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Bioengineering

神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

ここでは、デザインし、神経成長因子 (NGF) の分解性キャリアとしてポーラス シリコン (PSi) 膜のナノ構造を作製するためのプロトコルを提案する.神経分化・ PC12 細胞およびマウス後根神経節 (DRG) ニューロンの伸長は PSi の NGF ロード キャリアと特徴付けられます。

Abstract

偉大な可能性にもかかわらず NGF の神経変性疾患の治療のため、その治療的投与はタンパク質化学的性質のため、血液脳関門を通過しないと重要な挑戦を表すし、長期を必要と生物学的効果を持っている脳へ配信。この作品では、このタンパク質の機密性の高い持続的なデリバリーに NGF の分解性キャリアとしてナノ構造 PSi 薄膜の作製について説明します。PSi のキャリアはその生物学的活性を維持しながら、4 週間の期間の高荷重効果および NGF の連続リリースを入手に合わせて。NGF 配信システムとして NGF PSi キャリアの動作は、神経細胞の分化と解離 DRG ニューロンと PC12 細胞の伸長を誘発する能力を調べることによって生体外で調査です。きちんとした、NGF ロードの PSi キャリアの存在下での細胞生存率が評価されます。PSi のキャリアからリリースされた NGF の生理活性は、反復的な無料 NGF 行政の従来の治療法と比較されます。PC12 細胞分化を分析し、差別化されたセルの 3 種類の形態学的パラメーターの測定によって特徴づけられる(i) (ii) の合計の突起の長さ、(iii) 分岐ポイントの数、相馬から抽出神経突起の数。PC12 細胞の NGF PSi キャリアで治療はリリース期間中の深遠な分化を示しています。また、NGF PSi キャリアと培養後根神経節神経細胞は、繰り返し無料 NGF 政権とニューロンのよう扱われる広範な神経突起形成開始を見る。勉強の可変キャリアを示す神経変性疾患の治療の可能性と NGF リリースの長期的なインプラント。

Introduction

NGF は、開発や末梢神経系 (PNS)1のニューロンのメンテナンスのため不可欠ですし、中枢神経系 (CNS)2の生存と前脳基底部コリン作動性ニューロンの機能に重要な役割を果たしています。中央の神経変性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病などの治療に可能性が高いその薬理学的実証されている広く、進捗状況3,4,5、現在の臨床試験で 6。中枢神経系への NGF の配信の最大の課題は (BBB)、全身投与7血液脳関門を通過できないことに存在します。さらに、急速な酵素分解する NGF 感受性はその短いによるハーフライフをレンダリングし、その治療上の使用8,9が大幅に制限します。したがって、安全に NGF のリリースが長引くと制御を可能にする配信システムの設計が満たされていない課題があります。ポリマー ベースのシステムを含む各種の NGF 配信システムは,10,11,12,13,14,15,をされています。16,17. これらのシステムのリリースのプロファイルが、後者の段階に解放率は初期バースト11 と比較して大幅に低低速連続リリースに続いての最初のバーストによってしばしば特徴づけられる、18,19。さらに、このシステム20封止工程 (例えばpoly(lactic-co-glycolic) 酸) 高分子酸性分解産物や NGF 活性の損失による蛋白質の不活性化が観察されました。

ナノ構造 PSi は有望な薬物配信プラットフォーム21、predestining、体液で高表面積、大量多孔性、生体適合性、可変分解を含むいくつかの魅力的なプロパティによって特徴付けられる 22,23,24,25,26,,2728。陽極酸化条件の適切な選択は薬物読み込みとリリース速度21,27仕立ての PSi 構造特性 (例えば、気孔率と気孔サイズ) を簡単に調整することができます。また、様々 な便利な化学ルート PSi の表面を変更し、そのことによって生理学的条件下での Si 足場の溶解速度と薬22,24の解放率をさらに調整することができます。 29,30

この作品は、NGF の長期徐放の PSi に基づく配信システムの設計について説明します。神経細胞の分化と伸長に及ぼす NGF PSi キャリア PC12 細胞を用いて、DRG ニューロンを分離しました。読み込まれた NGF が神経突起伸展と単一管理内で 1 ヶ月リリース期間中の深遠な分化を誘導することによってその活性を保持することを示す.

Protocol

すべてのメソッドは、Bar Ilan 大学倫理委員会によって承認されています。

1. 酸化 PSi (問題高等2) キャリアの作製

  1. ダイヤモンドひっくり返されたペンを使用して 1.5 cm × 1.5 cm サンプルに Si 基板 (片面 < 100 > 顔に洗練されたと高濃度ホウ素ドープ、p 型、0.95 mΩ·cm) をカットします。
  2. 大気中 2 h 400 ° C でチューブ炉における Si 試料を酸化 (加熱速度: 25 ° C/分、自然冷却)。
  3. 水溶液中のフッ化水素酸 (HF) (48%)、ddH2O およびエタノール (99.9%) のソリューションのシリコン サンプルを浸す(1:1:3 v/v/v) 5 分。その後、エタノールとサンプル 3 回すすいで乾燥窒素気流下における。
    注: 準備し、HF 溶解ガラスとしてのみ、レズアンで HF ソリューションを格納します。
    注意: HF は腐食性の高い液体、慎重に処理する必要があります。露出の場合水で完全にすすぎます、HF 解毒剤ゲルを患部の治療すぐに医療を求めます。
  4. バック コンタクトとプラチナ コイルとしてカウンター電極としてアルミ箔のストリップを使用してポリテトラフルオロ エチレン エッチング セルのシリコン サンプルをマウントします。
  5. 水溶液中の HF と 30 のエタノール (99.9%) の 3:1 (v/v) 溶液中の犠牲層をエッチング 250 mA/cm2リンス結果 PSi の表面フィルムのエタノールで 3 回、窒素気流下で乾燥の定電流密度で s。
  6. 水溶液 NaOH 溶液 (0.1 M) 2 分で新鮮なエッチングの多孔質層を溶解します。エタノール、すすぎ 3 回、窒素気流下で乾燥します。
  7. 水性 HF (48%)、ddH2O およびエタノール (99.9%) のソリューションのサンプルを浸す(1:1:3 v/v) 2 分。エタノール、すすぎ 3 回、窒素気流下で乾燥します。
  8. 水溶液 HF と 20 のエタノール (99.9%) の 3:1 (v/v) 溶液中のシリコン サンプルを電気化学的エッチング 250 mA/cm2リンス結果 PSi の表面フィルムのエタノールで 3 回、窒素気流下で乾燥の定電流密度で s。
  9. 熱酸化大気中 1 h 800 ° c のチューブ炉における新鮮なエッチング PSi サンプル (加熱速度: 25 ° C/分、自然冷却) 多孔質 SiO2 (問題高等2) 足場を形成します。
  10. 1 分; 4,000 rpm で肯定的な厚いフォトレジストでスピン コート問題高等2サンプル2 分間 90 ° C でコーティングのサンプルをして焼く (加熱速度: 5 ° C/分、自然冷却)。
  11. サイコロ問題高等2ダイシングを使用した 8 mm × 8 mm のサンプルにサンプルを見た。
  12. 3 時間のアセトンでさいの目に切ったサンプルを浸し、フォトレジストを削除するにはエタノールで徹底的に洗い流し、窒素気流下で乾燥します。

2. 読み込み問題高等2 NGF

  1. NGF のソリューションの読み込みを準備するには、ddH2O を 0.01 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 1:1 (v/v) ソリューションの 400 μ L でマウス β NGF の 20 μ g を溶かす
  2. 問題高等2サンプル上に読み込みソリューションの 52 μ l 添加しキャップ皿に RT で 2 時間インキュベートします。
    注: は、孵卵中におけるソリューションの枯渇を防ぐために皿に高湿度を維持します。
  3. Ngf 問題高等2キャリア内の後続の定量化のためのサンプルの上にソリューションを収集します。
    注: 意図されていた使用の直前に問題高等2に NGF 読み込みを実行必要があります、プロトコルは乾燥のリスクと、タンパク質の変性のためここで一時停止できません。

3. 神経成長因子 NGF elisa 法による読み込みの定量化

  1. Elisa 用プレートを準備するには、0.5 μ G/ml キャプチャ抗体 (ウサギ抗 hβ NGF) それぞれはまあ、プレートを密封し、室温一晩インキュベートの 100 μ L を追加します。
  2. 液体を除去し、洗浄バッファーの 300 μ L を使用して 4 回、洗浄する井戸を吸引 (0.05 %pbs でトゥイーン 20)/ウェル;最後の洗浄後残留バッファーを外し、ペーパー タオルの上にしみにプレートを反転します。
  3. 各ウェルにブロック バッファー (1% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS) の 300 μ L を追加し、室温に少なくとも 1 時間インキュベート吸引し、3.2 の手順で説明されているように 4 回プレートを洗います。
  4. 較正曲線を準備、希釈する NGF ソリューションの読み込み (手順 2.1 参照) 希釈液で (0.05% Tween 20、PBS で 0.1 %bsa) 1 ng/mL に。校正曲線のサンプルを入手するのにはゼロを 1 ng/mL から 2 倍のシリアル希薄を実行します。
  5. サンプルを準備、希釈する (手順 2.1) から NGF 読み込みソリューションと希釈 1: 100,000、1: 10,000 (ステップ 2.3) から収集した後読み込みソリューションそれぞれ使用 (16 1,000 pg/mL) の ELISA キットの濃度範囲に到達します。
  6. 希釈試料 100 μ L を追加し、校正曲線サンプル各 3 通もし、, RT で 2 h。吸引し、3.2 の手順で説明されているように 4 回プレートを洗います。
  7. 各ウェルに 1 μ G/ml 検出の抗体 (ビオチン標識ウサギ抗-hβ-NGF) の 100 μ L を追加し、RT で 2 時間インキュベートします。吸引し、3.2 の手順で説明されているように 4 回プレートを洗います。
  8. アビジン西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) 1:2,000 希釈剤で希釈、100 μ L/ウェルを追加、室温 30 分間インキュベート今吸引し、洗浄する 4 回 3.2 で説明されているようです。
  9. 各ウェルに基質溶液 100 μ L を追加し、発色の RT で 25 分を孵化させなさい。405 で吸光度を測定 650 nm 波長補正設定 nm マイクロ プレート リーダーを使用しています。
  10. 読み込みソリューションで校正曲線に基づいて収集した後読み込みソリューション NGF 濃度を決定します。
  11. 問題高等2キャリア内で読み込まれた NGF 質量を計算するには、ソリューションの読み込み中 NGF 塊から収集した後読み込みソリューションで NGF 質量を引きます。NGF 読み込み有効性は以下の式で計算されます。
    Equation

4.体外NGF リリース問題高等2

  1. 2 mL の 1% (w/v) BSA とアジ化ナトリウム 0.02% (w/v) 37 ° C で、100 rpm の軌道の動揺の下でを含む 0.01 M PBS における NGF ロード問題高等2キャリアを孵化させなさい。
  2. 2 日おきはソリューションを収集し、2 mL の新鮮な PBS を置き換えます。収集リリース サンプルを液体窒素で凍結し、さらなる分析の-20 ° C で保存します。
  3. 市販の NGF ELISA の試金を使用して、リリース サンプル手順 3.1 3.9 での NGF 含量を定量化します。
    注: ELISA 定量リリース サンプルを準備するとき異なる希釈率はリリース期間 (すなわちポイントを後の時点よりもはるか希釈する必要があります以前の時間) に沿って異なる時点の実行必要があります。さらに、各リリースのサンプルでは、少なくとも 2 つの異なる希釈率を実行し、定量 ELISA キットの濃度範囲に達することを確認する必要があります。
  4. 検量線に基づくリリース サンプルで NGF 濃度を決定して時間の経過と共に累積 NGF リリースのグラフをプロットします。

5.体外誘導結合プラズマ発光分光分析 (ICP-AES) により Si 浸食の定量化

  1. 10 mL の容量のリリース サンプル 1:10 リリース バッファー (0.01 M PBS 1% (w/v) BSA とアジ化ナトリウム 0.02% (w/v) を含む) での 1 mL を希釈します。
  2. 希釈サンプルの 212.4、288.2 251.6 nm の Si 原子発光ピークを監視します。
  3. 検量線に基づく Si 濃度を決定します。
  4. Si 分解プロファイルを確立するには、(すなわち、リリース期間に沿って累積的な Si コンテンツ) のキャリアの Si コンテンツの合計の割合、各時点での Si 量を表現します。
    注: キャリアの合計の Si 含有量と定量の正確さを確保するため、リリース サンプル サンプル 1 ヶ月以下リリースの研究や誘導結合プラズマ発光分析法を用いた Si 濃度の分析です。リリース期間に沿って累積的な Si 量とリリース後のサンプルで si 含有量の合計は、Si 含有量 100% を提供します。

6. 細胞生存率および NGF ロード問題高等2キャリアの存在下で成長

  1. ラット褐色細胞腫 (PC12) 細胞培養
    1. 基本的な成長培地を準備するには、10% 馬血清 (HS)、5% ウシ胎児血清 (FBS)、1 %l-グルタミン、1% ペニシリン ストレプトマイシン ローゼル公園医療研究所 (RPMI) 中に 0.2% アムホテリシンを追加します。
    2. %1 を追加することによって分化培地を準備 HS、1 %l-グルタミン、1% ペニシリン ストレプトマイシン RPMI 培地に 0.2% アムホテリシン。
    3. 8 日間の基本的な成長培地 10 mL で 75 cm2培養用フラスコ細胞懸濁液 (106セル) を育てる2 日おきは、基本的な成長培地 10 mL をフラスコに追加します。
    4. 分化 PC12 細胞培養を生成するには、細胞懸濁液を遠心管; に転送します。200 x gで RT。 破棄 8 分のための細胞培養上清を遠心分離機します。
    5. 基本的な新鮮な成長媒体の 5 mL のセルを中断し、再遠心分離機の 200 x gで RT; 5 分のセル上澄みを廃棄し、基本的な成長培地 3 mL に細胞ペレットを再懸濁します。
    6. 細胞塊を分離するには、10 倍 23 G の注射器を使用してセルを吸い出しなさい。
    7. 検定携帯カウンターを使用してセルをカウントで分化培地の存在下でコラーゲン タイプ l コーティング プレートに 104セル/cm2作業領域をシードします。
    8. 24 h 後新鮮なマウス β NGF (50 ng/mL) またはプレートごと NGF ロード PSiO2 キャリアを追加します。
      注: NGF 濃度が高い (> 50 ng/mL) 指定した濃度と正確な効果を持っています。
    9. 2 日おきに分化培地を更新します。
    10. 細胞生存率を評価するには、代表的な時点で生存指示薬 (レサズリン ベース) の 10% (v/v) を追加し、37 ° C で 5 時間インキュベート490 で吸光度を測定分光光度計を用いた nm。
  2. マウス後根神経節 (DRG) の細胞培養
    1. 、2 つの 7 週齢 C57bl マウスから Drg を分離するには、最初の 70% エタノール マウスを消すし、切開、皮膚を削除します。
    2. 頭蓋底をカットし、腹壁の筋肉、脊髄までを公開します。
    3. に対する大腿骨のレベルでカットすることによって、脊柱を削除し、周囲の組織をきれいします。
    4. 3 つの小品に列をカットします。2 つの半分を生成し、脊髄を皮に正中線で各部分が斬る。
    5. 、両眼の下ですべての後根神経節神経節を抽出し、冷たいハンクの平衡塩溶液 (HBSS) の中に没頭します。
    6. シャーレに Drg を追悼して周囲の結合組織をきれいにし、両眼の下で残留髄膜を慎重に取り外します。
    7. パパインの 1,000 U の 20 分にそれらをインキュベートし後根神経節細胞を分離します。
    8. 400 x gで 4 分の細胞を遠心します。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを維持します。
    9. 10 mg/mL コラゲナーゼ、12 mg/mL 当期 II ソリューションでペレットを再懸濁します、37 ° C で 20 分間インキュベート
    10. 400 x gで 2 分間細胞を遠心分離します。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを維持します。
    11. HBSS、10 mM グルコースと 5 mM HEPES (pH 7.35) 繰り返し通過収縮したパスツール ピペットで 1 mL の細胞ペレットをカップ刻んだ。
    12. 優しく L-15 媒体密度勾配遠心; による細胞分離用石英系コロイド中の 20% を含む解離細胞を追加します。1,000 x gで 8 分間遠心します。上清を吸引し、細胞ペレットを保ちます。
      注: この手順の目的は、別の神経細胞軸索の破片から、シュワン細胞、線維芽細胞を浄化しです。
    13. F-12 媒体の 2 mL で細胞ペレットを再懸濁します1,000 x g で 2 分間遠心上澄みを廃棄し、F-12 培地 1 mL にペレットを再懸濁します。
    14. セルとポリ-L-リジンの種子 2 × 104セルをカウントし、ラミニン コート ガラス下部 35 mm の培養皿の 10% を添加した F-12 抗生物質無料媒体で政府短期証券。
      注: 最初に、シード中 (150-200 μ L); の小さなボリュームのセル次の 37 ° C で 2 時間培養、培地 2 mL の最終的なボリュームを追加します。
    15. 優しく NGF ロード問題高等2キャリアまたは新鮮なマウス β-NGF (50 ng/mL) あたりプレートを追加します。
    16. 2 日後で RT; で 15 分 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液とインキュベート細胞培養を修正します。immunostain 染色手順31一般的な蛍光抗体法を用いた細胞培養。
    17. 共焦点顕微鏡を用いて神経の細胞培養のイメージ。

7. 細胞分化の解析

  1. PC12 細胞の NGF ロード問題高等2キャリアの存在下で分化割合
    1. 5% CO2を含む 37 ° C で加湿のインキュベーターでの分化培地 2 mL に NGF ロード問題高等2キャリアを孵化させなさい。
    2. 2 日おきに、ソリューションを収集し、新鮮な培地 2 mL に置き換えます。収集リリース サンプルを液体窒素で凍結し、さらなる分析の-20 ° C で保存します。
    3. 12 ウェル コラーゲン被覆板の指示通りセクション 4.1 (4.1.3-4.1.6) の種子 PC12 細胞。
    4. 24 h 後、さまざまな坑井; (セクション 5.1.2) から代表的な時点のリリース サンプルを紹介します。コントロールの井戸、新鮮なマウス β NGF (50 ng/mL) を追加します。
    5. 24 h 後、光学顕微鏡を用いた細胞を画像します。
    6. 神経突起形成細胞のパーセンテージを決定するには、手動で画像内のセルの合計数のうち神経突起を脱却していたセルの個数 (n = 各ウェルの 5 フレーム);時間の経過と神経突起伸展 PC12 細胞の割合のグラフをプロットします。
      注: 未分化 PC12 細胞の神経突起 (セル相馬径最小長さの少なくとも 1 つ) または形態学的変化の副産物によって分化した細胞を識別できる間、神経突起のない構造を丸く登場。
  2. 分化 PC12 細胞の形態計測学的解析
    1. 画像処理解析、NGF (試薬としてまたは NGF ロード問題高等2キャリアのリリース製品として) 処理後 3 日を培養細胞の位相画像を取得します。
      注: (5 日目) を超えた後の時点でセルは、非常に複雑なネットワークでは、単一セルの解像度で形態計測を防止を開発します。
    2. 画像処理プログラム NeuronJ、半自動突起トレースと長さの測定を可能にする ImageJ のプラグインをダウンロードしてください。
    3. イメージ ファイルを変換すると、8 ビットの形式とイメージ スケール バーを用いたマイクロメータ比測定ピクセル。
    4. 分析を使用して尺度を設定する |縮尺の設定コマンドと各神経突起の長さを測定。
    5. 手動で分岐ポイントの数と各セル相馬由来神経突起の数をカウントします。
      注: 神経突起の平均長 NGF 治療後 1 日目は約 30 μ m です。測定神経突起の長さは広く配布することがあります。

Representative Results

PSi の酸化膜は、プロトコルで説明されているように製造されています。20 のための電気化学エッチングに Si ウエハを受ける s 250 mA/cm2 (図 1ai)、800 ° c (図 1aii) 問題高等2足場を生成する熱酸化によって続いた。図 1 b、c.高分解能走査電子顕微鏡観察された問題高等2フィルムの (HR SEM) 画像が表示されます。トップ ビュー顕微鏡写真 (図 1 b) フィルムの約 40 の細孔を持ったその多孔質の性質を示しています直径 nm。劈開フィルム (図 1 c) の断面顕微鏡写真には、相互接続の円筒細孔によって特徴付けられる、2.9 μ m の多孔質層の厚さが明らかにします。

問題高等2映画は、aiii図 1に示すように、ソリューションを読み込み NGF によって読み込まれます。NGF の読み込みは、問題高等2映画の孵化前後荷重ソリューションにおける NGF 濃度を測定することにより NGF ELISA を用いた定量化されます。読み込まれた NGF 問題高等2映画 1 本あたりの平均質量は、2.8 ± 0.2 μ g は、高荷重性が 90% (w/w) (31を示されていないデータ) に対応で決まります。問題高等2キャリアから NGF リリース プロファイルを確立するために読み込まれたフィルムは 37 ° C で PBS で孵化させるし、すべて 2 日因数が NGF を使用してリリースされたタンパク質濃度の定量化のためサンプリングされます。さらに、/ICP-AES によるリリース試料中の Si 量を定量化、問題高等2キャリアの si 侵食を設立しました。図 2は、NGF リリースと多孔性担体の対応する Si 分解プロファイルを示しています。バースト効果がなければ、神経成長因子の徐放が 1 ヶ月の期間を達成しました。NGF リリースの最初の週は高速 (斜面 = 0.442) リリースの期間 (斜面 0.043) に沿って数日後にはるかに遅いリリースに比べて。それは、全体の 1 月リリース期間中 NGF リリース量については、後ほど、PC12 細胞の深遠な分化を誘導するため十分であること注意してください。リリース累積 NGF は良い相関のあることが判明 (R2 = 0.971) 残りの si 含有量、図 2のはめ込みのようで。

次に、NGF ロード問題高等2キャリアの生理活性は特徴付けられた生体外で、PC12 細胞および後根神経節ニューロンは神経細胞の分化、伸長のモデルとして使用されます。PC12 細胞と解離の DRG ニューロンは、プロトコルで説明されているようにシードされます。きちんとした (読み込まれていません) セルまたは NGF ロード問題高等2; の孵化によって問題高等2キャリアの存在下での細胞生存率を検討する最初に、制御板、ニート問題高等2細胞が 2 日ごと無料 NGF と補われます。きちんとや NGF ロード問題高等2キャリア (図 3 a)、問題高等2が細胞に生体適合性であることを示す細胞の露出に細胞毒性は認められなかった。図 3 bは、PC12 細胞の NGF ロード問題高等2キャリアと扱われる代表的な HR SEM 観察結果を示しています。観察された細胞エキス神経突起やフォーム特性分岐ニューロンです。シード NGF ロード問題高等2キャリアの存在下における後根神経節神経細胞を分離したとき、似たような結果が得られます。広範な神経突起形成開始、伸長、肯定的な制御 (すなわち、無料の補われたニューロンのよう immunostained の後根神経節細胞 NGF ロード問題高等2キャリア (図 3e) との共焦点画像を表示します。NGF、図 3 dを参照してください)、負の制御 (すなわち、未処理のニューロンを参照してください図 3 c)、神経突起伸長の低下程度を展示します。

問題高等2キャリアからリリースされた NGF 存在下で PC12 細胞分化の割合を評価するには、分化は総細胞集団から神経突起の伸長と細胞をカウントすることによって定量化されます。図 4は、26 日間にわたって異なる時点で分化した細胞の割合の面で結果をまとめたものです。重要な差別化の割合は調査期間を通して達成しました。特に、26 日後リリースされた NGF にポリマー ベース キャリア16先行研究に高いと比較される著しく分化率 50% 以上の分化が誘導されます。NGF 多孔質のホストの内でわなに掛ける事に 〜 1 ヶ月の期間のための深遠な分化誘導のための蛋白質の生物活性が保持されることが示唆されました。

単一セルのレベルでさらに NGF 問題高等2キャリアのニューロンへの分化に及ぼす影響を検討するため分化 PC12 細胞の 3 つの特徴的な形態学的パラメーターの測定: (i) 相馬 (からの神経突起の抽出数ii) の合計の突起の長さ、(iii) 分岐するポイントの数。セルは、NGF ロード問題高等2キャリア、無料 NGF (2 日おき) の反復投与試験をコントロールとして扱われます。図 5a-cは、1-3 日でセル人口の形態計測学的解析を示します。PC12 細胞の NGF ロード問題高等2で治療は、すべての 3 つのテストのパラメーターの処理に類似している形態の値を示します。3 日後形態のすべてのパラメーターの値は、NGF ロード問題高等2キャリアと無料の NGF の反復的な管理コントロール治療の両方の同じ率で増加し観察されます。

Figure 1
図 1: 問題高等2薄膜の作製。(a)問題高等2キャリアの製造方式: (i) シリコンのウエハは 20 のための電気化学エッチングに服従 250 mA/cm2s に続いて問題高等2足場と (iii) NGF によってロードを生成する 800 ° C で (ii) 熱酸化物理吸着 (回路図は描画されませんスケール)。(b ・ c)特性問題高等2フィルムのトップ ビューと断面の電子顕微鏡写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 神経成長因子放出と NGF ロード問題高等2キャリアの Si 侵食プロファイル。問題高等2キャリアの劣化の程度は、多孔質膜の Si コンテンツの合計からそれぞれの時点で残りの Si のコンテンツの一部として表示されます。挿入図は、コンテンツ リリース累積 NGF と残りの Si との相関を示しています。エラー バーを表す SD、n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: セル実行可能性および NGF ロード問題高等2キャリアの存在下で成長。(a) の in vitro毒性評価。1、3、7 日にきちんと (ロードされていない) 問題高等2キャリアや NGF ロード問題高等2航空会社無料 NGF への露出の後 PC12 細胞生存率を測定 (50 ng/mL 2 日ごと制御板)。(b) 9 日間 NGF ロード問題高等2キャリア PC12 細胞の電子顕微鏡。左側のパネル: ズームイン、セル相馬; から神経突起伸長を描いた右側のパネル: ズーム アウトを示す非常に複雑な神経ネットワーク形成します。(c ・ e)共焦点顕微鏡画像 immunostained 後根神経節ニューロンの細胞培養 (播種後 2 日): (c) 未処理細胞;(d) セルを添加した無料 NGF (50 ng/mL);(e) NGF 問題高等2キャリア。H ニューロ フィラメントの蛍光抗体染色により、セル相馬と outgrowing 突起を映像化。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: PC12 細胞の NGF の代表的な時点で NGF ロード問題高等2キャリアからリリースへの露出に分化割合値。差別化の割合は、総細胞集団から神経突起の伸長と細胞数として表されます。コントロール治療無料神経成長因子を添加した細胞を指します (50 ng/mL)。X 軸に沿って異なる時点で細胞の代表的な光学顕微鏡画像が描かれています。スケール バー コントロールの顕微鏡写真の日 2、8、14、26、50 μ m の顕微鏡写真の 25 μ m を =。エラー バーを表す SD、n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 分化 PC12 細胞の形態計測的解析します。3 形態学的分化 PC12 細胞の測定、単一セルのレベルで日 NGF ロード問題高等2キャリアまたは反復投与に 1 と 3 次暴露無料 NGF (コントロール); 2 日おきで分岐ポイントのセル相馬と (c) の数から突起を抽出 () 合計神経突起の長さ (b) 数です。エラー バーを表す SD、n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

問題高等2分解性ナノ薄膜を作製し、神経成長因子、生理活性を維持しながら、継続的かつ長期にわたるリリースを可能にするためのキャリアとして採用します。NGF の配信システムとして問題高等2の可能性は、神経細胞の分化を誘導し、DRG ニューロンと PC12 細胞の伸長を促進する十分な用量で NGF を解放する能力を示すことにより体外で実証。設計された映画は、今後の治療で体内の NGF の長期貯蔵庫として使用できます。

捏造の PSi 薄膜の構造特性が NGF ペイロードに特化しました。電気化学エッチング過程の電流密度は、約 40 の気孔のサイズを取得する調整された簡単に NGF、26.5 kDa32のポリエチレング33~ 4 nm の特徴的な直径とタンパク質を収容する nm多孔質マトリックス内また、多孔質足場材料の熱酸化は、正荷電荷電酸化 PSi 表面蛋白質の静電引力により NGF の物理吸着を有効にするため行われました。PSi の表面化学は読み込みの有効性に大きな影響を及ぼすし、ペイロードと多孔性のマトリックスの相互作用を適切に制御するために簡単に調整できます。その後、これらの相互作用は、吸着タンパク質分子の構造とその生理活性34,35,36を指示します。結論としては、システムが適切な細孔径、表面特性と理想的な載荷溶媒とパラメーターを述べた指示の結果の効果の蛋白質のローディングを慎重に選んで NGF の最適な読み込みを取得する調整されました。効果。したがって、界面化学、作製パラメーター (例えば、電流密度、エッチング時間、型、ドーパントや電解質の濃度) の変化またはローディング効果と生物活性に影響を与えることができます溶液組成を読み込み、読み込まれているタンパク質です。

PSi orPSiO2ホストからペイロードの解放率は、一般的に 2 つの同時のメカニズム、ペイロード分子の拡散と Si 足場37の劣化の組み合わせによって決まります。侵食とその後の溶解速度を注入サイト、その病理と病の状態28,38,39で受けます。異なるリリース速度は、特定の治療上の適用の必要がある場合リリース プロファイルできます変更、PSi 表面38,40、表面の化学を変更することによって延長前の仕事に設立 41。熱酸化、熱炭化ヒドロシリル化技術などの種々 の化学修飾は、PSi の表面を安定させ、その劣化と結果としてペイロード リリース35,42 に影響に示されています。 ,,4344,45。また、共有結合が壊れたときにだけペイロードが解放されるのでより長期のリリースで様々 な表面の化学経路を介して Si 足場に蛋白質分子の共有結合によってキャリアへの NGF の読み込みがありますかマトリックスは、Si をサポート21をが低下。

さらに、その作製プロセスに従って PSi に表示できる薄膜、微粒子46、ナノ粒子47フリースタンディング膜26、キャリアとしても使用できるなどのほかさまざまな構成NGF と満たす特定のアプリケーション ニーズ.

臨床的に関連するために、問題高等2キャリア内 ngf 治療用量の範囲に到達する必要があります。携帯メディアの 2 mL の一貫性のあるボリュームにプロトコルで説明されているメソッドで NGF ロード問題高等2キャリアの導入や PBS バッファーとしたがって、読み込みソリューションと読み込まれたそれぞれの NGF 質量濃度の調整をもたらすをテスト生体外でシステムに関連した NGF 濃度をリリースしました。体外体内環境などさまざまなシステムのこのメソッドを活用したソリューションを読み込み NGF 濃度増加なり必要な量に応じて調整。また、NGF 含量はテスト面積あたり複数の搬送波を導入または問題高等2サンプルの大きい区域を使用して取得できます。

また、リリース期間に沿って時点以降にリリースされた NGF 濃度が以前の時点よりもはるかに低いに注意してください。時間の経過とともに NGF 磁束が一定ではないという事実は、アプリケーションのニーズに合わせてシステムを設計考慮したする必要があります。

多数 NGF 配信システムが開発され、ポリマー ベースのシステムは、報告は本邦では、それらのほとんどは1011,12,15抱合体合成又は天然の高分子から成る,16,17します。 これらのシステムは、効果的な示されている徐放性プロファイル、しかし、重要なバーストの効果で数日にわたってスパン リリース期間。これらの配信プラットフォームのいくつかの異なる安定剤18,48, 洗練された、複雑な使い方が必要な封止工程時に生物活性の損失などクリティカルな制限に苦しむ作製テクニック16。蛋白質のための配信システムの設計における最大の課題の 1 つはキャリア システムの内でわなに掛ける事によって分子の生理活性を維持する能力です。タンパク質、ペプチドは、両方の重要な要因は、これらの敏感な生体分子を読み込みとき強いの有機溶剤を使用せずに PSi/問題高等2常温または低温でもロードできます。以前の研究では、PSi/問題高等2表面化が読み込まれた蛋白質35,36の可能な変性を最小限に抑える重要な役割を果たしていることを示しています。したがって、PSi/問題高等2は特に一般に成長因子のための配信システムの開発と NGF の有利なナノ材料です。

現在の仕事は CNS 神経変性疾患の潜在的な治療のために NGF の直接投与の治療法として本法を活用に焦点を当てた。NGF ロード問題高等2キャリアは、マウスの脳に埋め込むことができる、長期的なインプラントとしてプラットフォームの有効性は,生体内で。さらに、この有望なキャリアを組み合わせて非侵襲的上49,50可能性があります 1 つ有効に空気圧を用いたローカライズされた領域に高い空間分解能で NGF ロード問題高等2粒子を管理するため時空間の投薬が必要な神経変性疾患の治療のためのキャピラリー銃。また、NGF は化学勾配方法51、軸索ガイダンス分子のように神経細胞の成長を指示できます。したがって、ロード問題高等2キャリアは、神経成長因子、成長、他演出キュー52,53を補完する誘引のホット スポットとして使用できます。さらに、さらにチューニング問題高等2ナノ構造とその表面の化学多く拡張期間の数ヶ月までの NGF の配信を維持するために問題高等2キャリアを具体的にカスタマイズできます。

Disclosures

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

Acknowledgments

MS と ES コア サービスを認めるし、生命科学、工学およびテクニオン ラッセル ベリー ナノテクノロジー研究所の金融支援トラック i. ローキー センターからサポートします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計
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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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