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Bioengineering

Projetar filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento do nervo

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para projetar e fabricar filmes de silício poroso (PSi) nanoestruturados como transportadores degradáveis para o fator de crescimento do nervo (NGF). Diferenciação neuronal e consequência de PC12 células e ratos raiz dorsal neurônios do gânglio (DRG) caracterizam-se após tratamento com as transportadoras PSi NGF-carregado.

Abstract

Apesar do grande potencial de NGF no tratamento de doenças neurodegenerativas, sua administração terapêutica representa um desafio significativo, como a proteína não atravessa a barreira hemato - encefálica, devido a suas propriedades químicas e portanto requer a longo prazo entrega para o cérebro para ter um efeito biológico. Este trabalho descreve a fabricação de filmes de PSi nanoestruturados como degradáveis portadores de NGF para entrega sustentada desta proteína sensível. Os portadores de PSi são adaptados especificamente para obter o carregamento de alta eficácia e liberação contínua de NGF por um período de quatro semanas, preservando sua atividade biológica. O comportamento das transportadoras NGF-PSi como um sistema de entrega de NGF é investigado em vitro examinando sua capacidade de induzir a diferenciação neuronal e consequência de células PC12 e dissociada DRG neurônios. Viabilidade celular na presença de portadores de PSi puro e NGF-carregado é avaliada. A bioatividade de NGF liberado das transportadoras que PSi é comparada com o tratamento convencional das administrações de NGF livre repetitivas. Diferenciação de células PC12 é analisada e caracterizada por medição de três diferentes parâmetros morfológicos das células diferenciadas; (i) o número de neuritos extraindo de soma o comprimento dos (ii) o total neuritos e (iii) o número de pontos de ramificação. PC12 células tratadas com os portadores de NGF-PSi demonstram uma profunda diferenciação durante todo o período de lançamento. Além disso, células neuronais DRG, cultivadas com as transportadoras de NGF-PSi mostram uma iniciação de axônio extensa, semelhantes a neurônios tratadocom com administrações de NGF livre repetitivas. As transportadoras sintonizáveis estudadas demonstram os implantes a longo prazo para a liberação de NGF com um potencial terapêutico para doenças neurodegenerativas.

Introduction

NGF é essencial para o desenvolvimento e a manutenção dos neurônios no sistema nervoso do periférico (SNP)1 e desempenha um papel crucial na sobrevivência e função dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal no sistema nervoso central (SNC)2. Seu alto potencial farmacológico para o tratamento de doenças neurodegenerativas central, tais como a doença de Alzheimer e de Parkinson, tem sido amplamente demonstrado, com ensaios clínicos atualmente em progresso3,4,5, 6. O maior desafio na entrega de NGF ao SNC reside na sua incapacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica (BBB), quando administrados sistemicamente7. Além disso, a susceptibilidade de NGF a rápida degradação enzimática processa sua meia-vida curta e limita significativamente seu uso terapêutico8,9. Portanto, há um desafio não cumprido para projetar sistemas de entrega que permitem uma liberação prolongada e controlada de NGF de maneira segura. Vários sistemas de entrega de NGF, incluindo sistemas baseados em polímero, foram estudados10,11,12,13,14,15, 16 , 17. os perfis de liberação destes sistemas foram muitas vezes caracterizados por uma explosão inicial distinta, seguida por uma liberação lenta e contínua, onde no último estágio, a taxa de liberação foi significativamente mais baixa em comparação com o surto inicial11 ,18,19. Além disso, observaram-se com estes sistemas20inativação da proteína por produtos de degradação ácida dos polímeros (por exemplo, ácido poly(lactic-co-glycolic)) ou perda de Bioatividade NGF durante o processo de encapsulamento.

Nanoestruturados PSi caracteriza-se por várias propriedades atraentes, inclusive sua elevada área superficial, grande volume poroso, biocompatibilidade e degradabilidade sintonizável em fluidos corporais, predestining-lo para uma promissora droga entrega plataforma21, 22,23,24,25,26,,27,28. Seleção adequada de suas condições de anodização permite ajustar facilmente as propriedades estruturais de PSi (por exemplo, porosidade e poros de tamanho) para costurar o carregamento de drogas e cinética de liberação21,27. Além disso, várias rotas químicas convenientes permitem modificar a superfície da PSi e por isso ainda mais ajustar a taxa de dissolução do cadafalso Si sob condições fisiológicas e as taxas de liberação de drogas22,24, 29,30.

Este trabalho centra-se em projetar um sistema de entrega baseado em PSi para liberação controlada prolongada de NGF. O efeito das transportadoras NGF-PSi na diferenciação neuronal e consequência é examinado usando células PC12 e dissociado neurônios DRG. Demonstramos que o NGF carregado manteve sua Bioatividade induzindo a consequência natural do axônio e profunda diferenciação ao longo de um período de 1 mês de lançamento dentro de uma única administração.

Protocol

Todos os métodos foram aprovados pela Comissão ética do Bar Ilan University.

1. fabricação de transportadoras oxidado PSi (anos2)

  1. Corte um wafer de Si (único lado polido na face < 100 > e fortemente dopado com boro, tipo p, mΩ·cm 0,95) em amostras de 1,5 cm × 1,5 cm, usando uma caneta com ponta de diamante.
  2. Oxidar as amostras de Si em uma fornalha de tubo a 400 ° C por 2 h no ar ambiente (taxa de aquecimento: 25 ° C/min, refrigerar natural).
  3. Mergulhe as amostras de Si em uma solução de aquoso ácido fluorídrico (HF) (48%), ddH2O e etanol (99,9%) (1:1:3 v/v/v) por 5 min; em seguida, lavar as amostras com etanol três vezes e secar sob um fluxo de nitrogênio.
    Nota: Preparar e armazenar a solução de HF em plasticware apenas, como HF dissolve vidro.
    Cuidado: HF é um líquido altamente corrosivo, e ele deve ser manipulado com extremo cuidado. No caso de exposição, lavar abundantemente com água e tratar a área afetada com gel de antídoto HF; Procure assistência médica imediatamente.
  4. Monte a amostra de Si em uma célula de gravura de politetrafluoroetileno, usando uma tira de papel alumínio como um contato de volta e uma espiral de platina como eletrodo contador.
  5. Etch uma camada sacrificial em uma solução de 3:1 (v/v) de HF aquoso e etanol (99,9%) por 30 s, com uma densidade de corrente constante de 250 mA/cm2; em seguida, enxaguar a superfície do PSi resultante de cinema com etanol três vezes e seque sob uma corrente de azoto.
  6. Dissolva a camada porosa recém-gravadas em uma solução aquosa de NaOH (0,1 M) por 2 min. Depois, três vezes, enxaguar com etanol e seco sob um fluxo de nitrogênio.
  7. Mergulhar a amostra em uma solução de aquosa HF (48%), ddH2O e etanol (99,9%) (1:1:3 v/v) por 2 min. Depois, três vezes, enxaguar com etanol e seco sob um fluxo de nitrogênio.
  8. Eletroquimicamente etch a amostra de Si em uma solução de 3:1 (v/v) de HF aquoso e etanol (99,9%) por 20 s, com uma densidade de corrente constante de 250 mA/cm2; em seguida, enxaguar a superfície do PSi resultante de cinema com etanol três vezes e seque sob uma corrente de azoto.
  9. Termicamente oxidar as amostras de PSi recém-gravadas em uma fornalha de tubo a 800 ° C por 1 h no ar ambiente (taxa de aquecimento: 25 ° C/min, refrigerar natural) para formar um poroso SiO2 (anos2) andaime.
  10. Amostras de rotação-casaco2 anos com um positivo fotorresiste grossa a 4.000 rpm durante 1 min; em seguida Asse as amostras revestidas a 90 ° C por 2 min (taxa de aquecimento: 5 ° C/min, refrigerar natural).
  11. Dados das amostras de2 anos em amostras de 8 mm × 8 mm, usando uma serra de corte em cubos.
  12. Para remover o fotorresiste, mergulhe as amostras em cubos em acetona para 3h; em seguida, enxaguar cuidadosamente com etanol e seco sob uma corrente de azoto.

2. carregamento anos2 com NGF

  1. Para preparar o NGF solução de carregamento, dissolver 20 µ g de β-NGF murino em 400 µ l de solução de 1:1 (v/v) de 0,01 M tampão fosfato salino (PBS) e ddH2O.
  2. Adicione 52 µ l da solução de carregamento na parte superior da amostra de2 anos e incubar durante 2 h em RT em um prato tampado.
    Nota: Manter alta umidade no prato para impedir a secagem da solução durante a incubação.
  3. Recolha a solução na parte superior da amostra para posterior quantificação do conteúdo de NGF dentro da transportadora de2 anos.
    Nota: Carregamento de NGF em anos2 deve ser realizado imediatamente antes do uso pretendido, o protocolo não pode ser pausado aqui devido o risco de secagem e desnaturação das proteínas.

3. quantificação do carregamento de NGF por ELISA NGF

  1. Para preparar a placa de ELISA, adicionar 100 µ l de anticorpos de captura 0,5 µ g/mL (coelho anticritérios-NGF) de cada bem, selar a placa e incubar durante a noite a RT
  2. Aspire os poços para remover o líquido e lave o prato quatro vezes com 300 µ l de tampão de lavagem (0,05% Tween-20 em PBS) por alvéolo; após a última lavagem, inverta a placa para remover o tampão residual e secar sobre papel absorvente.
  3. Adicione 300 µ l de tampão de bloco (1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS) a cada poço e incubar durante pelo menos 1 h no RT Em seguida aspirar e lavar a placa de quatro vezes, conforme descrito no passo 3.2.
  4. Para preparar uma curva de calibração, diluir a solução de carregamento de NGF (consulte a etapa 2.1) no diluente (0,05% Tween-20, 0,1% BSA em PBS) a 1 ng/mL. Em seguida, execute 2 vezes diluições seriais de 1 ng/mL a zero para obter amostras de curva de calibração.
  5. Para preparar as amostras, dilua a solução de carregamento de NGF (da etapa 2.1) e a solução de carregamento pós coletados (da etapa 2.3) no diluente de 1: 100.000 e 1:10,000 respectivamente, para atingir a faixa de concentrações do kit ELISA em uso (16-1.000 pg/mL).
  6. Adicione 100 µ l das amostras diluídas e amostras de curva de calibração para cada um bem em triplicado e incubam a RT por 2h; em seguida aspirar e lavar a placa de quatro vezes, conforme descrito no passo 3.2.
  7. Adicione 100 µ l de anticorpo de detecção de 1 µ g/mL (coelho biotinilado anticritérios-NGF) a cada poço e incubar a RT por 2 h. Em seguida aspirar e lavar a placa de quatro vezes, conforme descrito no passo 3.2.
  8. Diluir a 1:2,000 Peroxidase avidina-rábano (HRP) no diluente, adicionar 100 µ l por alvéolo e incube por 30 min em RT Agora aspirar e lavar a placa quatro vezes como descrito no passo 3.2.
  9. Adicione 100 µ l de solução de substrato a cada poço e incubar a 25 min no RT para desenvolvimento de cor. Medir a absorbância em 405 nm, com correção de comprimento de onda definido a 650 nm, utilizando um leitor de microplacas.
  10. Determine a concentração de NGF em tanto a solução de carregamento e a solução de carregamento pós coletados com base na curva de calibração.
  11. Para calcular a massa de NGF carregada dentro portador de2 anos, subtrai a massa do NGF na solução recolhida pós-carga da massa NGF em solução de carregamento. Eficácia de carregamento de NGF é calculada pela seguinte equação:
    Equation

4. in vitro NGF lançamento de anos2

  1. Incube as transportadoras de2 anos de NGF-carregado em 2 mL de 0,01 M PBS contendo 1% (p/v) BSA e azida de sódio 0,02% (p/v) a 37 ° C e sob agitação orbital de 100 rpm.
  2. Cada 2 dias, recolher a solução e substituí-lo com 2 mL de PBS fresco. Congelar as amostras coletadas lançamento em nitrogênio líquido e armazenar a-20 ° C para mais análises.
  3. Use o ensaio de ELISA de NGF comercialmente disponível para quantificar o conteúdo de NGF nas amostras de lançamento, conforme descrito nas etapas 3.1-3.9.
    Nota: Ao preparar as amostras de liberação para quantificação de ELISA, diferentes diluições devem ser executadas para pontos de tempo diferentes ao longo do período de lançamento (ou seja, momento anterior pontos devem ser diluídos muito mais do que pontos de tempo posteriores). Além disso, para cada amostra de lançamento, pelo menos duas diluições diferentes devem ser executadas e quantificadas para garantir alcançar o intervalo de concentrações do kit ELISA.
  4. Determinar a concentração de NGF nas amostras de lançamento com base na curva de calibração e traçar uma curva de liberação de NGF acumulativa ao longo do tempo.

5. quantificação do em vitro Si erosão por indutivamente acoplado Plasma emissão espectroscopia atômica (ICP-AES)

  1. Dilua 1 mL de lançamento amostras 01:10 em buffer liberação (0,01 M PBS contendo 1% (p/v) BSA e azida de sódio 0,02% (p/v)) para um volume total de 10 mL.
  2. Monitore os picos de emissão atômica Si 212,4, 251.6 e 288,2 nm para as amostras diluídas.
  3. Determine a concentração de Si nas amostras com base em uma curva de calibração.
  4. Para estabelecer o perfil de degradação de Si, expressa o conteúdo de Si em cada ponto de tempo como uma porcentagem do teor total de Si dos portadores (ou seja, o conteúdo de Si cumulativo ao longo do período de lançamento).
    Nota: Para garantir a exata quantificação do teor total de Si dos portadores, amostras de lançamento são amostrados mês 1 após o ponto final do lançamento do estudo e analisado para concentração de Si usando ICP-AES. Resumo do conteúdo cumulativo de Si ao longo do período de lançamento e o teor de Si nas amostras pós-libertação fornece a 100% do conteúdo de Si.

6. viabilidade e crescimento na presença de portadores de2 anos de NGF-carregado de celular

  1. Cultura de pilha do rato feocromocitoma (PC12)
    1. Prepare o suporte básico de crescimento, adicionando 10% cavalo de soro (HS), 5% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, estreptomicina de penicilina de 1% e 0,2% anfotericina para médio Roselle Park Medical Institute (RPMI).
    2. Prepare o suporte de diferenciação, adicionando 1% HS, 1% L-glutamina, estreptomicina penicilina 1% e 0,2% anfotericina para meio RPMI.
    3. Suspensão de células (106 células) em um frasco de cultura2 75 cm com 10 mL do meio de crescimento básico de crescer por 8 dias; cada 2 dias adicionar 10 mL de meio de crescimento básico no balão.
    4. Para gerar cultura diferenciada de células PC12, transferir a suspensão de células para um tubo de centrifugação; Centrifugue a células durante 8 min em x 200 g e RT. descartar o sobrenadante.
    5. Suspender as células em 5 mL de meio fresco crescimento básico e re-Centrifugar as células durante 5 min à x 200 g e RT; desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 mL do meio de crescimento básico.
    6. Para separar grupos de célula, Aspire as células 10 vezes utilizando uma seringa de 23 G.
    7. Contar as células usando um contador de células hemocytometer e semente 104 células/cm2 área de trabalho em placas de l revestido de tipo de colágeno na presença de meio de diferenciação.
    8. Após 24 h, adicione fresco murino β-NGF (50 ng/mL) ou portador de NGF-carregado PSiO2 por placa.
      Nota: Umas NGF concentrações mais elevadas (> 50 ng/mL) possuem o efeito exato que a concentração especificada.
    9. Renove o meio de diferenciação a cada 2 dias.
    10. Para avaliar a viabilidade celular, adicionar 10% (v/v) da solução de indicador de viabilidade (baseado em resazurina) em pontos de tempo representativo e incubar durante 5 h a 37 ° C; medir a absorvância a 490 nm, utilizando um espectrofotômetro.
  2. Cultura de células de gânglios (DRG) de raiz Dorsal de ratos
    1. Para isolar DRGs de dois camundongos C57bl de 7 semanas de idade, primeiro apague os ratos com 70% de etanol e fazer uma incisão para remover a pele.
    2. Corte a base do crânio e os músculos da parede abdominal até a medula espinhal é exposta.
    3. Remover a coluna vertebral, tornando-se um corte ao nível dos fêmures e limpar os tecidos circundantes.
    4. Corte a coluna em três partes; em seguida, corte cada pedaço na linha média para gerar duas metades e descascar para fora da medula espinhal.
    5. Sob o binóculo, extrair todos os gânglios DRG e mergulhe-os em solução salina equilibrada de um frio do Hank (HBSS).
    6. Limpar os tecidos conectivos circundantes por ansiar os DRGs sobre uma placa de Petri e remova cuidadosamente o meninges residuais sob o binóculo.
    7. Dissocia as células DRG incubando-os por 20 min em 1.000 U de papaína.
    8. Centrifugar as células para min 4 a 400 x g. Desprezar o sobrenadante e manter o centrifugado.
    9. Resuspenda o pellet em uma solução de dispase-II de colagenase e 12 mg/mL 10 mg/mL e incube por 20 min a 37 ° C.
    10. Centrifugar as células por 2 min a x 400 g; desprezar o sobrenadante e manter o centrifugado.
    11. Triture o centrifugado em 1 mL de HBSS, glicose de 10 mM e 5 mM HEPES (pH 7,35) pela passagem repetida através de uma pipeta Pasteur constringida.
    12. Delicadamente adicione as células dissociadas a médio L-15 contendo 20% de baseadas em sílica coloidal médio para separação de células por centrifugação gradiente de densidade; centrífuga para 8 min a 1.000 x g. Aspirar o sobrenadante e manter o centrifugado.
      Nota: O objectivo deste passo é separar e purificar as células neuronais de detritos axonal, células de Schwann e fibroblastos.
    13. Ressuspender as células em 2 mL do meio de F-12; centrífuga para 2 min a 1.000 x g; desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de meio de F-12.
    14. Contar as células e células de4 sementes 2 × 10 na poli-L-lisina e laminina revestido de vidro inferior 35 mm pratos da cultura, em um F-12 sem antibióticos suplementado com 10% FBS.
      Nota: Inicialmente, propagar as células em um pequeno volume de meio (150-200 µ l); após 2 h de incubação a 37 ° C, adicione médio para um volume final de 2ml.
    15. Delicadamente adicione o portador de2 anos de NGF-carregado ou fresco murino β-NGF (50 ng/mL) por placa.
    16. Depois de 2 dias, corrigir a cultura de pilha incubando-lo com uma solução de paraformaldeído (PFA) de 4% por 15 min em RT; a cultura de pilha usando uma comum imunofluorescência manchando procedimento31de delgados.
    17. A cultura de célula neuronal, usando um microscópio confocal de imagem.

7. análise de diferenciação celular

  1. Percentual de diferenciação de células PC12 na presença de portadores de2 anos de NGF-carregado
    1. Incube as transportadoras de2 anos de NGF-carregado em 2 mL do meio de diferenciação, numa incubadora umidificado a 37 ° C, contendo 5% de CO2.
    2. Cada 2 dias, recolher a solução e substituí-lo com 2 mL de meio fresco. Congelar as amostras coletadas lançamento em nitrogênio líquido e armazenar a-20 ° C para mais análises.
    3. Células PC12 semente 12-colágeno-revestido placas boas conforme as instruções na secção 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Após 24h, introduzir as amostras de liberação de pontos de tempo representativo (de secção 5.1.2) aos diferentes poços; para poços de controle, adicione novo murino β-NGF (50 ng/mL).
    5. Após 24h, imagem as células usando um microscópio de luz.
    6. Para determinar a porcentagem de células portadoras de axônio, manualmente contar células que tinham superado neuritos fora o número total de células nas imagens (n = 5 quadros para cada poço); Plotar um gráfico da percentagem de células PC12 com axônio consequência natural ao longo do tempo.
      Nota: Células indiferenciadas PC12 apareceram tem arredondados estrutura sem neuritos, enquanto células diferenciadas podem ser identificadas por consequência de neuritos (pelo menos um de comprimento mínimo igual ao diâmetro da soma da célula) ou alterações morfológicas.
  2. Análise morfométrica de células PC12 diferenciadas
    1. Para análise de processamento de imagem, adquira imagens de fase de pilhas cultivadas até 3 dias após o tratamento com NGF (como livre reagente ou como produto o lançamento das transportadoras2 anos NGF-carregado).
      Nota: Nos pontos de tempo mais tarde (além do dia 5) as células se desenvolvem redes altamente complexas, impedindo medidas morfométricas em uma resolução de célula única.
    2. Baixe o programa de processamento de imagem NeuronJ, um ImageJ plug-in, que permite um rastreamento axônio semiautomática e medição de comprimento.
    3. Converta o arquivo de imagem em um formato de 8 bits e pixel de medida, a proporção de micrômetro usando a barra de escala da imagem.
    4. Definir a escala usando o Analyze | Definir escala de comando e medir o comprimento de cada axônio.
    5. Manualmente, conte o número de pontos de ramificação e o número de neuritos provenientes de cada soma de célula.
      Nota: Um comprimento médio de axônio 1 dia após o tratamento de NGF é cerca de 30 µm. Os comprimentos medidos axônio podem ser amplamente distribuídos.

Representative Results

Filmes de PSi oxidados são fabricados conforme descrito no protocolo. A bolacha de Si é submetida a gravura eletroquímica por 20 s a 250 mA/cm2 (Figura 1ai), seguido de oxidação térmica a 800 ° C (Figura 1aii) para produzir um andaime de2 anos. Microscopia eletrônica de alta resolução de imagens (HR-SEM) do filme2 anos resultante são mostradas na Figura 1bc. Micrografia de vista superior do filme (Figura 1b) retrata sua natureza altamente porosa com poros de aproximadamente 40 nm de diâmetro. Micrografia de seção transversal de um filme clivada (Figura 1C) revela uma espessura de camada porosa de 2,9 µm, caracterizada pela interligação poros cilíndricos.

Os filmes de2 anos são carregados com a solução de carregamento, conforme ilustrado na Figura 1aiiiNGF. Carregamento de NGF é quantificado usando ELISA NGF medindo as concentrações de NGF na solução de carregamento, antes e após a incubação com os filmes de2 anos. A massa média do NGF carregado pela película de2 anos é determinada como 2,8 ± 0,2 µ g, que corresponde a uma carregamento de alta eficácia de 90% (w/w) (dados não mostrados31). A fim de estabelecer o perfil de liberação de NGF das transportadoras que2 anos, os filmes carregados são incubados em PBS a 37 ° C, e todas as alíquotas de 2 dias são colhidas amostras para quantificação da concentração de proteína liberada usando ELISA NGF. Além disso, o teor de Si nas amostras de lançamento é quantificado usando ICP-AES e a cinética de erosão de Si dos transportadores de2 anos é estabelecida. A Figura 2 mostra o lançamento do NGF e os perfis de degradação de Si correspondentes das transportadoras porosas. Uma liberação sustentada de NGF, sem efeito de explosão, é atingida por um período de 1 mês. Lançamento de NGF na primeira semana é mais rápido (inclinação = 0.442) em comparação com uma versão muito mais lenta em dias posteriores ao longo do período de lançamento (inclinação 0,043). Deve notar-se que, durante todo o período de lançamento de 1 mês inteiro, a quantidade de NGF lançado é suficiente para induzir profunda diferenciação de células PC12, como será discutido mais tarde. O NGF acumulativo lançado é encontrado para estar em uma boa correlação (R2 = 0,971) com o Si restante conteúdo, conforme a inserção da Figura 2.

Em seguida, a bioatividade dos transportadores de2 anos de NGF-carregado é caracterizada em vitro, células PC12 e DRG neurônios são usados como modelos para o crescimento e a diferenciação neuronal. Células PC12 e dissociada DRG neurônios são semeados conforme descrito no protocolo. Primeiro, a viabilidade celular na presença das transportadoras de2 anos é examinada incubando-se as células com puro (não carregado) ou anos NGF-carregado2; placas de controlo e de células tratadas com puro anos2 são complementadas com NGF livre cada 2 dias. Não citotoxicidade é observada após a exposição das células para as pura ou carregado NGF transportadoras2 anos (Figura 3a), demonstrando que os anos2 é biocompatível com esta linha de celular. Figura 3b mostra micrografias de HR-SEM representante de células PC12 tratadas com os portadores de2 anos de NGF-carregado. A característica de neuritos e formulário de extrato observadas células ramificadas redes neuronais. Resultados semelhantes são obtidos quando a semeadura dissociado células neuronais DRG na presença das transportadoras de2 anos de NGF-carregado. Imagens confocal de células DRG immunostained cultivadas com as transportadoras de2 anos de NGF-carregado (Figura 3e) mostram uma extensa axônio iniciação e alongamento, semelhante ao controle positivo (ou seja, os neurônios suplementados com livre NGF, ver Figura 3d), enquanto o negativo controlar (ou seja, os neurônios não tratadas, ver Figura 3C), apresenta uma extensão pobre da consequência natural do axônio.

Para avaliar o percentual de diferenciação de células PC12 na presença de NGF liberado das transportadoras que2 anos, a diferenciação é quantificada pela contagem de células com axônio consequência da população celular total. A Figura 4 resume os resultados em termos de percentagem de células diferenciadas em pontos diferentes do tempo ao longo de um período de 26 dias. Valores de percentagem significativa diferenciação são alcançados durante todo o período estudado. Nomeadamente, depois de 26 dias, o NGF lançado tem induzido por diferenciação de acima de 50%, uma percentagem de diferenciação que é significativamente mais alto em comparação com estudos anteriores com transportadoras baseados no polímero16. Estes resultados indicam que uma armadilha de NGF dentro do host porosa preservada a atividade biológica da proteína para induzir a diferenciação profunda por um período de ~ 1 mês.

Para continuar a analisar o efeito de NGF-anos2 transportadoras na diferenciação neuronal, três parâmetros morfológicos característicos das células PC12 diferenciados são medidos no nível da célula única: (i) o número de neuritos extrair o (soma II) de os totais neuritos comprimento e (iii) o número de pontos de ramificação. As células são tratadas com transportadoras de2 anos de NGF-carregado ou com administração repetitiva de NGF livre (a cada 2 dias), como um controle. Figura 5a -c apresenta a Análise morfométrica da população celular nos dias 1 e 3. As células PC12 tratadas com os anos de NGF-carregado2 mostram valores morfométricos, que são semelhantes para o tratamento de controle para todos os três parâmetros testados. Depois de 3 dias, os valores de todos os parâmetros morfológicos são observados para aumentar no mesmo ritmo para os portadores de2 anos de NGF-carregado e o tratamento de controle da administração repetitiva de NGF livre.

Figure 1
Figura 1: Fabricação de filmes de2 anos. (a) esquema de fabricação dos transportadores de2 anos: bolacha (i) silício é submetida a gravura eletroquímica por 20 s a 250 mA/cm2, seguido de oxidação térmica (ii) a 800 ° C para produzir um andaime de2 anos e (iii) NGF carregando adsorção física (esquemas não são desenhados para escala). (b-c) Micrografias de elétron vista superior e seção transversal de um filme de2 anos característico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Lançamento de NGF e perfis de erosão Si das transportadoras de2 anos carregado NGF. A extensão da degradação das transportadoras2 anos é apresentada como a fração do conteúdo restante de Si em cada ponto de tempo fora o teor total de Si, do filme poroso. A inserção mostra a correlação entre o NGF acumulativo lançado e permanecendo Si conteúdo. Erro barras representam SD, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Viabilidade celular e crescimento na presença de portadores de2 anos de NGF-carregado. (a) em vitro caracterização de citotoxicidade. A viabilidade de células PC12 é medida em 1, 3 e 7 dias após a sua exposição a puro (não carregados) portadores de2 anos, portadores de2 anos de NGF-carregado ou NGF livre (50 ng/mL a cada 2 dias, placas de controle). (b) elétron micrografias de células PC12 cultivadas com transportadoras de2 anos de NGF-carregado por 9 dias. Painel esquerdo: um zoom-in, retratando o axônio consequência da soma da célula; painel direito: um zoom-out, indicando a rede neuronal altamente complexa formado. (c-e) Imagens de microscopia confocal de immunostained DRG neuronal da pilha cultura (2 dias após a semeadura): (c) não tratada células; (d) células suplementadas com free NGF (50 ng/mL); (e), NGF-anos2 porta-aviões. Coloração imunofluorescente de Neurofilamento H permite que imagens de soma a célula e os neuritos outgrowing. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: PC12 células valores percentuais de diferenciação mediante exposição ao NGF lançado dos portadores de2 anos de NGF-carregado em pontos de tempo representativo. Percentual de diferenciação é expresso como o número de células com axônio consequência da população celular total. Tratamento de controle refere-se a células suplementadas com NGF livre (50 ng/mL). Imagens de microscopia de luz representativos das células nos pontos de tempo diferentes são representadas no eixo; barra de escala = 25 µm por micrografias dos dias 2, 8, 14, 26 e 50 µm para Micrografia de controle. Erro barras representam SD, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise morfométrica de células diferenciadas PC12. Três parâmetros morfológicos das células PC12 diferenciadas são medidos, a nível de célula única, no dia 1 e 3 exposição seguinte para portadores de2 anos de NGF-carregado ou administração repetitiva de livre NGF cada 2 dias (controle); length (b) número dos (um) total neuritos de neuritos extrair o célula soma e (c) número de pontos de ramificação. Erro barras representam SD, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Degradáveis nanoestruturados anos2 filmes são fabricadas e empregadas como transportadores para NGF, permitindo sua liberação contínua e prolongada, mantendo sua atividade biológica. O potencial dos2 anos para servir como um sistema de entrega para o NGF é demonstrada em vitro , demonstrando a sua capacidade de liberar a dosagem de NGF suficiente para induzir a diferenciação neuronal e promover a consequência natural de células PC12 e neurônios DRG. Filmes de engenharia podem ser usados como reservatórios a longo prazo do NGF para tratamento futuro em vivo.

As propriedades estruturais dos filmes fabricados PSi foram adaptadas especificamente para carga de NGF; a densidade de corrente do processo eletroquímico gravura foi ajustada para obter o tamanho dos poros de aproximadamente 40 nm, o que seria facilmente acomodar o NGF, uma proteína com um químico de 26.5 kDa32 e um diâmetro característico de ~ 4 nm33, dentro da matriz porosa. Além disso, oxidação térmica do cadafalso porosa foi realizada para habilitar a adsorção física de NGF por atração eletrostática da proteína carregada positivamente à superfície oxidada negativamente carregada de PSi. A química de superfície de PSi exerce um efeito importante sobre a eficácia de carregamento e pode ser facilmente ajustada a fim de melhor controlar as interações entre a carga e a matriz porosa. Essas interações posteriormente ditam a estrutura das moléculas de proteína adsorvida e sua Bioatividade34,35,36. Em conclusão, o sistema foi ajustado para obter a carga ideal de NGF seleccionando cuidadosamente o tamanho de poro adequado, características de superfície e o ideal de solvente e o efeito resultante da dita parâmetros mencionados carregamento o carregamento de proteína eficácia. Portanto, qualquer alteração nos parâmetros de fabricação (por exemplo, densidade de corrente, tempo de gravura, tipo e concentração do dopant ou eletrólito), química de superfície ou composição da solução de carregamento pode afetar a eficácia de carregamento e Bioatividade do carregado de proteína.

A taxa de liberação de uma carga do host2PSi orPSiO geralmente é ditada por uma combinação de dois mecanismos simultâneos, out-difusão das moléculas de carga e a degradação de Si andaime37. A erosão e a taxa de dissolução subsequentes são afetados pelo local de implante, sua patologia e doença estado28,38,39. Foi estabelecido em trabalhos anteriores que, se uma taxa de liberação de diferentes é necessária para uma certa aplicação terapêutica, o perfil de liberação pode ser modificado e prolongado, alterando a química de superfície do PSi superfície38,40, 41. Várias modificações químicas, tais como oxidação térmica, carbonização térmica e técnicas de hydrosilylation, foram mostradas para estabilizar a superfície PSi e afetar sua degradação e consequente carga lançamento35,42 ,,43,44,45. Além disso, um carregamento de NGF nas transportadoras por ligação covalente das moléculas de proteína para o cadafalso de Si através de várias rotas de química de superfície deve resultar em uma liberação mais prolongada, porque a carga só é liberada quando as ligações covalentes são quebrados ou o apoiando a Si matrix é degradado21.

Além disso, seguindo o seu processo de fabricação, PSi pode ser processado em várias configurações, além de filmes finos, tais como micropartículas46, nanopartículas47 ou autônoma membranas,26, que também pode ser empregada como portadores para NGF e necessidades específicas da aplicação conheça.

A fim de ser clinicamente relevantes, o conteúdo de NGF dentro das transportadoras de2 anos deve chegar o intervalo de doses terapêuticas. No método descrito no protocolo, os portadores de2 anos de NGF-carregado são introduzidos em um consistente volume de 2 mL de mídia do celular ou tampão PBS e, portanto, a concentração de solução de carregamento e a respectiva massa de NGF carregada foram ajustados para produzir um lançado o concentração de NGF que é relevante para o sistema testado em vitro . Ao utilizar este método para diferentes sistemas, tais como ambientes ex vivo ou na vivo , a concentração da solução de carregamento o NGF deve ser aumentada e ajustada de acordo com a dose necessária. Alternativamente, maior teor de NGF pode ser obtido através da introdução de várias transportadoras por área testada ou usando áreas maiores de amostras de2 anos.

Além disso, deve notar-se que, nos pontos de tempo posteriores ao longo do período de lançamento, as concentrações de NGF lançadas são muito menores que em pontos de tempo anteriores. O fato de que o fluxo de NGF não é constante ao longo do tempo deve ser considerado ao projetar o sistema de acordo com as necessidades da aplicação.

Entrega de NGF inúmeros sistemas foram desenvolvidos e relatados na literatura, a maioria deles são sistemas baseados em polímero, composto de polímero sintético ou natural conjuga10,11,12,15 , 16 , 17. estes sistemas têm mostrado eficazes liberação sustentada de perfis, no entanto, o período de lançamento, espalhou-se por um período de vários dias com um efeito de explosão significativa. Algumas destas plataformas de entrega sofrem limitações críticas tais como perda de Bioatividade sobre o processo de encapsulamento, que exigem o uso de diferentes estabilizador agentes18,48, bem como sofisticados e complexos técnicas de fabricação16. Um dos maiores desafios na concepção de sistemas de entrega para proteínas é a capacidade de preservar a bioatividade das moléculas em cima de uma armadilha dentro do sistema da transportadora. Proteínas ou peptídeos podem ser carregados em PSi/anos2 no RT ou mesmo a baixas temperaturas sem o uso de solventes orgânicos fortes, que são os dois fatores importantes ao carregar estas biomoléculas sensíveis. Estudos anteriores demonstraram que a química de superfície2 PSi/anos desempenha um papel crucial em minimizar possível desnaturação da proteínas carregadas35,36. Portanto, PSi/anos2 é um nanomaterial vantajoso para o desenvolvimento de sistemas de entrega para fatores de crescimento em geral e NGF em particular.

O trabalho atual está focado em utilizando este método como uma nova abordagem terapêutica para a administração direta de NGF para o CNS para potencial tratamento de doenças neurodegenerativas. Os portadores de2 anos de NGF-carregado podem ser implantados em cérebros de ratos e a eficácia da plataforma como implantes a longo prazo é estudado na vivo. Além disso, combinando este promissor transportadoras com não-invasiva biolistics49,50 pode habilitar um administrar as partículas de2 anos de NGF-carregado em uma resolução espacial altamente para uma área localizada usando um romance pneumático arma capilar para o tratamento de doenças neurodegenerativas, onde a administração de drogas spatiotemporal é necessária. Além disso, NGF pode direcionar o crescimento neuronal em um modo gradiente químico51, semelhantes às moléculas de orientação do axônio. Assim, os portadores de2 anos carregados podem servir como atrativo pontos quentes de NGF, para direcionar o crescimento, complementar ao outro diretor pistas52,53. Além disso, os portadores de2anos podem ser adaptados especificamente para sustentar a entrega de NGF para um período de tempo muito longo de até vários meses por mais tuning o nanostructure de2 anos e sua química de superfície.

Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Acknowledgments

MS e ES reconhecer os principais serviços e suporte de Lorry I. Lokey centro para engenharia e Ciências da vida e o apoio financeiro do Instituto de nanotecnologia Russell Berrie no Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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Projetar filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento do nervo
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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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