Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Designe porøs silicium film som bærere af Nerve vækst faktor

Published: January 25, 2019 doi: 10.3791/58982
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Biotechnology and Food Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Bar-Ilan Institute of Nanotechnologies and Advanced Materials, 4Russell Berrie Nanotechnology Institute, Technion - Israel Institute of Technology

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at designe og fremstille nanostrukturerede porøs silicium (PSi) film som nedbrydeligt bærere af den nerve vækstfaktor (NGF). Neuronal differentiering og udvækst af PC12 celler og mus dorsalrods ganglion (DRG) neuroner er karakteriseret ved behandling med NGF-loaded PSi luftfartsselskaber.

Abstract

Trods den store potentiale af NGF til behandling af neurodegenerative sygdomme, dens terapeutiske administration repræsenterer en betydelig udfordring, som proteinet ikke krydse blod - hjerne barrieren, på grund af dets kemiske egenskaber, og dermed kræver langsigtet levering til hjernen til at have en biologisk virkning. Dette arbejde beskriver fabrikation af nanostrukturerede PSi film som nedbrydeligt bærere af NGF for vedvarende levering af denne følsomme protein. PSi luftfartsselskaber er specielt skræddersyet til at opnå høj lastning effektivitet og kontinuerlig frigivelse af NGF for en periode på fire uger, samtidig bevare sin biologiske aktivitet. Opførsel af NGF-PSi luftfartsselskaber som en NGF levering system er undersøgt in vitro- ved at undersøge deres evne til at fremkalde neuronal differentiering og udvækst af PC12 celler og dissocierede DRG neuroner. Cellernes levedygtighed i pæn og NGF-loaded PSi luftfartsselskaber er evalueret. Bioactivity af NGF frigivet fra PSi luftfartsselskaber er i forhold til den konventionelle behandling af gentagne gratis NGF administrationer. PC12 celledifferentiering er analyseret og karakteriseret ved måling af tre forskellige morfologiske parametre af differentierede celler; a antallet neurites uddrager af soma (ii) den samlede neurites længde og (iii) antallet forgrening punkter. PC12 celler behandles med NGF-PSi luftfartsselskaber viser en dyb differentiering i hele perioden frigivelse. Desuden viser DRG neuronale celler dyrkes med NGF-PSi luftfartsselskaber en omfattende neurite indledning, svarende til neuroner behandlet med gentagne gratis NGF administrationer. De studerede afstemmelige luftfartsselskaber demonstrere de langsigtede implantater til NGF udgivelse med terapeutiske potentiale for neurodegenerative sygdomme.

Introduction

NGF er afgørende for udvikling og vedligeholdelse af neuroner i det perifere nervesystem (PNS)1 og spiller en afgørende rolle for overlevelse og funktion af basale forhjernen kolinerge neuroner i det centrale nervesystem (CNS)2. Dens høje farmakologiske potentiale til behandling af centrale neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers og Parkinsons, er blevet bredt påvist med kliniske forsøg i øjeblikket i fremskridt3,4,5, 6. Den største udfordring i levering af NGF til CNS er bosat i sin evne til at krydse blod-hjerne barrieren (BBB), når systemisk administreres7. Derudover NGF modtagelighed for hurtig Enzymatisk nedbrydning gengiver sin korte half-life og væsentligt begrænser dens terapeutiske Brug8,9. Derfor er der en udækket udfordring at designe fremføringsmidler, som giver mulighed for en langvarig og kontrolleret frigivelse af NGF på en sikker måde. Forskellige NGF leveringssystemer, herunder polymer-baserede systemer, har været undersøgt10,11,12,13,14,15, 16 , 17. frigivelse profiler af disse systemer var ofte præget af en særskilt indledende brast efterfulgt af en langsom kontinuerlig frigivelse, hvor i den sidste fase frigivelse sats var betydeligt lav i forhold til de oprindelige burst11 ,18,19. Derudover inaktivering af protein af de sure nedbrydningsprodukter af polymerer (f.eks., poly(lactic-co-glycolic) syre) eller tab af NGF bioactivity under indkapsling processen blev observeret med dette systems20.

Nanostrukturerede PSi er kendetegnet ved flere tiltalende egenskaber, herunder dets høje overfladeareal, store porøse volumen, biokompatibilitet og afstemmelige nedbrydelighed i kropsvæsker, predestining det til en lovende drug delivery platform21, 22,23,24,25,26,27,28. Korrekt udvælgelse af betingelserne for dens anodization giver mulighed for at nemt tilpasse PSi strukturelle egenskaber (f.eks., porøsitet og pore størrelse) for skræddersy drug lastning og frigivelse kinetik21,27. Desuden forskellige praktisk kemiske ruter giver mulighed for at ændre overfladen af PSi og af at yderligere indstille udløsningshastighed af Si stillads under fysiologiske forhold og frigivelse satserne for drug22,24, 29,30.

Dette arbejde fokuserer på at designe en PSi-baserede levering system for langvarig kontrolleret frigivelse af NGF. Effekten af NGF-PSi luftfartsselskaber på neuronal differentiering og udvækst er undersøgt ved hjælp af PC12 celler og adskilles DRG neuroner. Vi demonstrere, at de indlæste NGF har bevaret sin bioactivity ved at inducere neurite udvækst og dybtgående differentiering gennem en 1-måneds udgivelse periode inden for en enkelt administration.

Protocol

Alle metoder er blevet godkendt af etiske udvalg af Bar Ilan University.

1. fabrikation af oxideret PSi (PSiO2) luftfartsselskaber

  1. Skær et Si-wafer (enkelt side poleret i < 100 > ansigtet og stærkt Boron-dopede, p-type, 0,95 mΩ·cm) i 1,5 cm × 1,5 cm prøver ved hjælp af en diamant spids pen.
  2. Oxidere Si prøver i en tube ovn ved 400 ° C i 2 timer i luften (opvarmning hastighed: 25 ° C/min., Naturlig nedkøling).
  3. Fordyb Si prøver i en opløsning af vandige flussyre (HF) (48%), Hedeselskabet2O og ethanol (99,9%) (1:1:3 v/v/v) for 5 min; derefter skylles prøver med ethanol tre gange og tørre under en nitrogen stream.
    Bemærk: Forberede og gemme HF løsning i plasticware kun, som HF opløser glas.
    Forsigtig: HF er en stærkt ætsende væske, og det bør håndteres med ekstrem omhu. I tilfælde af eksponering, skylles grundigt med vand og behandle det berørte område med HF modgift gel; søge lægehjælp øjeblikkeligt.
  4. Mount Si prøven i et polytetrafluorethylen ætsning celle, ved hjælp af en strimmel alufolie som en back-kontakt og en platin spole som counter elektrode.
  5. Etch en blote lag i en 3:1 (v/v) opløsning af vandige HF og ethanol (99,9%) til 30 s i en konstant strømtæthed 250 mA/cm2; derefter skylles overfladen af den resulterende PSi film med ethanol tre gange og tørre under en nitrogen stream.
  6. Opløse den frisk ætset porøse lag i en vandig NaOH opløsning (0,1 M) i 2 min. Skyl derefter med ethanol tre gange og tørre under en nitrogen stream.
  7. Fordyb prøven i en opløsning af vandige HF (48%), Hedeselskabet2O og ethanol (99,9%) (1:1:3 v/v) i 2 min. Skyl derefter med ethanol tre gange og tørre under en nitrogen stream.
  8. Elektrokemisk etch Si proeven i et 3:1 (v/v) opløsning af vandige HF og ethanol (99,9%) til 20 s på en konstant strømtæthed 250 mA/cm2; derefter skylles overfladen af den resulterende PSi film med ethanol tre gange og tørre under en nitrogen stream.
  9. Termisk oxidere frisk ætset PSi prøver i en tube ovn ved 800 ° C i 1 time i luften (opvarmning hastighed: 25 ° C/min., Naturlig nedkøling) til at danne en porøs SiO2 (PSiO2) stillads.
  10. Spin-coat PSiO2 prøver med en positiv tyk photoresist ved 4000 rpm i 1 min; derefter bages de coatede prøver ved 90 ° C i 2 min. (varme rate: 5 ° C/min., Naturlig nedkøling).
  11. Terning PSiO2 prøver i 8 mm × 8 mm prøver ved hjælp af en terninger sav.
  12. For at fjerne photoresist, suge de hakkede prøver i acetone for 3 h; skyl derefter grundigt med ethanol og tørre under en nitrogen stream.

2. ladning PSiO2 med NGF

  1. For at forberede NGF lastning løsning, opløse 20 µg af murine β-NGF i 400 µL af 1:1 (v/v) opløsning af 0,01 M fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og Hedeselskabet2O.
  2. Tilføje 52 µL af opløsningen laste oven i PSiO2 prøve og inkuberes i 2 timer ved RT i en udjævnet parabol.
    Bemærk: Fastholde høj luftfugtighed i fadet til at forhindre udtørring af løsningen under inkubation.
  3. Indsamle løsning på toppen af prøven til efterfølgende kvantificering af NGF indhold inden for PSiO2 luftfartsselskab.
    Bemærk: NGF lastning i PSiO2 skal udføres umiddelbart før den påtænkte anvendelse, protokollen kan ikke afbrydes midlertidigt her på grund af risikoen for tørring og denaturering af protein.

3. kvantificering af NGF lastning af NGF ELISA

  1. For at forberede ELISA-pladen, Tilsæt 100 µL af 0,5 µg/mL capture antistof (kanin-anti-hβ-NGF) til hver godt, forsegle pladen og der inkuberes natten over ved RT.
  2. Opsug wells for at fjerne væske og vaske pladen fire gange med 300 µL af vaskebuffer (0,05% Tween-20 i PBS) pr. brønd; efter den sidste vask vendes pladen for at fjerne resterende buffer og duppes på et stykke køkkenrulle.
  3. Tilsæt 300 µL af blok buffer (1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS) til hver brønd og Inkuber i mindst 1 time på RT. Derefter Aspirér og vaske pladen fire gange som beskrevet i trin 3.2.
  4. For at forberede en kalibreringskurve, fortyndes NGF lastning løsning (Se trin 2.1) i fortyndingsmiddel (0,05% Tween-20, 0,1% BSA i PBS) til 1 ng/mL. Derefter udføre 2-fold serielle fortyndinger fra 1 ng/mL til nul til få kalibrering kurve prøver.
  5. For at forberede prøverne, fortyndes NGF lastning løsning (fra trin 2.1) og indsamlet efter lastning løsning (fra trin 2.3) i fortyndingsmiddel 1:100,000 og 1:10,000 henholdsvis, for at nå området koncentrationer af ELISA kit i brug (16-1.000 pg/mL).
  6. Tilsæt 100 µL af de fortyndede prøver og kalibrering kurve prøver hver godt i tre eksemplarer og inkuberes ved RT for 2 h; derefter Aspirér og vaske pladen fire gange som beskrevet i trin 3.2.
  7. Tilsæt 100 µL 1 µg/mL påvisning antistof (biotinylated kanin anti-hβ-NGF) til hver brønd og Inkuber på RT for 2 h. Derefter Aspirér og vaske pladen fire gange som beskrevet i trin 3.2.
  8. Fortyndes begærlighed-peberrod peberrodsperoxidase (HRP) 1:2,000 i fortyndingsmiddel, tilføje 100 µL pr. brønd og Inkuber i 30 min. ved RT. Nu Aspirér og vaske pladen fire gange som beskrevet i trin 3.2.
  9. Tilsæt 100 µL af substratopløsning til hver brønd og Inkuber 25 min på RT for farve udvikling. Absorbansen måles ved 405 nm bølgelængde korrektion angive på 650 nm med en mikrotiterplade læser.
  10. Bestemme NGF koncentration i både lastning løsning og indsamlet efter lastning løsning baseret på kalibreringskurven.
  11. For at beregne NGF masse indlæst i PSiO2 carrier, subtrahere NGF masse i opløsningen indsamlet efter indlæsning fra NGF massen i ladning opklaring. NGF lastning effekt beregnes ved følgende ligning:
    Equation

4. in vitro NGF frigivelse fra PSiO2

  1. Inkuber NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber i 2 mL 0,01 M PBS indeholdende 1% (w/v) BSA og 0,02% (w/v) natriumazid ved 37 ° C og under orbital agitation af 100 rpm.
  2. Hver 2 dage indsamle løsningen og erstatte det med 2 mL frisk PBS. Fryse de indsamlede release prøver i flydende nitrogen og opbevares ved-20 ° C for yderligere analyser.
  3. Brug de kommercielt tilgængelige NGF ELISA assay til at kvantificere NGF indhold i release-prøver som beskrevet i trin 3.1-3.9.
    Bemærk: Når du forbereder udgivelsen prøver for ELISA kvantificering, forskellige fortyndinger skal udføres for forskellige tidspunkter langs release periode (dvs. tidligere tidspunkt punkter skal fortyndes meget mere end senere tid point). Desuden, for hver udgivelse prøve, mindst to forskellige fortyndinger bør udføres og kvantificeres for at sikre at nå rækken koncentrationer af ELISA kit.
  4. Bestemme NGF koncentration i release prøver baseret på kalibreringskurven og et afbildes af akkumulerende NGF frigivelse over tid.

5. kvantificering af in vitro- Si Erosion af Induktivt koblet Plasma atomiske Emission spektroskopi (ICP-AES)

  1. 1 mL af frigivelse prøver 1:10 i release buffer (0,01 M PBS indeholdende 1% (w/v) BSA og 0,02% (w/v) natriumazid) fortyndes til en samlet maengde paa 10 mL.
  2. Overvåge Si atomiske emission toppe på 212.4, 251.6 og 288.2 nm for de fortyndede prøver.
  3. Bestemme Si koncentration i prøverne baseret på en kalibreringskurve.
  4. For at etablere Si nedbrydning profil, udtrykke Si indholdet på hvert tidspunkt som en procentdel af det samlede indhold af Si luftfartsselskaber (dvs. den kumulative Si indhold langs perioden release).
    Bemærk: For at sikre nøjagtig kvantificering af det samlede indhold af Si luftfartsselskaber, release prøver er stikprøven 1 måned efter farveprøve af udgivelsen studere og analyseret for Si koncentration ved hjælp af ICP-AES. Summere den kumulative Si indhold langs perioden frigivelse og Si indholdet i de efterfølgende prøver giver 100% af Si indhold.

6. celle levedygtighed og vækst i overværelse af NGF-Loaded Psio2 luftfartsselskaber

  1. Rotte fæokromocytom (PC12) cellekultur
    1. Forberede den grundlæggende vækstmediet ved at føje 10% hest serum (HS), 5% føtal bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin streptomycin og 0,2% amphotericin til Roselle Park Medical Institute (RPMI) medium.
    2. Forbered differentiering medium ved tilsætning af 1% HS, 1% L-glutamin, 1% penicillin streptomycin og 0,2% amphotericin til RPMI medium.
    3. Vokse cellesuspension (106 celler) i en 75 cm2 kultur kolbe med 10 mL af grundlæggende vækstmedium for 8 dage; Kolben tilsaettes 10 mL af grundlæggende vækstmediet hver 2 dage.
    4. For at generere differentierede PC12 cellekultur, overføre cellesuspension til et centrifugeglas; Der centrifugeres celler for 8 min på 200 x g og RT. udsmid supernatanten.
    5. Suspendere celler i 5 mL frisk grundlæggende vækstmediet og re centrifugeres celler i 5 min på 200 x g og RT; supernatanten og resuspenderes celle i 3 mL af grundlæggende vækstmediet.
    6. For at adskille celle klynger, Aspirér cellerne ti gange ved hjælp af en 23 G sprøjte.
    7. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer celle counter og frø 104 celler/cm2 arbejdsområde på kollagen type l overtrukne plader i overværelse af differentiering medium.
    8. Efter 24 h, tilføje frisk murine β-NGF (50 ng/mL) eller NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskab pr. plade.
      Bemærk: Højere NGF koncentrationer (> 50 ng/mL) besidder den nøjagtige effekt som den angivne koncentration.
    9. Forny differentiering mellem hver 2 dage.
    10. At evaluere cellernes levedygtighed, tilføje 10% (v/v) af levedygtighed indikatoropløsning (resazurin-baseret) på repræsentative tidspunkter og Inkuber i 5 timer ved 37 ° C; Absorbansen måles på 490 nm med et spektrofotometer.
  2. Mus dorsalrodsganglier (DRG) cellekultur
    1. For at isolere DRG fra to 7 uger gamle C57bl mus, først slukke mus med 70% ethanol og gøre et snit til at fjerne huden.
    2. Skær bunden af kraniet og bugvæggen muskler till rygmarven er udsat.
    3. Fjern rygsøjlen ved at gøre et snit på niveau med lårben og rengør det omgivende væv.
    4. Skær kolonnen i tre stykker; derefter skæres hvert stykke i midterlinjen at generere to halvdele og skræl ud af rygmarven.
    5. Under kikkerten, udtrække alle DRG ganglier og Fordyb dem i en kold Hank afbalanceret saltopløsning (HBSS).
    6. Rengør de omkringliggende bindevæv af pining DRG på en petriskål og forsigtigt fjerne resterende meninges under kikkerten.
    7. Adskille DRG celler ved at inkubere dem i 20 min. i 1.000 U af papain.
    8. Der centrifugeres celler i 4 min på 400 x g. Supernatanten og holde celle pellet.
    9. Resuspenderes i en 10 mg/mL collagenase og 12 mg/mL dispase-II opløsning og inkuberes i 20 min ved 37 ° C.
    10. Centrifugeres celler for 2 min på 400 x g; supernatanten og holde celle pellet.
    11. Hakkede celle pellet i 1 mL af HBSS, 10 mM glukose og 5 mM HEPES (pH 7,35) ved gentagne passage gennem en sammensnøret Pasteur pipette.
    12. Forsigtigt tilføje de dissocierede celler til L-15 medium indeholdende 20% af silica-baserede kolloid medium for celle adskillelse af tæthed gradient centrifugering; Der centrifugeres i 8 min ved 1000 x g. Opsug supernatanten og holde celle pellet.
      Bemærk: Formålet med dette trin er at adskille og rense neuronale celler fra cytoskeletale vragrester, Schwann celler og fibroblaster.
    13. Resuspenderes celle i 2 mL af F-12 medium; Der centrifugeres i 2 min på 1.000 x g; supernatanten og resuspenderes i 1 mL af F-12 medium.
    14. Tælle celler og frø 2 × 104 celler på poly-L-lysin og laminin belagt glas bund 35 mm kultur retter, i et F-12 antibiotikum-frit medium suppleret med 10% FBS.
      Bemærk: I første omgang frø celler i en lille mængde af medium (150-200 µL); efter 2 h inkubation ved 37 ° C, tilføje medium for en endelige mængden af 2 mL.
    15. Forsigtigt tilføje NGF-loaded PSiO2 carrier eller frisk murine β-NGF (50 ng/mL) pr. plade.
    16. Efter 2 dage, løse cellekultur ved at inkubere det med en 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) løsning for 15 min på RT; immunostain cellekultur ved hjælp af en fælles immunofluorescens farvning procedure31.
    17. Billede af neuronal cellekultur ved hjælp af en Konfokal mikroskop.

7. celle differentiering analyse

  1. PC12 celler differentiering procentdel i overværelse af NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber
    1. Inkuber NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber i 2 mL af differentiering medium, i en fugtig inkubator ved 37 ° C indeholdende 5% CO2.
    2. Hver 2 dage, indsamle løsningen og erstatte det med 2 mL frisk medium. Fryse de indsamlede release prøver i flydende nitrogen og opbevares ved-20 ° C for yderligere analyser.
    3. Seed PC12 celler i 12-godt kollagen-belagte plader som instruerede i afsnit 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Efter 24 h, indføre release prøver af repræsentative tidspunkter (fra afsnit 5.1.2) at de forskellige brønde; kontrolhullerne, tilføje frisk murine β-NGF (50 ng/mL).
    5. Efter 24 h, billede celler ved hjælp af et lysmikroskop.
    6. Bestem procentdelen af neurite-bærende celler manuelt tælle celler, der havde vokset neurites ud af det samlede antal celler i billeder (n = 5 rammer for hver brønd); Absorbanserne afbildes af procentdelen af PC12 celler med neurite udvækst over tid.
      Bemærk: Udifferentierede PC12 celler syntes at have rundet struktur uden neurites, mens differentierede celler kan identificeres ved udvækst af neurites (mindst en af mindste længde svarende til celle soma diameter) eller morfologiske ændringer.
  2. Morfometrisk analyse af differentierede PC12 celler
    1. For forarbejdning billedanalyse, erhverve fase billeder af dyrkede celler op til 3 dage efter behandling med NGF (som gratis reagens eller produktets frigivelse af NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber).
      Bemærk: På senere tidspunkter (ud over dag 5) cellerne udvikle komplekse netværk, forhindre morfometrisk målinger med en enkelt celle opløsning.
    2. Download billede behandlingsprogram NeuronJ, en ImageJ plug-in, som giver mulighed for en semi-automatiske neurite sporing og måling af længde.
    3. Konvertere billedfiler til en 8-bit format og foranstaltning pixel til mikrometer ratio hjælp skala billedlinjen.
    4. Indstille omfang ved hjælp af analyser | Angive skala kommando og måle længden af hver neurite.
    5. Manuelt tælle antallet af forgrening punkter og antallet af neurites med oprindelse fra hver celle soma.
      Bemærk: En gennemsnitlig neurite længde 1 dag efter NGF behandling er ca 30 µm. De målte neurite længder kan distribueres bredt.

Representative Results

Oxideret PSi film er fremstillet som beskrevet i protokollen. Si-wafer er udsat for elektrokemisk ætsning for 20 s på 250 mA/cm2 (figur 1ai), efterfulgt af termisk oxidation ved 800 ° C (figur 1aii) til at producere en PSiO2 stillads. Høj opløsning, scanning elektronmikroskopi (HR-SEM) billeder af den resulterende PSiO2 film er vist i figur 1bc. Top-Se Mikrograf af film (figur 1b) skildrer sin meget porøs karakter med porerne i ca. 40 nm i diameter. Tværsnits Mikrograf af en kløvet film (figur 1 c) afslører porøse lagtykkelse 2,9 µm, kendetegnet ved sammenhængende cylindrisk porer.

PSiO2 film er indlæst med NGF lastning løsning, som illustreret i figur 1aiii. NGF lastning kvantificeres ved hjælp af NGF ELISA ved at måle NGF koncentrationer i opløsningen lastning, før og efter inkubation med PSiO2 film. Den gennemsnitlige masse for den indlæste NGF pr. PSiO2 film bestemmes som 2,8 ± 0,2 µg, som svarer til en høj ladning effekten af 90% (w/w) (data ikke vist31). For at etablere NGF release profil fra PSiO2 luftfartsselskaber, de indlæst film inkuberes i PBS ved 37 ° C og hver 2 dage delprøver er udtaget prøver til kvantificering af de frigivne proteinkoncentration bruger NGF ELISA. Derudover Si indholdet i release prøver kvantificeres ved hjælp af ICP-AES og Si erosion kinetik af PSiO2 luftfartsselskaber er etableret. Figur 2 viser NGF frigivelse og de tilsvarende Si nedbrydning profiler af de porøse luftfartsselskaber. En vedvarende frigivelse af NGF, uden brast, er nået for en periode på 1 måned. NGF udgivelse i den første uge er hurtigere (hældning = 0.442) i forhold til en langsommere frigivelse i senere dage langs perioden version (hældning 0.043). Det skal bemærkes, at i hele perioden hele 1-måneds udgivelse NGF frigivet mængde er tilstrækkelig for at fremkalde dyb differentiering af PC12 celler, som vil blive drøftet senere. De akkumulerende NGF udgivet er fundet for at være i en god korrelation (R2 = 0.971) med den resterende Si indhold, som vist i figur 2justering.

Næste, bioactivity af NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber er karakteriseret i vitro, PC12 celler og DRG neuroner bruges som modeller for neuronal differentiering og udvækst. PC12 celler og dissocierede DRG neuroner er seedet som beskrevet i protokollen. Først, cellernes levedygtighed i overværelse af PSiO2 luftfartsselskaber er undersøgt af inkubation af celler med pæn (ikke indlæst) eller NGF-loaded PSiO2; kontrol plader og celler behandles med pæn PSiO2 er suppleret med gratis NGF hver 2 dage. Ingen cytotoksicitet er observeret efter udsættelse af celler til de pæne eller NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber (figur 3a), viser, at PSiO2 er biokompatible med denne cellelinie. Figur 3b viser repræsentative HR-SEM micrographs af PC12 celler behandles med NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber. Den observerede celler uddrag neurites og form karakteristiske forgrenet neuronal netværk. Lignende resultater er opnået ved såning dissocieres DRG neuronale celler under overværelse af NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber. Konfokal billeder af immunostained DRG celler kulturperler med NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber (figur 3e) viser en omfattende neurite indledning og strækforlængelse, svarer til den positive kontrol (dvs., neuroner suppleret med gratis NGF, se figur 3d), mens negativt kontrol (dvs., ubehandlet neuroner, se figur 3 c), udstiller en ringe grad af neurite udvækst.

For at vurdere PC12 celler differentiering procentdel i overværelse af NGF frigivet fra PSiO2 luftfartsselskaber, er differentiering kvantificeret ved at tælle celler med neurite udvækst ud af cellen total befolkning. Figur 4 opsummerer resultaterne med hensyn til procentdelen af differentierede celler på forskellige tidspunkter over en periode på 26 dage. Betydelig differentiering procentværdier, der er opnået i hele den undersøgte periode. Især efter 26 dage, har den frigivne NGF induceret differentiering af over 50%, en differentiering procentdel, som er væsentligt højere sammenlignet med tidligere undersøgelser med polymer-baserede luftfartsselskaber16. Disse resultater viser, at NGF entrapment inden for den porøse vært bevaret den biologiske aktivitet i protein for at fremkalde dyb differentiering for ~ 1 måned.

For at yderligere undersøge effekten af NGF-PSiO2 luftfartsselskaber på neuronal differentiering, tre karakteristiske morfologiske parametre af de differentierede PC12 celler er målt på enkelt celle-niveau: (i) antallet af neurites udvinding fra soma ( II) den samlede neurites længde og (iii) antallet forgrening punkter. Cellerne er behandlet med NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber eller med gentagen administration af gratis NGF (hver 2 dage), som et kontrolelement. Figur 5a -Christensen præsenterer morfometrisk analyse af cellen befolkningen på dag 1 og 3. De PC12 celler behandles med NGF-loaded PSiO2 Vis morfometrisk værdier, der svarer til kontrol behandlingen for alle tre testede parametre. Efter 3 dage, er værdier af alle morfologiske parametre observeret for at stige i samme takt for både NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber og kontrol behandling af gentagen indgift af gratis NGF.

Figure 1
Figur 1: Fabrikation af PSiO2 film. (a) fabrikation ordningen af PSiO2 luftfartsselskaber: (i) silicium wafer er udsat for elektrokemisk ætsning for 20 s på 250 mA/cm2, efterfulgt af (ii) termisk oxidation ved 800 ° C til at producere en PSiO2 stillads, og (iii) NGF indlæsning af fysiske adsorption (skema ikke er trukket til skala). (b-c) Top-view og tværsnit elektron micrographs af en karakteristisk PSiO2 film. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: NGF frigivelse og Si erosion profiler af NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber. Omfanget af nedbrydning af PSiO2 luftfartsselskaber er præsenteret som fraktion af det resterende Si indholdet på hvert tidspunkt ud af det samlede indhold af Si den porøse film. Indsatsen viser sammenhængen mellem de akkumulerende NGF frigivet og resterende Si indhold. Fejl barer repræsenterer SD, n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Cellernes levedygtighed og vækst i overværelse af NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber. a In vitro celletoksicitet karakterisering. PC12 celler levedygtighed er målt på 1, 3 og 7 dage efter deres eksponering for pæn (ikke indlæst) PSiO2 luftfartsselskaber, NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber eller gratis NGF (50 ng/mL hver 2 dage, kontrol plader). (b) elektron micrographs af PC12 celler kulturperler med NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber i 9 dage. Venstre panel: en zoom-in, skildrer neurite udsprang fra celle soma; højre panel: en zoom-out, der angiver den yderst komplekse neuronal netværk dannet. (c-e) Konfokal mikroskopi billeder af immunostained DRG neuronal celle kultur (2 dage efter såning): (c) ubehandlet celler; (d) celler suppleret med gratis NGF (50 ng/mL); (e) NGF-PSiO2 luftfartsselskaber. Immunfluorescent farvning af neurofilament H muliggør billeddannelse af celle soma og outgrowing neurites. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: PC12 celler differentiering procentværdier ved udsættelse for NGF frigivet fra NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber på repræsentative tidspunkter. Differentiering procentdel udtrykkes som antallet af celler med neurite udvækst ud af cellen total befolkning. Kontrol behandling refererer til cellerne suppleret med gratis NGF (50 ng/mL). Repræsentative lysmikroskopi billeder af celler på de forskellige tidspunkter er afbildet langs x-aksen; skalalinjen = 25 µm for micrographs af dag 2, 8, 14, 26 og 50 µm til kontrol Mikrograf. Fejl barer repræsenterer SD, n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: morfometrisk analyse af differentierede celler, PC12. Tre morfologiske parametre af differentierede PC12 celler er målt på enkelt celle-niveau, på dag 1 og 3 efter eksponering for NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber eller gentagen administration af gratis NGF hver 2 dage (kontrol); (en) samlede neurites længde (b) antallet af neurites udvinding fra celle soma og (c) antallet af forgrening punkter. Fejl barer repræsenterer SD, n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Nedbrydelige nanostrukturerede PSiO2 film er fabrikeret og ansat som bærere af NGF, giver mulighed for kontinuerlig og langvarig udgivelsen, samtidig med at dens biologiske aktivitet. PSiO2 potentiale til at tjene som en levering system for NGF er vist in vitro- ved at demonstrere deres evne til at frigive tilstrækkelig NGF dosering for at fremkalde neuronal differentiering og fremme udvækst af PC12 celler og DRG neuroner. Manipuleret filmene kan bruges som langsigtede reservoirer for NGF for fremtidige behandling in vivo.

De strukturelle egenskaber af de fabrikerede PSi film var skræddersyet til NGF nyttelast; strømtæthed af elektrokemiske ætsning proces blev justeret for at få porestørrelse af ca. 40 nm, der ønsker let rumme NGF, et protein med en molecular weight af 26,5 kDa32 og en karakteristisk diameter på ~ 4 nm33, inden for den porøse matrix. Derudover blev termisk oxidation af porøse skafottet udført for at aktivere fysiske adsorption af NGF af elektrostatisk tiltrækning af de positivt ladede protein negativt ladede oxideret PSi overflade. Overfladekemi af PSi udøver en større effekt på lastning effektivitet og kan indstilles let for bedre at styre samspillet mellem nyttelasten og den porøse matrix. Disse interaktioner diktere efterfølgende struktur af adsorberet proteinmolekyler og deres bioactivity34,35,36. Afslutningsvis, blev systemet justeret for at opnå optimal lastning af NGF ved omhyggeligt at vælge passende porestørrelse, overflade egenskaber og den ideelle lastning opløsningsmiddel og den deraf følgende virkning af de nævnte parametre dikterer protein lastning effekten. Derfor, enhver ændring i parametrene fabrikation (fx, strømtæthed, ætsning tid, type og koncentration af dopant eller elektrolyt), overfladen kemi eller lastning løsning sammensætning kan påvirke lastning effekten og bioactivity af den indlæst protein.

Frigivelse sats af en nyttelast fra PSi orPSiO2vært er generelt dikteret af en kombination af to samtidige mekanismer, ud diffusion af nyttelasten molekyler og nedbrydningen af Si stillads37. Erosion og efterfølgende udløsningshastighed påvirkes af implantation site, dets patologi og sygdom stat28,38,39. Det blev fastslået i tidligere arbejde hvis en anden frigivelse sats er nødvendig for en bestemt terapeutisk program, release profil kan være ændret og forlænget ved at ændre overfladekemi PSi overflade38,40, 41. Forskellige kemiske modifikationer, som termisk oxidation, termisk forkoksning og hydrosilylation teknikker, har vist sig at stabilisere PSi overflade og påvirke dets nedbrydning og deraf følgende nyttelast release35,42 ,43,44,45. Derudover lastning af NGF til bærere af kovalent fastgørelse af proteinmolekyler Si stillads via forskellige overfladekemi ruter bør resultere i en mere langvarig udgivelsen fordi payload kun frigives når kovalente bindinger er brudt eller den støtte Si matrix er nedbrudt21.

Desuden, efter sin fabrikationsproces PSi kan gengives i forskellige konfigurationer ud over tynde film, såsom mikropartikler46, nanopartikler47 eller fritstående membraner26, der kan også anvendes som bærestof for NGF og opfylde specifikke anvendelse behov.

For at være klinisk relevant, bør NGF indhold inden for PSiO2 luftfartsselskaber nå vifte af terapeutiske doser. I metoden beskrevet i protokollen, NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber er indført i en sammenhængende volumen på 2 mL af celle medier eller PBS buffer og dermed koncentrationen af lastning løsning og de respektive NGF masse indlæst blev justeret for at give en udgivet NGF koncentration, der er relevante for testet in vitro- systemet. Når man bruger denne metode til forskellige systemer, såsom ex vivo eller i vivo miljøer, bør koncentrationen af NGF lastning løsning steg og tilpasset den nødvendige dosis. Alternativt, højere NGF indhold kan opnås ved at indføre flere luftfartsselskaber pr. testet område eller ved hjælp af større områder af PSiO2 prøver.

Desuden skal det bemærkes, at i senere tidspunkter langs perioden udgivelse, udgivet NGF koncentrationerne er langt lavere end i tidligere tid point. Det faktum, at NGF flux ikke er konstant over tid skal tages i betragtning, når designe systemet efter ansøgning behov.

Talrige NGF levering systemer har udviklet og offentliggjort i litteraturen, de fleste af dem er polymer-baserede systemer, der består af syntetisk eller naturlig polymer konjugater10,11,12,15 , 16 , 17. disse systemer har vist effektiv vedvarende frigivelse profiler, men perioden release strakte sig over en periode på flere dage med en betydelig burst effekt. Nogle af disse leveringsplatforme lider af kritiske begrænsninger såsom tab af bioactivity ved indkapsling proces, der kræver brug af forskellige stabiliserende agenter18,48, samt avancerede og komplekse Fabrication teknikker16. En af de største udfordringer i at designe fremføringsmidler for proteiner er muligheden for at bevare bioactivity af molekyler på fastklemning inden for carrier system. Proteiner eller peptider kan indlæses i PSi/PSiO2 på RT eller selv ved lavere temperaturer uden brug af stærke organiske opløsningsmidler, som er begge vigtige faktorer, når indlæsning af disse følsomme biomolekyler. Tidligere undersøgelser har vist, at PSi/PSiO2 overfladekemi spiller en afgørende rolle i at minimere mulige denaturering af indlæst proteiner35,36. PSi/PSiO2 er derfor en fordelagtig nanomateriale til udvikling af fremføringsmidler til vækstfaktorer i almindelighed og NGF især.

Det nuværende arbejde er fokuseret på udnytte denne metode som en ny terapeutisk strategi for direkte administration af NGF i CNS for potentiel behandling af neurodegenerative sygdomme. NGF-loaded PSiO2 luftfartsselskaber kan implanteres i mus hjerner og effektiviteten af platformen som langsigtede implantater er undersøgt i vivo. Derudover kan kombinerer denne lovende luftfartsselskaber med non-invasiv biolistics49,50 aktivere en til at administrere NGF-loaded PSiO2 partikler i en yderst rumlige opløsning til en lokaliseret område ved hjælp af en pneumatisk roman kapillar pistol til behandling af neurodegenerative sygdomme, hvor en spatiotemporelle drug administration er påkrævet. Derudover kan NGF direkte neuronal vækst i en kemisk gradient måde51, svarende til axon vejledning molekyler. Således, de indlæste PSiO2 luftfartsselskaber kan tjene som lokkemidler hot spots til NGF, direkte vækst, supplerer andre lede stikord52,,53. Derudover kan PSiO2luftfartsselskaber specifikt skræddersyet til at opretholde levering af NGF for en meget-udvidet tidsperiode på op til flere måneder af yderligere tuning PSiO2 nanostrukturer og dens overflade kemi.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

MS og ES anerkender de centrale tjenester og støtte fra lastbil I. Lokey Center for Life Science og teknik og den finansielle støtte for Russell Berrie nanoteknologi Institut på Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9 (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33 (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8 (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11 (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788 (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40 (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127 (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30 (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30 (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85 (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44 (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10 (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23 (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20 (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16 (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11 (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4 (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5 (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30 (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137 (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251 (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11 (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26 (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3 (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204 (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9 (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25 (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30 (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10 (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26 (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30 (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31 (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108 (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8 (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86 (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26 (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6 (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5 (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700267 (2017).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 143 Nerve vækstfaktor porøs silicium PC12 dorsalrodsganglier kontrolleret frigivelse Neuronal differentiering
Designe porøs silicium film som bærere af Nerve vækst faktor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi,… More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter