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Bioengineering

तंत्रिका विकास कारक के वाहक के रूप में छिद्रित सिलिकॉन फिल्मों डिजाइनिंग

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

यहां, हम डिजाइन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और तंत्रिका विकास कारक (NGF) के लिए क्षरण वाहक के रूप में नैनोसंरचित असुरक्षित सिलिकॉन (साई) फिल्मों बनाना । PC12 कोशिकाओं और चूहों पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि (डीआरजी) न्यूरॉन्स के ंयूरॉन भेदभाव और वृद्धि NGF भरी साई वाहक के साथ इलाज पर विशेषता है.

Abstract

neurodegenerative रोगों के इलाज के लिए NGF की महान क्षमता के बावजूद, अपने चिकित्सीय प्रशासन एक महत्वपूर्ण चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में प्रोटीन रक्त मस्तिष्क बाधा पार नहीं है, इसके रासायनिक गुणों के कारण, और इस तरह लंबी अवधि की आवश्यकता है मस्तिष्क को प्रसव के लिए एक जैविक प्रभाव है । यह काम इस संवेदनशील प्रोटीन के निरंतर वितरण के लिए NGF के क्षरण वाहक के रूप में नैनोसंरचित साई फिल्मों के निर्माण का वर्णन है । साई वाहक विशेष रूप से अपनी जैविक गतिविधि के संरक्षण, जबकि चार सप्ताह की अवधि के लिए उच्च लदान प्रभावकारिता और NGF की लगातार रिहाई प्राप्त करने के लिए सिलवाया रहे हैं । एक NGF वितरण प्रणाली के रूप में NGF-साई वाहक के व्यवहार को न्यूरॉन्स और PC12 कोशिकाओं और असंबद्ध डीआरजी ंयूरॉंस की वृद्धि के लिए प्रेरित करने के लिए उनकी क्षमता का परीक्षण करके इन विट्रो में जांच की है । स्वच्छ और NGF भरी साई वाहकों की उपस्थिति में सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया है । NGF के साई वाहकों से जारी की गैर गतिविधि दोहराए मुक्त NGF प्रशासन के पारंपरिक उपचार की तुलना में है । PC12 कोशिका विभेद का विश्लेषण और विभेदित कोशिकाओं के तीन अलग रूपात्मक मापदंडों की माप द्वारा विशेषता है; (i) सोमार से neurites निकालने की संख्या (ii) कुल neurites ' लंबाई और (iii) बंटी हुई अंकों की संख्या. PC12 कोशिकाओं NGF-साई वाहकों के साथ इलाज जारी अवधि के दौरान एक गहरा भेदभाव का प्रदर्शन । इसके अलावा, डीआरजी ंयूरॉन कोशिकाओं NGF-साई वाहकों के साथ प्रसंस्कृत एक व्यापक neurite दीक्षा दिखाने के लिए, के समान ंयूरॉंस दोहराए मुफ्त NGF प्रशासन के साथ इलाज किया । अध्ययन स्वरित्र वाहकों neurodegenerative रोगों के लिए एक चिकित्सीय क्षमता के साथ NGF रिहाई के लिए दीर्घकालिक प्रत्यारोपण प्रदर्शित करता है ।

Introduction

NGF परिधीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक है (पीएन)1 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)2में अस्तित्व और बेसल forebrain कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इस तरह के अल्जाइमर और पार्किंसंस के रूप में केंद्रीय neurodegenerative रोगों के इलाज के लिए उच्च औषधीय क्षमता, व्यापक रूप से प्रदर्शन किया गया है, नैदानिक परीक्षण के साथ वर्तमान में प्रगति3,4,5, 6. सीएनएस के लिए NGF के वितरण में सबसे बड़ी चुनौती अपने रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB), जब प्रणालीबद्ध प्रशासित7पार करने में असमर्थता में रहता है । इसके अलावा, NGF संवेदनशीलता तेजी से एंजाइमी गिरावट को अपने छोटे आधे जीवन renders और काफी अपनी चिकित्सीय उपयोग सीमा8,9। इसलिए, वहां एक unmet के लिए वितरण प्रणाली है जो एक सुरक्षित तरीके से NGF के एक लंबे समय तक और नियंत्रित रिलीज के लिए अनुमति डिजाइन चुनौती है । विभिन्न NGF वितरण प्रणालियों, जिनमें बहुलक आधारित प्रणालियों का अध्ययन किया गया है,10,11,12,13,14,15, 16 , 17. इन प्रणालियों के रिलीज प्रोफाइल अक्सर एक अलग प्रारंभिक एक धीमी गति से जारी है, जहां बाद के चरण में रिलीज दर प्रारंभिक फट11 की तुलना में काफी कम था द्वारा पीछा किया फट द्वारा विशेषता थे ,18,19. इसके अलावा, पॉलिमर के अम्लीय क्षरण उत्पादों द्वारा प्रोटीन की निष्क्रियता (जैसे, पाली (लैक्टिक-co-glycolic) एसिड) या encapsulation प्रक्रिया के दौरान NGF के नुकसान की कमी इस20प्रणालियों के साथ मनाया गया ।

नैनोसंरचित साई कई अपील गुणों की विशेषता है, इसकी उच्च सतह क्षेत्र सहित, बड़े छिद्रित मात्रा, असंगति, और शारीरिक तरल पदार्थ में स्वरित्र क्षरण, यह एक होनहार दवा वितरण मंच21के लिए पूर्वनिर्धारित, 22,23,24,25,26,27,28। अपनी यांग की स्थिति के उचित चयन के लिए आसानी से साई संरचनात्मक गुणों को समायोजित करने की अनुमति देता है (जैसे, porosity और ताकना आकार) दवा लदान और रिलीज कैनेटीक्स21,27सिलाई के लिए । इसके अलावा, विभिंन सुविधाजनक रासायनिक मार्गों के लिए साई की सतह को संशोधित करने की अनुमति और आगे की धुन शारीरिक स्थितियों के तहत एसआई पाड़ के विघटन दर और22,24दवा की रिहाई दर, २९,३०.

यह काम NGF के लंबे समय तक नियंत्रित रिहाई के लिए एक साई आधारित वितरण प्रणाली डिजाइनिंग पर केंद्रित है । NGF-साई वाहकों के प्रभाव में न्यूरॉन्स और वृद्धि पर PC12 कोशिकाओं और असंबद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स का उपयोग कर की जांच की है. हम प्रदर्शित करते है कि भरी हुई NGF एक एक प्रशासन के भीतर एक 1 महीने के रिलीज की अवधि के दौरान neurite वृद्धि और गहरा भेदभाव उत्प्रेरण द्वारा अपनी गतिविधियों को बनाए रखा है ।

Protocol

बार Ilan विश्वविद्यालय की एथिक्स कमेटी द्वारा सभी तरीकों को मंजूरी दी गई है ।

1. ऑक्सीकरण साई का निर्माण (PSiO2) वाहक

  1. एक एसआई वेफर्स (एकल पक्ष 100 > चेहरे और भारी बोरान-मैगनीज, पी प्रकार, ०.९५ mΩ · cm) में १.५ सेमी × १.५ सेमी एक हीरे की कलम इत्तला दे दी नमूने का उपयोग पर पॉलिश काटा ।
  2. परिवेशी वायु में 2 घंटे के लिए ४०० डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब भट्ठी में एसआई नमूनों ऑक्सीकरण (हीटिंग दर: 25 डिग्री सेल्सियस/
  3. एसआई नमूनों में विसर्जित जलीय hydrofluoric एसिड (HF) (४८%), ddH2ओ और इथेनॉल (९९.९%) (1:1:3 v/v/v) 5 मिनट के लिए; फिर एक नाइट्रोजन धारा के तहत तीन बार इथेनॉल और सूखी के साथ नमूनों कुल्ला ।
    नोट: तैयार और plasticware में HF समाधान की दुकान केवल, के रूप में HF गिलास घुल ।
    चेतावनी: HF एक उच्च संक्षारक तरल है, और यह चरम देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए । जोखिम के मामले में, पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला और HF मारक जेल के साथ प्रभावित क्षेत्र का इलाज; तुरंत चिकित्सा देखभाल के लिए चाहते हैं ।
  4. एक polytetrafluoroethylene नक़्क़ाशी सेल में एसआई नमूना माउंट, एक पीठ से संपर्क करें और काउंटर इलेक्ट्रोड के रूप में एक प्लेटिनम का तार के रूप में एल्यूमीनियम पंनी की एक पट्टी का उपयोग कर ।
  5. एक 3:1 में एक बलि परत खोदना (v/v) जलीय HF और इथेनॉल का समाधान (९९.९%) 30 एस के लिए २५० mA के निरंतर वर्तमान घनत्व पर/फिर इथेनॉल केसाथ परिणामस्वरूप साई फिल्म की सतह कुल्ला तीन बार और एक नाइट्रोजन धारा के नीचे सूखी ।
  6. 2 मिनट के लिए एक जलीय NaOH समाधान (०.१ मीटर) में ताजा-धंसा छिद्रित परत भंग । फिर इथेनॉल के साथ तीन बार कुल्ला और एक नाइट्रोजन धारा के तहत सूखी ।
  7. जलीय HF (४८%), ddH2ओ और इथेनॉल के समाधान में नमूना विसर्जित (९९.९%) (1:1:3 v/v) 2 मिनट के लिए । फिर इथेनॉल के साथ तीन बार कुल्ला और एक नाइट्रोजन धारा के तहत सूखी ।
  8. Electrochemically एक 3:1 में एसआई नमूना खोदना (v/v) जलीय HF और इथेनॉल का समाधान (९९.९%) 20 एस के लिए २५० mA के निरंतर वर्तमान घनत्व पर/फिर इथेनॉल केसाथ परिणामस्वरूप साई फिल्म की सतह कुल्ला तीन बार और एक नाइट्रोजन धारा के नीचे सूखी ।
  9. थर्मल, एक छिद्रित सिइओ2 (PSiO2) पाड़ फार्म करने के लिए ८०० ° c परिवेशी वायु में 1 घंटे के लिए (हीटिंग दर: 25 डिग्री सेल्सियस/मिनट, प्राकृतिक शीतलक) एक ट्यूब भट्ठी में नए सिरे से धंसा साई नमूने ऑक्सीकरण ।
  10. स्पिन-कोट 1 मिनट के लिए ४,००० rpm पर एक सकारात्मक मोटी photoresist के साथ PSiO2 नमूने; फिर 2 मिनट के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर लेपित नमूनों सेंकना (हीटिंग दर: 5 डिग्री सेल्सियस/
  11. एक dicing देखा का उपयोग 8 मिमी × 8 मिमी नमूनों में PSiO2 नमूनों पासा.
  12. photoresist को हटाने के लिए, 3 ज के लिए एसीटोन में पासा नमूने लेना; फिर अच्छी तरह से एक नाइट्रोजन धारा के तहत इथेनॉल और सूखी के साथ कुल्ला ।

2. NGF के साथ PSiO2 लोड हो रहा है

  1. NGF लोडिंग समाधान तैयार करने के लिए, murine β-NGF के 20 µ g को भंग करने में ४०० µ l की 1:1 (v/v) का समाधान ०.०१ M फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) और ddH2हे.
  2. PSiO2 नमूना के शीर्ष पर लोड हो रहा है समाधान के ५२ µ एल जोड़ें और एक छाया हुआ पकवान में आरटी पर 2 एच के लिए मशीन ।
    नोट: डिश में उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए गर्मी के दौरान समाधान के सूखने को रोकने के लिए ।
  3. PSiO2 वाहक के भीतर NGF सामग्री के बाद ठहराव के लिए नमूने के शीर्ष पर समाधान इकट्ठा ।
    नोट: NGF PSiO2 में लोड करने का इरादा उपयोग करने से पहले तुरंत किया जाना चाहिए, प्रोटोकॉल के सूखने और प्रोटीन के विकार के जोखिम के कारण यहां नहीं रुका जा सकता है ।

3. NGF एलिसा द्वारा NGF लोडिंग का ठहराव

  1. एलिसा प्लेट तैयार करने के लिए, ०.५ µ जी के १०० µ एल जोड़ें/एमएल कैप्चर एंटीबॉडी (खरगोश विरोधी hβ-NGF) एक अच्छी तरह से, थाली सील और आरटी पर रात भर गर्मी ।
  2. महाप्राण कुओं को तरल हटाने और प्लेट धो चार बार धोने बफर के ३०० µ एल का उपयोग कर (०.०५% के बीच-पंजाब में 20) प्रति अच्छा है; पिछले धोने के बाद प्लेट एक कागज तौलिया पर अवशिष्ट बफर और दाग को हटाने के लिए उलटा ।
  3. ब्लॉक बफर के ३०० µ एल जोड़ें (1% पंजाब में सीरम एल्ब्युमिन (BSA)) के लिए एक अच्छी तरह से और आर टी पर कम से 1 ज के लिए गर्मी । इसके बाद महाप्राण और प्लेट को चार बार धो लें जैसा कि स्टेप ३.२ में बताया गया है ।
  4. एक अंशांकन वक्र तैयार करने के लिए, NGF लोड हो रहा है समाधान (२.१ कदम देखें) मंदक (०.०५% के बीच-20, पंजाब में ०.१% BSA) 1 एनजी/ तो 2-1 एनजी/एमएल से शूंय करने के लिए अंशांकन वक्र नमूने प्राप्त करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन ।
  5. नमूनों को तैयार करने के लिए, NGF लोड हो रहा है समाधान (से चरण २.१) और एकत्र पोस्ट-लोडिंग समाधान (२.३ से कदम से) मंदक 1:100000 और 1:10000 क्रमशः, उपयोग में एलिसा किट की सांद्रता रेंज तक पहुंचने के लिए (16-1000 pg/एमएल) ।
  6. पतला नमूनों और अंशांकन वक्र नमूने के १०० µ एल जोड़ें तपसिल में एक अच्छी तरह से और 2 एच के लिए आरटी पर मशीन; इसके बाद महाप्राण और प्लेट को चार बार धो लें जैसा कि स्टेप ३.२ में बताया गया है ।
  7. जोड़ें १०० µ एल के 1 µ g/एमएल डिटेक्शन एंटीबॉडी (biotinylated खरगोश विरोधी hβ-NGF) के लिए एक अच्छी तरह से और आरटी पर 2 एच के लिए मशीन । इसके बाद महाप्राण और प्लेट को चार बार धो लें जैसा कि स्टेप ३.२ में बताया गया है ।
  8. पतला Avidin-सहिजन Peroxidase (एचआरपी) 1:2000 मंदक में, जोड़ें १०० µ एल अच्छी तरह से और आर टी पर 30 मिनट के लिए मशीन । अब महाप्राण और थाली धो चार बार के रूप में ३.२ चरण में वर्णित है ।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से और रंग विकास के लिए आरटी में 25 मिनट की मशीन के लिए सब्सट्रेट समाधान के १०० µ एल जोड़ें । एक microplate रीडर का उपयोग कर ६५० एनएम पर सेट तरंग दैर्ध्य सुधार के साथ ४०५ एनएम पर अवशोषक उपाय ।
  10. दोनों लोडिंग समाधान और एकत्र पोस्ट लोडिंग अंशांकन वक्र पर आधारित समाधान में NGF एकाग्रता का निर्धारण ।
  11. NGF मास PSiO2 वाहक के भीतर भरी हुई गणना करने के लिए, एकत्र पोस्ट में NGF मास घटाना समाधान लदान में NGF मास से समाधान लोड हो रहा है । NGF लोड हो रहा है प्रभावकारिता निम्न समीकरण द्वारा परिकलित की जाती है:
    Equation

4. इन विट्रो NGF PSiO2 से रिलीज

  1. NGF-०.०१ एम पंजाबियों के 2 मिलीलीटर में 1% (डब्ल्यू/वी) BSA और ०.०२% (डब्ल्यू/वी) सोडियम azide में ३७ डिग्री सेल्सियस और १०० rpm के कक्षीय आंदोलन के तहत में PSiO2 वाहक भरी मशीन ।
  2. हर 2 दिन समाधान इकट्ठा और यह ताजा पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें । तरल नाइट्रोजन में एकत्र रिलीज के नमूने फ्रीज और अधिक विश्लेषण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध NGF एलिसा परख का प्रयोग करें रिलीज नमूनों में NGF सामग्री यों तो 3.1-3.9 चरणों में वर्णित है ।
    नोट: एलिसा ठहराव के लिए जारी नमूनों की तैयारी करते समय, विभिंन कमजोरियां रिलीज अवधि के साथ अलग समय अंक के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए (यानी, पहले समय अंक बहुत अधिक बाद में समय अंक से पतला किया जाना चाहिए) । इसके अलावा, प्रत्येक रिलीज के नमूने के लिए, कम से कम दो अलग कमजोर पड़ने प्रदर्शन किया जाना चाहिए और एलिसा किट की सांद्रता रेंज तक पहुंचने सुनिश्चित करने के लिए quantified ।
  4. निर्धारित अंशांकन वक्र के आधार पर जारी नमूनों में NGF एकाग्रता और समय के साथ जमा NGF जारी की एक ग्राफ साजिश ।

5. ठहराव इन विट्रो Si कटाव द्वारा Inductively युग्मित प्लाज्मा परमाणु उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-एईएस)

  1. 1 मिलीलीटर के रिलीज के नमूने 1:10 जारी बफर में (०.०१ एम पंजाबियों 1% (डब्ल्यू/वी) BSA और ०.०२% (डब्ल्यू/वी) सोडियम azide) 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए पतला ।
  2. पतला नमूनों के लिए २१२.४, २५१.६ और २८८.२ एनएम पर एसआई परमाणु उत्सर्जन चोटियों पर नजर रखें ।
  3. एक अंशांकन वक्र के आधार पर नमूनों में एसआई एकाग्रता का निर्धारण ।
  4. एसआई क्षरण प्रोफ़ाइल स्थापित करने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु पर (यानी, रिलीज की अवधि के साथ संचई si सामग्री) वाहक की कुल Si सामग्री का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त si सामग्री ।
    नोट: वाहक के कुल si सामग्री की सटीक ठहराव सुनिश्चित करने के लिए, रिलीज के नमूने रिलीज अध्ययन के अंत बिंदु के बाद 1 महीने के नमूने और आईसीपी-एईएस का उपयोग एसआई एकाग्रता के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. रिलीज़ अवधि के साथ संचई si सामग्री संक्षेप और si सामग्री पोस्ट-रिलीज़ नमूनों में si सामग्री का १००% प्रदान करता है ।

6. कोशिका व्यवहार्यता और NGF की उपस्थिति में वृद्धि-भरी Psio2 वाहक

  1. मूषक फियोक्रोमोसाइटोमा (PC12) कोशिका संस्कृति
    1. 10% हार्स सीरम (एच एस), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% L-glutamine, 1% पेनिसिलिन streptomycin और ०.२% amphotericin को Roselle पार्क आयुर्विज्ञान संस्थान (RPMI) माध्यम से जोड़कर बुनियादी विकास माध्यम तैयार करें.
    2. 1% HS, 1% L-glutamine, 1% पेनिसिलिन streptomycin और ०.२% amphotericin को RPMI माध्यम से जोड़कर विभेदक मध्यम तैयार करें ।
    3. एक ७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी में 8 दिनों के लिए बुनियादी विकास के माध्यम से 10 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन (106 कोशिकाओं) बढ़ाएँ; हर 2 दिन कुप्पी के लिए बुनियादी विकास मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. विभेदित PC12 कोशिका संस्कृति उत्पन्न करने के लिए, सेल सस्पेंशन को एक केंद्रापसारक ट्यूब पर ट्रांसफर करें; २०० x जी और आर टी पर 8 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक supernatant त्यागें ।
    5. ताजा बुनियादी विकास मध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित और फिर से २०० x g और RT पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को केंद्रापसारक; supernatant त्यागें और बुनियादी विकास माध्यम के 3 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
    6. कक्ष क्लस्टर अलग करने के लिए, एक 23 G सिरिंज का उपयोग कर दस बार कक्षों महाप्राण ।
    7. एक hemocytometer सेल काउंटर और बीज का उपयोग कर कोशिकाओं गणना 104 कोशिकाओं/cm2 कोलेजन प्रकार पर कार्य क्षेत्र विभेदक मध्यम की उपस्थिति में लेपित प्लेटें ।
    8. 24 घंटे के बाद, जोड़ें ताजा murine β-NGF (५० एनजी/एमएल) या प्लेट प्रति NGF भरी PSiO2 वाहक ।
      नोट: उच्च NGF सांद्रता (> 50 एनजी/एमएल) निर्दिष्ट एकाग्रता के रूप में सटीक प्रभाव के अधिकारी ।
    9. भिंनता मध्यम हर 2 दिन नवीनीकृत ।
    10. कक्ष व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए, 10% (v/v) की व्यवहार्यता संकेतक समाधान (resazurin-आधारित) प्रतिनिधि समय बिंदुओं पर जोड़ें और ३७ ° c पर 5 h के लिए मशीन; एक spectrophotometer का उपयोग ४९० एनएम पर अवशोषक उपाय ।
  2. चूहों पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) सेल संस्कृति
    1. दो 7 सप्ताह पुराने C57bl चूहों से DRGs को अलग करने के लिए, पहले ७०% इथेनॉल के साथ चूहों douse और त्वचा को हटाने के लिए एक चीरा बनाने.
    2. रीढ़ की हड्डी के सामने आने तक खोपड़ी और उदर की दीवार की मांसपेशियों का आधार काटें ।
    3. femurs के स्तर पर एक कट बनाने और आसपास के ऊतकों को साफ करके स्पाइनल कॉलम को हटा दें ।
    4. कॉलम को तीन टुकड़ों में काटें; फिर midline में प्रत्येक टुकड़ा में कटौती करने के लिए दो हिस्सों उत्पन्न और रीढ़ की हड्डी को छील ।
    5. दूरबीन के तहत, सभी डीआरजी गैंग्लिया निकालने और उंहें एक ठंडी हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) में विसर्जित कर दिया ।
    6. एक पेट्री डिश पर DRGs को pining करके आसपास के संयोजी ऊतकों को साफ करें और दूरबीन के नीचे अवशिष्ट मेनिन्जेस को धीरे से निकालें ।
    7. अलग कर देना डीआरजी कोशिकाओं के लिए उंहें papain के १,००० यू में 20 मिनट के लिए मशीन द्वारा ।
    8. ४०० x gपर 4 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक supernatant त्यागें और सेल गोली रखो ।
    9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक 10 मिलीग्राम/एमएल collagenase और 12 मिलीग्राम/एमएल dispase-II समाधान और मशीन में गोली resuspend ।
    10. ४०० x gपर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक; supernatant त्यागें और सेल गोली रखो ।
    11. HBSS, 10 मिमी ग्लूकोज और 5 मिमी HEPES (पीएच ७.३५) के 1 मिलीलीटर में सेल गोली Triturate एक कसना पाश्चर पिपेट के माध्यम से दोहराया बीतने से ।
    12. धीरे असंबद्ध कोशिकाओं एल के लिए जोड़-15 मध्यम घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा सेल जुदाई के लिए सिलिका आधारित कोलाइडयन माध्यम के 20% से युक्त; १,००० x जीमें 8 मिनट के लिए केंद्रापसारक महाप्राण supernatant और सेल गोली रखो ।
      नोट: इस चरण का उद्देश्य axonal मलबे, Schwann कोशिकाओं और fibroblasts से न्यूरॉन कोशिकाओं को अलग और शुद्ध करना है ।
    13. एफ 12 मध्यम के 2 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend; १,००० x g पर 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक; supernatant त्यागें और एफ के 1 मिलीलीटर-12 मध्यम में गोली पुनः स्थगित ।
    14. कोशिकाओं और बीज गिनती 2 × 104 पाली-L-lysine और laminin लेपित ग्लास नीचे ३५ mm संस्कृति व्यंजन पर कोशिकाओं, एक एफ में 12 एंटीबायोटिक मुक्त मध्यम 10% FBS के साथ पूरक ।
      नोट: शुरू में, बीज मध्यम (150-200 µ एल) की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं; ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच मशीन के बाद, 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए माध्यम जोड़ें ।
    15. धीरे NGF-लोड PSiO2 वाहक या ताजा murine β-NGF प्लेट प्रति (५० एनजी/एमएल) जोड़ें ।
    16. 2 दिनों के बाद, यह आरटी पर 15 मिनट के लिए एक 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान के साथ मशीन द्वारा सेल संस्कृति को ठीक; immunostain सेल संस्कृति एक आम इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रक्रिया31का उपयोग कर ।
    17. छवि ंयूरॉन कोशिका एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संस्कृति ।

7. कोशिका विभेद विश्लेषण

  1. PC12 कोशिकाओं NGF-भरी PSiO2 वाहकों की उपस्थिति में भिंनता प्रतिशत
    1. NGF-एक humidified मशीन में ३७ ° c 5% सह2युक्त में, विभेदक मध्यम के 2 मिलीलीटर में PSiO2 वाहक भरी हुई मशीन ।
    2. हर 2 दिन, समाधान इकट्ठा और यह ताजा माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ बदल जाते हैं । तरल नाइट्रोजन में एकत्र रिलीज के नमूने फ्रीज और अधिक विश्लेषण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    3. 12 में बीज PC12 कोशिकाओं-अच्छी तरह से कोलेजन-लेपित प्लेटों के रूप में ४.१ धारा में निर्देश दिया (4.1.3-4.1.6) ।
    4. 24 घंटे के बाद, प्रतिनिधि समय अंक (धारा 5.1.2 से) के जारी नमूनों को विभिन्न कुओं से परिचय; नियंत्रण कुओं के लिए, जोड़ें ताजा murine β-NGF (५० एनजी/
    5. 24 घंटे के बाद, छवि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं ।
    6. neurite-असर कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए, मैन्युअल रूप से कोशिकाओं है कि छवियों में कोशिकाओं की कुल संख्या से बाहर हो गया था गणना (n = 5 प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए फ्रेम); समय के साथ neurite वृद्धि के साथ PC12 कोशिकाओं के प्रतिशत का ग्राफ प्लाट ।
      नोट: विभेदित PC12 कोशिकाओं neurites बिना गोल संरचना है दिखाई दिया, जबकि विभेदित कोशिकाओं neurites की वृद्धि (सेल सोमा व्यास के बराबर ंयूनतम लंबाई में से एक) या रूपात्मक परिवर्तन के द्वारा पहचाना जा सकता है ।
  2. विभेदित PC12 कोशिकाओं का Morphometric विश्लेषण
    1. छवि प्रसंस्करण विश्लेषण के लिए, NGF के साथ उपचार के बाद 3 दिनों के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं के चरण छवियों को प्राप्त (नि: शुल्क एजेंट के रूप में या NGF के रिलीज उत्पाद के रूप में PSiO2 वाहक लोड).
      नोट: पर बाद में समय अंक (5 दिन से परे) कोशिकाओं को अत्यधिक जटिल नेटवर्क का विकास, एक एकल सेल संकल्प पर morphometric माप को रोकने.
    2. छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम NeuronJ, एक ImageJ प्लग में है, जो एक अर्द्ध स्वचालित neurite अनुरेखण और लंबाई मापने सक्षम बनाता डाउनलोड करें ।
    3. छवि को एक 8 बिट प्रारूप में परिवर्तित और माप पिक्सेल माइक्रोमीटर अनुपात के लिए छवि स्केल बार का उपयोग कर ।
    4. सेट पैमाने पर विश्लेषण का उपयोग कर । स्केल आदेश सेट और प्रत्येक neurite की लंबाई को मापने ।
    5. मैन्युअल रूप से बंटी अंक की संख्या और प्रत्येक कोशिका सोमा से उद्भव neurites की संख्या की गणना.
      नोट: एक औसत neurite लंबाई 1 दिन NGF उपचार के बाद लगभग 30 µm है । मापा neurite लंबाई व्यापक रूप से वितरित किया जा सकता है ।

Representative Results

ऑक्सीकरण साई फिल्मों के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित गढ़े हैं । एसआई वेफर २५० mA/cm2 में 20 एस के लिए विद्युत नक़्क़ाशी के अधीन है (चित्रा 1ai), ८०० डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1aii) पर थर्मल ऑक्सीकरण के बाद एक PSiO2 पाड़ का उत्पादन । परिणामस्वरूप PSiO2 फिल्म के उच्च संकल्प स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (HR-SEM) छवियों चित्रा 1b, सी में दिखाए जाते हैं । फिल्म के शीर्ष देखें micrograph (आंकड़ा 1b) व्यास में लगभग ४० एनएम के pores के साथ अपने अत्यधिक असुरक्षित प्रकृति को दर्शाया गया है । क्रॉस-एक सट फिल्म के अनुभागीय micrograph (चित्रा 1c) २.९ µm की एक छिद्रित परत मोटाई, परस्पर बेलनाकार pores की विशेषता का पता चलता है ।

PSiO2 फिल्मों NGF लोड हो रहा है समाधान के रूप में चित्र 1aiiiमें सचित्र के साथ लोड कर रहे हैं । NGF लोडिंग से पहले और PSiO2 फिल्मों के साथ मशीन के बाद लोडिंग समाधान में NGF सांद्रता को मापने के द्वारा NGF एलिसा का उपयोग quantified है । PSiO2 फिल्म प्रति भरी हुई NGF का औसत द्रव्यमान २.८ ± ०.२ µ g के रूप में निर्धारित किया गया है, जो ९०% (w/w) की एक उच्च लोडिंग प्रभावकारिता से मेल खाती है (डेटा31नहीं दिखाया गया है) । आदेश में PSiO2 वाहक से NGF रिलीज प्रोफ़ाइल स्थापित करने के लिए, भरी हुई फिल्मों ३७ डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में मशीन और हर 2 दिन aliquots NGF एलिसा का उपयोग जारी प्रोटीन एकाग्रता के ठहराव के लिए नमूने हैं । इसके अलावा, जारी नमूनों में si सामग्री आईसीपी-एईएस का उपयोग quantified है और PSiO2 वाहकों के एसआई कटाव कैनेटीक्स की स्थापना की जाती है । चित्रा 2 NGF रिलीज और असुरक्षित वाहक के इसी एसआई गिरावट प्रोफाइल दर्शाया गया है । NGF के एक निरंतर रिलीज, फट प्रभाव के बिना, 1 महीने की अवधि के लिए प्राप्त है । पहले सप्ताह में रिलीज NGF तेजी से (ढलान = ०.४४२) रिलीज की अवधि (ढलान ०.०४३) के साथ बाद के दिनों में एक बहुत धीमी रिहाई की तुलना में है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पूरे 1 महीने के रिलीज की अवधि के दौरान, NGF जारी की मात्रा PC12 कोशिकाओं के गहन भेदभाव उत्प्रेरण के लिए पर्याप्त है, के रूप में बाद में चर्चा की जाएगी । संचित NGF जारी एक अच्छा संबंध में (आर2 = ०.९७१) शेष Si सामग्री के साथ, के रूप में चित्रा 2के इनसेट में दिखाया गया है पाया जाता है ।

अगले, NGF-भरी PSiO2 वाहकों की, इन विट्रो मेंविशेषता है, PC12 कोशिकाओं और डीआरजी न्यूरॉन्स ंयूरॉन भेदभाव और वृद्धि के लिए मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है । PC12 कोशिकाओं और असंबद्ध डीआरजी ंयूरॉंस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । सबसे पहले, PSiO2 वाहकों की उपस्थिति में सेल व्यवहार्यता साफ (लोड नहीं) या NGF-PSiO2भरी हुई के साथ कोशिकाओं की मशीन द्वारा जांच की है; नियंत्रण प्लेटें और साफ PSiO2 के साथ इलाज कोशिकाओं हर 2 दिन मुफ्त NGF के साथ पूरक हैं । कोई cytotoxicity साफ या NGF-PSiO2 वाहक (3 ए आंकड़ा) लोड करने के लिए कोशिकाओं के जोखिम पर मनाया जाता है, का प्रदर्शन है कि2 PSiO इस सेल लाइन के साथ संगत है । चित्र 3 बी NGF-भरी PSiO2 वाहक के साथ इलाज PC12 कोशिकाओं के प्रतिनिधि मानव संसाधन SEM माइक्रोग्राफ से पता चलता है । मनाया कोशिकाओं को निकालने neurites और फार्म का विशेषता ंयूरॉंस नेटवर्क शाखाओं । इसी तरह के परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब NGF-भरी PSiO2 वाहकों की उपस्थिति में असंबद्ध डीआरजी न्यूरॉनिंग कोशिकाओं सीडिंग. immunostained डीआरजी NGF-भरी PSiO2 वाहक (चित्रा 3e) के साथ प्रसंस्कृत कोशिकाओं के फोकल छवियां एक व्यापक neurite दीक्षा और बढ़ाव, सकारात्मक नियंत्रण के समान दिखाने के लिए (यानी, न्यूरॉन्स मुफ्त के साथ पूरक NGF, चित्र 3dदेखें), जबकि नकारात्मक नियंत्रण (यानी, अनुपचारित न्यूरॉन्स, चित्रा 3सी देखें), neurite के एक गरीब हद तक प्रदर्शित करता है ।

PSiO2 वाहकों से जारी NGF की उपस्थिति में PC12 कोशिकाओं भेदभाव प्रतिशत का मूल्यांकन करने के लिए, भेदभाव कुल सेल जनसंख्या से बाहर neurite बाहर निकलने के साथ कोशिकाओं की गिनती से quantified है । आरेख 4 एक 26-दिन की अवधि में भिन्न समय बिंदुओं पर विभेदित कक्षों के प्रतिशत के संदर्भ में परिणामों को सारांशित करता है. महत्वपूर्ण अंतर प्रतिशत मूल्यों का अध्ययन अवधि भर में प्राप्त कर रहे हैं । विशेष रूप से, 26 दिनों के बाद, जारी NGF ५०% से ऊपर के भेदभाव प्रेरित किया है, एक भेदभाव प्रतिशत जो बहुलक के साथ पिछले अध्ययनों की तुलना में काफी अधिक है आधारित वाहक16। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि NGF छिद्रित मेजबान के भीतर फंसाने ~ 1 महीने की अवधि के लिए गहन भेदभाव उत्प्रेरण के लिए प्रोटीन की जैविक गतिविधि संरक्षित ।

आगे NGF के प्रभाव की जांच करने के लिए-PSiO2 वाहकों पर ंयूरॉन भेदभाव, विभेदित PC12 कोशिकाओं के तीन विशेषता रूपात्मक मानकों को एकल कोशिका स्तर पर मापा जाता है: (i) सोमा से neurites निकालने की संख्या ( ii) कुल neurites ' लंबाई और (iii) बंटी अंक की संख्या । कोशिकाओं NGF-लोड PSiO2 वाहक के साथ या मुक्त NGF के दोहराव प्रशासन के साथ इलाज कर रहे है (हर 2 दिन), एक नियंत्रण के रूप में । चित्र 5 ए -c दिन 1 और 3 में सेल जनसंख्या के morphometric विश्लेषण प्रस्तुत करता है । PC12 कोशिकाओं NGF-लोड PSiO2 शो morphometric मूल्यों जो सभी तीन परीक्षण मापदंडों के लिए नियंत्रण उपचार के समान है के साथ इलाज किया । 3 दिनों के बाद, सभी रूपात्मक पैरामीटर के मूल्यों दोनों NGF लोड PSiO2 वाहक और मुक्त NGF के दोहराव प्रशासन के नियंत्रण उपचार के लिए एक ही दर पर वृद्धि करने के लिए मनाया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: PSiO2 फिल्मों का निर्माण । (क) PSiO2 वाहकों की निर्माण योजना: (i) सिलिकॉन वेफर २५० mA/सेमी2में 20 एस के लिए नक़्क़ाशी विद्युत के अधीन है, (ii) ८०० डिग्री सेल्सियस पर थर्मल ऑक्सीकरण के बाद एक PSiO2 पाड़ का उत्पादन करने के लिए, और (iii) NGF लोड हो रहा है द्वारा भौतिक सोखना (योजनाबद्ध पैमाने के लिए तैयार नहीं हैं) । (बी-सी) शीर्ष देखें और पार अनुभाग एक विशेषता PSiO2 फिल्म के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: NGF जारी है और NGF के एसआई कटाव प्रोफाइल-PSiO2 वाहक भरी हुई । PSiO2 वाहक के क्षरण की हद तक छिद्रित फिल्म के कुल si सामग्री के बाहर हर समय बिंदु पर शेष Si सामग्री के अंश के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । इनसेट जमा NGF जारी की और शेष Si सामग्री के बीच सहसंबंध दिखाता है । त्रुटि पट्टियां SD, n = 3 का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल व्यवहार्यता और NGF की उपस्थिति में वृद्धि-PSiO2 वाहक लोड । (क) इन विट्रो cytotoxicity लक्षण वर्णन । PC12 कोशिकाओं व्यवहार्यता पर मापा जाता है 1, 3 और 7 दिन साफ करने के लिए अपने जोखिम के बाद (भरी हुई नहीं) PSiO2 वाहक, NGF-PSiO2 वाहक या नि: शुल्क NGF (५० एनजी/एमएल हर 2 दिन, नियंत्रण प्लेट) । (ख) PC12 कोशिकाओं का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ 9 दिनों के लिए NGF-लोडेड PSiO2 वाहक के साथ कल्चर्ड । बायां पैनल: ज़ूम-इन, सेल सोमा से neurite का चित्रण; दायां पैनल: एक ज़ूम आउट, उच्च जटिल ंयूरॉंस नेटवर्क का गठन का संकेत है । (सी-ई) immunostained डीआरजी ंयूरॉन कोशिका संस्कृति के फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां (बोने के बाद 2 दिन): () अनुपचारित कोशिकाओं; () कोशिकाओं के साथ पूरक मुक्त NGF (५० एनजी/ () NGF-PSiO वाहक. neurofilament ज के Immunofluorescent धुंधलान सेल सोमा की इमेजिंग और neurites को तबदील करने में सक्षम बनाता है । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्र 4: प्रतिनिधि समय बिंदुओं पर NGF-लोडेड PSiO2 वाहकों से जारी NGF के प्रदर्शन पर PC12 कक्ष भिंनता प्रतिशत मान । भिंनता प्रतिशत neurite के साथ कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त की है कुल सेल जनसंख्या से बाहर । नियंत्रण उपचार मुक्त NGF (५० एनजी/एमएल) के साथ पूरक कोशिकाओं को संदर्भित करता है । अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों x-अक्ष के साथ चित्रित कर रहे हैं; स्केल बार = 25 दिनों के माइक्रोग्राफ के लिए µm 2, 8, 14, 26 और ५० µm के लिए नियंत्रण micrograph । त्रुटि पट्टियां SD, n = 3 का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: विभेदित PC12 कोशिकाओं का Morphometric विश्लेषण । विभेदित PC12 कोशिकाओं के तीन रूपात्मक पैरामीटर मापा जाता है, एक सेल स्तर पर, दिन में 1 और 3 NGF-भरी PSiO2 वाहक या मुक्त NGF के दोहराव प्रशासन हर 2 दिन (नियंत्रण) के लिए जोखिम निम्नलिखित; () कुल neurites ' लंबाई () कक्ष सोमा से neurites निकालने की संख्या और () शाखाकरण बिंदुओं की संख्या. त्रुटि पट्टियां SD, n = 3 का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

ह्रास नैनोसंरचित PSiO2 फिल्में गढ़े और NGF के लिए वाहक के रूप में कार्यरत हैं, इसकी सतत और लंबे समय तक जारी करने के लिए अनुमति देता है, whilst अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखने । PSiO2 की क्षमता NGF के लिए एक वितरण प्रणाली के रूप में सेवा करने के लिए पर्याप्त NGF खुराक के लिए न्यूरॉन विभेद पैदा करने और PC12 कोशिकाओं और डीआरजी न्यूरॉन्स की वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए जारी करने की क्षमता का प्रदर्शन करके इन विट्रो में प्रदर्शन किया है. इंजीनियर फिल्मों vivo मेंभविष्य के इलाज के लिए NGF के दीर्घकालिक जलाशयों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

गढ़े साई फिल्मों के संरचनात्मक गुण विशेष रूप से NGF पेलोड के लिए सिलवाया रहे थे; विद्युत नक़्क़ाशी प्रक्रिया के वर्तमान घनत्व के लिए लगभग ४० एनएम कि आसानी से NGF, २६.५ केडीए३२ के एक आणविक वजन के साथ एक प्रोटीन को समायोजित करेगा और ~ 4 एनएम३३की एक विशेषता व्यास के ताकना आकार प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था, भीतर छिद्रित मैट्रिक्स । इसके अलावा, असुरक्षित पाड़ के थर्मल ऑक्सीकरण नकारात्मक आरोप लगाया ऑक्सीकरण साई की सतह के लिए सकारात्मक आरोप लगाया प्रोटीन के इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण द्वारा NGF के शारीरिक सोखना सक्षम करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । साई की सतह रसायन लोड हो रहा है प्रभावकारिता पर एक बड़ा प्रभाव डालती है और आसानी से करने के लिए बेहतर पेलोड और छिद्रित मैट्रिक्स के बीच बातचीत को नियंत्रित करने के लिए देखते हो सकता है । इन बातचीत के बाद adsorbed प्रोटीन अणुओं की संरचना हुक्म और उनके३४,३५,३६। अंत में, प्रणाली को ध्यान से उपयुक्त ताकना आकार, सतह विशेषताओं और आदर्श लोडिंग विलायक और उल्लेख किया मापदंडों के परिणामस्वरूप प्रभाव का चयन करके NGF के इष्टतम लदान प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया था प्रोटीन लोडिंग हुक्म प्रभावकारिता. इसलिए, निर्माण मापदंडों में कोई परिवर्तन (जैसे, वर्तमान घनत्व, नक़्क़ाशी समय, प्रकार और dopant या इलेक्ट्रोलाइट की एकाग्रता), सतह रसायन विज्ञान या लोड समाधान संरचना लदान प्रभावकारिता और जैव गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं लोड प्रोटीन ।

साई orPSiO2मेजबान से एक पेलोड के रिलीज दर आम तौर पर दो एक साथ तंत्र का एक संयोजन, बाहर पेलोड अणुओं के प्रसार और Si पाड़३७के क्षरण द्वारा तय है । कटाव और बाद में विघटन दर आरोपण स्थल, उसकी विकृति और रोग राज्य28,३८,३९से प्रभावित हैं । यह पिछले काम में स्थापित किया गया था कि अगर एक अलग रिलीज दर एक निश्चित चिकित्सकीय आवेदन के लिए आवश्यक है, रिलीज प्रोफ़ाइल और संशोधित किया जा सकता है साई की सतह३८,४०की सतह रसायन विज्ञान बदल कर लंबे समय तक, ४१. इस तरह के थर्मल ऑक्सीकरण, थर्मल जलकर और hydrosilylation तकनीक के रूप में विभिंन रासायनिक संशोधनों, साई की सतह को स्थिर और इसके क्षरण और फलस्वरूप पेलोड रिलीज३५,४२ को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है ,४३,४४,४५. इसके अलावा, विभिंन सतह रसायन शास्त्र मार्गों के माध्यम से एसआई पाड़ को प्रोटीन अणुओं के आबंध लगाव द्वारा वाहक में NGF की लोडिंग एक अधिक लंबे समय तक जारी है क्योंकि पेलोड ही जारी किया है जब आबंध बांड या टूट रहे है के माध्यम से होना चाहिए सहायक एसआई मैट्रिक्स21अपमानित है ।

इसके अलावा, इसके निर्माण की प्रक्रिया के बाद, साई ऐसी microparticles४६, नैनोकणों४७ या मुक्त खड़े झिल्ली26, जो भी वाहक के रूप में नियोजित किया जा सकता है के रूप में पतली फिल्मों, के अलावा विभिंन विंयास में प्रदान किया जा सकता है NGF के लिए और विशिष्ट आवेदन की जरूरत को पूरा ।

नैदानिक रूप से प्रासंगिक होने के लिए, PSiO2 वाहकों के भीतर NGF सामग्री चिकित्सकीय खुराक की सीमा तक पहुंच जाना चाहिए । प्रोटोकॉल में वर्णित विधि में, NGF-PSiO लोड2 वाहक सेल मीडिया या पंजाबियों बफर के 2 मिलीलीटर की एक सुसंगत मात्रा में पेश कर रहे है और इस प्रकार, लदान समाधान और संबंधित NGF मास लोड की एकाग्रता के लिए एक उपज समायोजित किया गया जारी NGF एकाग्रता है कि इन विट्रो प्रणाली में परीक्षण के लिए प्रासंगिक है । जब विभिंन प्रणालियों के लिए इस विधि का उपयोग, जैसे कि पूर्व vivo या vivo वातावरण में , NGF लोडिंग समाधान की एकाग्रता और वृद्धि की जरूरत खुराक के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, उच्च NGF सामग्री का परीक्षण क्षेत्र के अनुसार या PSiO2 नमूनों के बड़े क्षेत्रों का उपयोग करके कई वाहक शुरू द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।

इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रिलीज की अवधि के साथ बाद में समय अंक में, जारी NGF सांद्रता पहले के समय अंक की तुलना में बहुत कम हैं । तथ्य यह है कि NGF प्रवाह समय पर स्थिर नहीं है ध्यान में रखा जाना चाहिए जब आवेदन की जरूरत के अनुसार प्रणाली डिजाइनिंग ।

कई NGF वितरण प्रणालियों विकसित किया गया है और साहित्य में रिपोर्ट, उनमें से ज्यादातर बहुलक आधारित प्रणालियों रहे हैं, सिंथेटिक या प्राकृतिक बहुलक conjugates के शामिल10,11,12,15 , 16 , 17. इन प्रणालियों प्रभावी निरंतर रिलीज प्रोफाइल दिखाया है, तथापि, रिलीज की अवधि के एक महत्वपूर्ण फट प्रभाव के साथ कई दिनों की अवधि में फैले । इन वितरण प्लेटफार्मों के कुछ इस तरह के encapsulation प्रक्रिया पर गैर गतिविधि के नुकसान के रूप में महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त हैं, अलग स्थिर एजेंटों18,४८के उपयोग की आवश्यकता है, साथ ही परिष्कृत और जटिल निर्माण तकनीक16। प्रोटीन के लिए वितरण प्रणालियों को डिजाइन करने में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक वाहक प्रणाली के भीतर फंसाने पर अणुओं की गतिविधियों को बनाए रखने की क्षमता है । प्रोटीन या पेप्टाइड्स PSiO2 RT पर या यहां तक कि कम तापमान पर मजबूत कार्बनिक सॉल्वैंट्स, जो दोनों महत्वपूर्ण कारक है जब इन संवेदनशील जैव अणुओं लोड हो रहा है का उपयोग कर के बिना लोड किया जा सकता है । पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि साई/PSiO2 भूतल रसायन विज्ञान३५,३६भरी हुई प्रोटीन की संभव विकार को कम करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, PSi/PSiO2 सामान्य और विशेष रूप से NGF में वृद्धि कारकों के लिए वितरण प्रणालियों के विकास के लिए एक लाभप्रद nanomaterial है ।

वर्तमान काम neurodegenerative रोगों के संभावित उपचार के लिए सीएनएस में NGF के प्रत्यक्ष प्रशासन के लिए एक नया चिकित्सकीय दृष्टिकोण के रूप में इस विधि के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है । NGF-लोडेड PSiO2 वाहकों को चूहों के दिमाग में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और लंबे समय तक प्रत्यारोपण के रूप में प्लेटफार्म की प्रभावकारिता वीवो मेंपढ़ाई जाती है । इसके अलावा, गैर इनवेसिव biolistics४९,५० के साथ इस होनहार वाहकों के संयोजन के लिए एक NGF-लोड PSiO2 एक स्थानीयकृत क्षेत्र के लिए एक उच्च स्थानिक संकल्प में कणों के एक उपंयास वायवीय का उपयोग कर प्रशासन को सक्षम कर सकते है neurodegenerative विकारों के इलाज के लिए केशिका बंदूक, जहां एक spatiotemporal दवा प्रशासन की आवश्यकता है । इसके अलावा, NGF एक रासायनिक ढाल तरीके५१, axon मार्गदर्शन अणुओं के समान में ंयूरॉन विकास प्रत्यक्ष कर सकते हैं । इस प्रकार, लोड PSiO2 वाहक NGF के लिए आकर्षित गर्म स्थानों के रूप में सेवा कर सकते हैं, प्रत्यक्ष विकास के लिए, अंय निर्देशन cues५२,५३के लिए पूरक । इसके अलावा, PSiO2वाहक विशेष रूप से आगे ट्यूनिंग PSiO2 nanostructure और इसकी सतह रसायन विज्ञान द्वारा कई महीनों तक की एक बहुत विस्तारित समय अवधि के लिए NGF की डिलीवरी बनाए रखने के लिए सिलवाया जा सकता है ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

एमएस और ES कोर सेवाओं और लॉरी मैं जीवन विज्ञान और इंजीनियरिंग और रसेल Berrie नैनो संस्थान के Technion में वित्तीय सहायता के लिए Lokey केंद्र से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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