lastning og frigivelse kinetik21,27. Desuden forskellige praktisk kemiske ruter giver mulighed for at ændre overfladen af PSi og af at yderligere indstille udløsningshastighed af Si stillads under fysiologiske forhold og frigivelse satserne for drug22,24, 29,30.
Dette arbejde fokuserer på at designe en PSi-baserede levering system for langvarig kontrolleret frigivelse af NGF. Effekten af NGF-PSi luftfartsselskaber på neuronal differentiering og udvækst er undersøgt ved hjælp af PC12 celler og adskilles DRG neuroner. Vi demonstrere, at de indlæste NGF har bevaret sin bioactivity ved at inducere neurite udvækst og dybtgående differentiering gennem en 1-måneds udgivelse periode inden for en enkelt administration.
Nedbrydelige nanostrukturerede PSiO2 film er fabrikeret og ansat som bærere af NGF, giver mulighed for kontinuerlig og langvarig udgivelsen, samtidig med at dens biologiske aktivitet. PSiO2 potentiale til at tjene som en levering system for NGF er vist in vitro- ved at demonstrere deres evne til at frigive tilstrækkelig NGF dosering for at fremkalde neuronal differentiering og fremme udvækst af PC12 celler og DRG neuroner. Manipuleret filmene kan bruges som langsigtede reservoirer for NGF for fremtidige behandling in vivo.
De strukturelle egenskaber af de fabrikerede PSi film var skræddersyet til NGF nyttelast; strømtæthed af elektrokemiske ætsning proces blev justeret for at få porestørrelse af ca. 40 nm, der ønsker let rumme NGF, et protein med en molecular weight af 26,5 kDa32 og en karakteristisk diameter på ~ 4 nm33, inden for den porøse matrix. Derudover blev termisk oxidation af porøse skafottet udført for at aktivere fysiske adsorption af NGF af elektrostatisk tiltrækning af de positivt ladede protein negativt ladede oxideret PSi overflade. Overfladekemi af PSi udøver en større effekt på lastning effektivitet og kan indstilles let for bedre at styre samspillet mellem nyttelasten og den porøse matrix. Disse interaktioner diktere efterfølgende struktur af adsorberet proteinmolekyler og deres bioactivity34,35,36. Afslutningsvis, blev systemet justeret for at opnå optimal lastning af NGF ved omhyggeligt at vælge passende porestørrelse, overflade egenskaber og den ideelle lastning opløsningsmiddel og den deraf følgende virkning af de nævnte parametre dikterer protein lastning effekten. Derfor, enhver ændring i parametrene fabrikation (fx, strømtæthed, ætsning tid, type og koncentration af dopant eller elektrolyt), overfladen kemi eller lastning løsning sammensætning kan påvirke lastning effekten og bioactivity af den indlæst protein.
Frigivelse sats af en nyttelast fra PSi orPSiO2vært er generelt dikteret af en kombination af to samtidige mekanismer, ud diffusion af nyttelasten molekyler og nedbrydningen af Si stillads37. Erosion og efterfølgende udløsningshastighed påvirkes af implantation site, dets patologi og sygdom stat28,38,39. Det blev fastslået i tidligere arbejde hvis en anden frigivelse sats er nødvendig for en bestemt terapeutisk program, release profil kan være ændret og forlænget ved at ændre overfladekemi PSi overflade38,40, 41. Forskellige kemiske modifikationer, som termisk oxidation, termisk forkoksning og hydrosilylation teknikker, har vist sig at stabilisere PSi overflade og påvirke dets nedbrydning og deraf følgende nyttelast release35,42 ,43,44,45. Derudover lastning af NGF til bærere af kovalent fastgørelse af proteinmolekyler Si stillads via forskellige overfladekemi ruter bør resultere i en mere langvarig udgivelsen fordi payload kun frigives når kovalente bindinger er brudt eller den støtte Si matrix er nedbrudt21.
Desuden, efter sin fabrikationsproces PSi kan gengives i forskellige konfigurationer ud over tynde film, såsom mikropartikler46, nanopartikler47 eller fritstående membraner26, der kan også anvendes som bærestof for NGF og opfylde specifikke anvendelse behov.
For at være klinisk relevant, bør NGF indhold inden for PSiO2 luftfartsselskaber nå vifte af terapeutiske doser. I metoden beskrevet i protokollen, NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber er indført i en sammenhængende volumen på 2 mL af celle medier eller PBS buffer og dermed koncentrationen af lastning løsning og de respektive NGF masse indlæst blev justeret for at give en udgivet NGF koncentration, der er relevante for testet in vitro- systemet. Når man bruger denne metode til forskellige systemer, såsom ex vivo eller i vivo miljøer, bør koncentrationen af NGF lastning løsning steg og tilpasset den nødvendige dosis. Alternativt, højere NGF indhold kan opnås ved at indføre flere luftfartsselskaber pr. testet område eller ved hjælp af større områder af PSiO2 prøver.
Desuden skal det bemærkes, at i senere tidspunkter langs perioden udgivelse, udgivet NGF koncentrationerne er langt lavere end i tidligere tid point. Det faktum, at NGF flux ikke er konstant over tid skal tages i betragtning, når designe systemet efter ansøgning behov.
Talrige NGF levering systemer har udviklet og offentliggjort i litteraturen, de fleste af dem er polymer-baserede systemer, der består af syntetisk eller naturlig polymer konjugater10,11,12,15 , 16 , 17. disse systemer har vist effektiv vedvarende frigivelse profiler, men perioden release strakte sig over en periode på flere dage med en betydelig burst effekt. Nogle af disse leveringsplatforme lider af kritiske begrænsninger såsom tab af bioactivity ved indkapsling proces, der kræver brug af forskellige stabiliserende agenter18,48, samt avancerede og komplekse Fabrication teknikker16. En af de største udfordringer i at designe fremføringsmidler for proteiner er muligheden for at bevare bioactivity af molekyler på fastklemning inden for carrier system. Proteiner eller peptider kan indlæses i PSi/PSiO2 på RT eller selv ved lavere temperaturer uden brug af stærke organiske opløsningsmidler, som er begge vigtige faktorer, når indlæsning af disse følsomme biomolekyler. Tidligere undersøgelser har vist, at PSi/PSiO2 overfladekemi spiller en afgørende rolle i at minimere mulige denaturering af indlæst proteiner35,36. PSi/PSiO2 er derfor en fordelagtig nanomateriale til udvikling af fremføringsmidler til vækstfaktorer i almindelighed og NGF især.
Det nuværende arbejde er fokuseret på udnytte denne metode som en ny terapeutisk strategi for direkte administration af NGF i CNS for potentiel behandling af neurodegenerative sygdomme. NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber kan implanteres i mus hjerner og effektiviteten af platformen som langsigtede implantater er undersøgt i vivo. Derudover kan kombinerer denne lovende luftfartsselskaber med non-invasiv biolistics49,50 aktivere en til at administrere NGF-loaded PSiO2 partikler i en yderst rumlige opløsning til en lokaliseret område ved hjælp af en pneumatisk roman kapillar pistol til behandling af neurodegenerative sygdomme, hvor en spatiotemporelle drug administration er påkrævet. Derudover kan NGF direkte neuronal vækst i en kemisk gradient måde51, svarende til axon vejledning molekyler. Således, de indlæste PSiO2 luftfartsselskaber kan tjene som lokkemidler hot spots til NGF, direkte vækst, supplerer andre lede stikord52,,53. Derudover kan PSiO2luftfartsselskaber specifikt skræddersyet til at opretholde levering af NGF for en meget-udvidet tidsperiode på op til flere måneder af yderligere tuning PSiO2 nanostrukturer og dens overflade kemi.
The authors have nothing to disclose.
MS og ES anerkender de centrale tjenester og støtte fra lastbil I. Lokey Center for Life Science og teknik og den finansielle støtte for Russell Berrie nanoteknologi Institut på Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |