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爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離

doi: 10.3791/59018 Published: February 7, 2019

Summary

爬虫類、同種他個体から皮膚脂質は性的信号、外来種の管理で潜在的な使用のために重要であります。ここでは、小屋の皮または全体の動物から皮膚脂質の抽出のためのプロトコルについて述べる決定、総脂質量の分析とカラムクロマトグラフィー分画を用いた脂質を分離します。

Abstract

爬虫類仲間の追跡と評価を有効にするのには主に彼らの皮膚の脂質を用いた個体へ信号を送る。これらの脂質の分離では、地球生命の進化における脂質の防水の役割を理解することに加えて、化学コミュニケーションの進化のパターンとメカニズムに焦点を当てた研究ではユーティリティがあります。応用アプローチでこのような皮膚ベース手がかり野生生物の管理外来種への対処のための潜在的な使用があります。抽出、総脂質定量こと化合物精製溶出物の結果後者のプロセスを介してカラム ・ クロマトグラフィの分別などがここで提示されたプロトコルで爬虫類の肌脂質を定量化するための主な手順どちらかは化合物同定 (例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析法 [GC-MS]) を割り当てるために分析やより洗練された生物検定で直接使用可能です。皮膚の脂質は生活の皮膚から抽出することができます、無極性の有機溶剤 (例えばヘキサン、ベンゼン、トルエン) を使用して、皮膚、または死んで全体の動物を当てます。抽出の可溶性脂質、収量測定可能な脂質だけ抽出する溶媒を蒸発することができます。分別には、特定の波を介して伝統的なカラム ・ クロマトグラフィに総脂質抽出物の分離が含まれます。総脂質抽出物はまず基板ベースの列 (例えばアルミナ) 行き、個々 溶出物 (「分数」) 特定のボリュームで溶剤がの溶出が化合物脂質の混合物からのセットの列を順番に渡されます、一般的な極性に基づいています。非極性溶媒の極性溶媒 (例えば、ジエチル エーテル) の相対量を増やすことによって標準化されたシーケンスで極性の分数の進行状況。本稿では、爬虫類の肌脂質を抽出のいくつかの方法について説明し、従来のカラム ・ クロマトグラフィを使用して極性化合物の異なるセットを分離するための標準プロトコルを提供します。全脂質を抽出またはそこに化合物によって誘発される任意の生物学的活性を決定する、特定の分数の生物検定で使用できます。

Introduction

爬虫類は、表皮の皮膚細胞から直接、またはチームメイト評価と追跡、縄張り意識と内および種間の認識1,2 など、社会的なコミュニケーションで使用される個別の腺からの脂質を生成します。 ,3,4。これらの皮膚の脂質の分離に地球生命2,3 の進化における脂質の防水の役割を理解することに加えて、化学コミュニケーションの進化のパターンとメカニズムに焦点を当てた研究のユーティリティは、します。 ,4。さらに、多くの爬虫類、敏感な生態系に懸念の外来種であり、トラップと除去を向上させるフェロモン系ルアーの開発、継続的な5,6squamates (トカゲ, ヘビ)、特に。爬虫類皮の不浸透性脂質の化学的な信号の可能性がある強力な源の比較的純粋な抽出を取得するための抽出が容易になります。説明プロトコルで爬虫類の皮膚の脂質を定量化するための原則手順には、抽出、総脂質定量および列クロマトグラフィーによる分画1,6,7が含まれます。配偶者選択と選択、特にヘビ2についてはあまり説明生理活性物質の分離ようにメソッドを定期的に使用されています。

生きている肌、小屋の皮、または死んで全体爬虫類、非極性を使用してまたは極性有機溶媒1,7,8,9から皮膚脂質を抽出できます。それは、博物館の標本内のエタノールなどの溶剤が皮膚脂質の抽出のために最適ではない、唯一の新鮮なまたは冷凍新鮮な死体は、抽出のための可能な源として見なす必要があります注意してください。皮膚脂質いる不活性であり、安定した皮膚の表面と7を抽出しやすい。爬虫類生態学におけるシグナル伝達の役割で皮膚脂質手がかりがしばしば堆積する過酷な環境で、その堅牢な化学特性のためこのような手がかりは時間10,11の長期間にわたってその情報の価値を保持することが,12. 抽出プロセスは、-長い時間浸漬、脂質抽出7の測定可能な質量を残して、溶媒の蒸発が続く上 (例えばヘキサン、ベンゼン、トルエン) 無極性溶媒を用いた脂質を可溶性,8. 皮膚脂質が高い非極性溶媒に混和性と同様に多様なソースから幅広い炭化水素を抽出できます。

分別抽出よりもですが、特定の分数カラム ・ クロマトグラフィ、化合物の精製と同定そこに1,を支援するために総脂質抽出を区切るために6,7,8. 総脂質抽出物、基板ベースの列にバインドされ、個々 溶出物 (「分数」) 特定のボリュームで溶剤共通がある脂質の混合物からの化合物セットを溶出する列順番に渡される極性6,7,8。脂質クロマトグラフィーにおけるいくつかの極性の分数進歩は無極性溶媒中の極性溶媒 (例えば、ジエチル エーテル) の相対量を増やすことでシーケンスを標準化 (通常パーセントとして表現される: 0%、2%、4% エーテル、など。)6,7,8。個別より混合物を集中すると互換性のあるメソッドは、薄層クロマトグラフィー (TLC) は、単純な混合物で脂質を分離する使用ことができますよう、カラム ・ クロマトグラフィはクローズド システムを使用するための優先は、制御することができます簡単です。効率化のため多重化。本稿では、爬虫類の肌脂質を抽出のいくつかの方法について説明し、従来のカラム ・ クロマトグラフィを使用して極性化合物の異なるセットを分離するための標準プロトコルを提供します。化学手掛かりの分離を含む多くの研究プロジェクトの究極の目標にこれらの手がかりにさらされる受信機に影響する変更です。全脂質を抽出または任意の生物学的活性を誘発化合物によってそこに1,2,6,7を決定する、特定の分数の生物検定で使用できます。たとえば、基礎生物学的研究で、フェロモンの精製されたソースが分離されているし、ターゲット化合物の同定方法を追求できる研究者に特定の分数を用いた生物検定が明らかに。野生動物管理の観点から識別の目的、ないかもしれないし、トラップに同種の誘致または外来生息地13,14の追跡の仲間を阻害するフィールドでの活性画分を使用できる代わりに。

Protocol

脊椎動物の使用を含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアとジェームズ ・ マディソンの大学委員会を使用によって承認されました。

1. 抽出

  1. 肌色抽出を流す
    1. 頭とサンプルを汚染することができます排せつのセクションを削除する単一の爬虫類から約 30 cm2小屋を収集します。クロロプレン手袋を着用し、破片の小屋を掃除します。
    2. 風袋、バッグとのバランスやボートの重量を量る小屋 (± 0.01 g) の重量を量る。
      注: 質量精度、バランスの精度によって決まります。小屋の皮質量は抽出された皮膚脂質質量 (下記参照) の標準化係数と有意抽出した脂質 covaries 質量。
    3. 小さい (5 cm2) 部分に小屋を分離し、(例えば、金属蓋付きガラス石工の jar ファイルまたは PTFE ふた付きラボ フラスコ) ヘキサン互換ふた付き密閉ガラス容器にそれらを追加します。小屋の皮膚部分が完全に水没するコンテナーに十分なヘキサンをデカントします。容器を密封します
      注意: ヘキサンは、引火性呼吸刺激、いくつか短期および長期健康への危険と関連付けられる。ヘキサンを含む手順は、適切な個人用保護具 (PPE) (例えば、スプラッシュ ゴーグル、クロロプレン手袋、長袖、先の閉じた靴) を着用しながらヒューム フード (研究室) や屋外 (フィールド) で実行されます。
    4. 鉛筆や耐溶剤性ペンでコンテナーのラベルを付けます。室温オーバー ナイトまたは最大 24 h で発煙のフード コンテナーをまま。
    5. きれいな金属鉗子やトングを使用して小屋部分を削除します。コンテナー内の任意の残りのヘキサンを保持する部分を振る。紙タオルの上に乾燥肌の部分を許可します。その後、それらを捨てます。複数の抽出が行われている場合は、各サンプル間トング/鉗子をクリーニングします。トング/鉗子をきれいに 〜 50 mL のビーカーにヘキサンでそれらをすすいでください。
    6. 抽出物は、すぐに使用することは場合、デカントまたはピペットの適切なボリュームのバイアルに抽出、PTFE ライニング キャップ シール、ラベル、-20 ° C で保存
      注意: 抽出物には、ヘキサンが含まれている、ために、防爆冷凍庫でバイアルを保管します。
  2. 死者全体の動物の抽出
    1. 個体数を記録 (SVL; センチメートル)、質量 (グラム) で動物。皮膚表面積の単位総脂質またはフェロモン生産を決定する場合は、仕立て屋の巻尺を使用して (センチ) の最大本体周囲を取得します。
    2. 抽出、動物の長さの 1/3 の直径を持つコンテナーを選択します。頭の上に総排出腔と容器の底にしっかりと死体の位置。体の水中の表面積を最大化するコンテナーに十分なヘキサンをデカントします。
      注: 場合は頭や総排出腔は、抽出の時間の任意の金額を水中になる、注意してください。
    3. 蓋を固定、容器にラベルを付けるし、室温一晩または最大 24 h で発煙のフードで浸します。
    4. 死体を削除する場合は、きれいな金属鉗子やトングを使用します。頭や尾からではなく、体から点滴することによって、コンテナーで死体に残留ヘキサンを保持します。容器を密封します
    5. 抽出物は、すぐに使用することは場合、エキスをデカントまたは適切なボリュームのバイアルにピペット、PTFE ライニング キャップ シール、ラベル、-20 ° C で保存

2. 脂質定量法

注: 抽出された脂質質量は 2 つの方法のいずれかで決定することができます: ガラスの瓶や丸底フラスコ、ロータリーエバポレーターを使用しています。

  1. 抽出された脂質質量を介してガラス瓶メソッドを決定します。
    1. (7 mL、22 mL、50 mL、) に十分なサイズの preweighed バイアルを使用します。総質量は、キャップ、ラベル、または常にキャップとラベルなしバイアルの重さ (ラベルのマーキングも追加質量)。水との接触を避けるために、フラスコの首にラベルを配置します。
      注: ガラス瓶で蒸発は、研究者は、複数のバイアルを同時に、N2ストリームの下に蒸発するガス吸気システムへのアクセスを持っている場合効率的です。
    2. 抽出物をバイアル、ゴム球にまたは、大量抽出物、ガラス ピペットを使用して使い捨ての 10 mL のガラス製ピペットと電子ピペット コント ローラーに転送します。同様のバイアルに 〜 3 ml のヘキサンと転送のコンテナーをすすいでください。
    3. 穏やかな N2流れの下でサンプルを蒸発させます。最大溶媒表面領域を有効にする角度でバイアルを傾けます。ヘキサン蒸発と凝縮はバイアルの外側になります。
      注: ヘキサンが蒸発する脂質のリングをバイアルに形成されますので定期的に抽出物を旋回します。
    4. 乾燥のサンプルを蒸発させるその後、reweigh。全脂質の収量を記録します。
      注: 異なるグループ間解析、標準化、脂質大量のいずれかの質量を流す (100 x [グラム] の小屋の質量で割った値 [グラム] の脂質質量収率小屋のパーセント脂質質量) または動物の SVL (脂質 [ミリグラム] で割った質量 [SVLセンチメートル];単位長さあたりの脂質質量が得られます)。大きい動物がより脂質を生産し、多くの種が強く性的に二形、データの偏りを課しています。
  2. 抽出された脂質質量を介して回転蒸発器を決定します。
    1. 個々 のサンプルあたりより速い蒸発、抽出物を preweighed の丸底フラスコに転送、ロータリーエバポレーターを使用してそれを蒸発させます。
      1. 粉じん抽出物の顕著な場合は、; フラスコの首にフィルター ペーパー コーンを置くことによってサンプルをフィルターします。抽出液をフラスコに転送し、重力フィルターへを許可します。フィルター紙による抽出が転送された後処分します。
        メモ: サンプル ボリュームを転送 (~ 80% フラスコ ボリュームまで) 回転蒸発する前に。回転蒸発器のコンデンサーに抽出のすべてのバブル汚染し、洗浄するコンデンサーが必要です。泡や「バンプ」はほとんどのサンプルで発生した場合、フラスコとコンデンサーの首の間バンプ トラップを配置できます。
    2. 回転蒸発器と水お風呂の電源を入れます (50 ° C; 溶剤の沸点より低い)。コンデンサーに冷水の流れを入れます。
      注: 回転蒸発器のコンデンサーは、循環冷却またはドレインにガス抜き冷水蛇口に接続されます。流量は水がフラスコに出入りコンデンサー溶媒蒸気を凝縮して、周囲より涼しい低速することができます。
    3. 真空源 (水真空ポンプ) を入れます。コンデンサーの首にフラスコを保持するために十分な真空圧力を確認します。フラスコを接続する前に、コンデンサーの端に口を開きます。コンデンサーの首にフラスコをスライドさせ、密封し、フラスコが離されたときにコンデンサーから切断できません、フラスコを確実に口を閉じる。
    4. 〜 50% がお風呂に浸漬するまでフラスコを下げます。中速でフラスコの回転を開始します。真空、速度、コンデンサーの流れ、風呂の温度が最適で、フラスコを残して溶剤蒸気はコイルに凝縮され、回復フラスコに滴下されます。
      1. サンプルが沸騰する場合 (例えば気泡、急速な毒ガス攻撃)、すぐに真空および/または回転蒸発器の速度を減らします。沸騰が続く場合フラスコ回転をオフにする、真空をオフにする、お風呂からフラスコを上げるし、真空シールをリリースします。2.2.3 と 2.2.4 の手順を繰り返します。
        注: 回復フラスコに溶媒を収集しない場合は、抽出は、明らかに蒸発、真空は、最も可能性の高い最適でないと再調整する必要があります。
    5. 〜 2 mL のフラスコ (大量抽出物)、溶剤のまままで、真空下でのサンプルを蒸発させるまたは、液体のビードまで蒸発 preweighed フラスコを使用している場合、< フラスコの底に 1 cm の直径が表示されます。電源を切り、回転真空;その後、風呂からフラスコを上げます。
    6. シールが解放される真空フラスコの首を保持します。その後、コンデンサーからスライドする首をねじる。大容量フラスコを使用している場合表示される脂質を溶解するフラスコに濃縮エキスを旋回します。その後より小さいボリューム、preweighed フラスコにピペットソリューションを転送します。大きなフラスコを洗い、それを旋回、小さいフラスコにピペット、再び蒸発するヘキサン 3 mL を追加 (手順 2.2.3 - 2.2.5)。
    7. ヘキサン蒸発、抽出物の液体のビードを固めます。一度乾燥し、部屋の温度に達することができます。脂質は、フラスコ (~ 5 分) で黄色の蝋に半透明、白になります。最終的な質量を取得するフラスコの重量を量る。
      注: によって、脂質の性質上、彼らが (例えばワックス) 固体または半固体 (例えば原油) プロパティ (下記参照) 分画の脂質が蒸発した場合は特に。
  3. ヘキサン ヘキサン 1 mL あたり脂質の ≥ 1 mg をもたらすための記録量の脂質を可溶化します。クロマトグラフィーに進行中の作業量は、~ 5 mL です。バイアルにフラスコから転送する場合は、抽出物の大半をバイアルに転送した後、フラスコを洗浄する総量の 2 mL を保持します。
  4. バイアルのラベル、キャップ、PTFE ライニングとそれらを封印、-20 ° C で保存

3 カラム ・ クロマトグラフィ

注: 特定の分数、抽出された脂質極性に基づく未知の化合物を分離するには、質量液体クロマトグラフィーカラム ・準備に追加することができます、標準的な溶出を使用して分別します。

  1. カラムの準備
    1. 抽出脂質質量に応じてテフロン活栓と大 - または少量ガラス クロマトグラフィー コラムのいずれかを使用します。列が装備または固定ボリューム貯水池 (大きな列 500 mL; 小さな列用の 250 ミリリットル) に溶けます。今後は、このプロトコルはのみ貯水池に融合した大容量カラムを指します。新しいガラス製品、4 章で説明されているように、クロマトグラフィーで使用するパーツを徹底的に掃除します。その後、ヘキサンまたは他の非極性溶剤でそれらをすすいでください。
    2. ガラス繊維のウールの部分を隠す (長さ [L] x 4 〜 14 cm 幅 [W] で cm) ~ 4 cm × 4 cm の正方形が形成されるまで繰り返し。木の合せ釘の棒の列より長いを使用して、列の下部にガラスを配置します。
    3. 2 つのクランプ (例えば、回転またはモジュール) で標準的なリング スタンドに、フード、活栓上記と貯水池の首の下に 1 つの列を固定します。レベル列。列の下に簡単に合わせて 500 mL ビーカーに十分な作動距離を許可する高さで列の位置。活栓を開きます。
    4. 洗浄を注ぎ、ガラス繊維上にかかっている砂の ~ 3 cm までの列に砂を乾燥させます。列の下黒または暗い色の紙を置き、それを軽きます。場合は、すべてのタップと列から砂に落ちる、グラスファイバー バリアは十分ではありません。3.1.2 - 3.1.4 の手順を繰り返します。
      注: は、底からグラスファイバーをフェッチするのにダボ ロッドの端にテープで伸ばしたペーパー クリップを使用します。
    5. 列の下 500 mL ビーカーを置きます。砂を濡らす列貯水池にデカント 〜 25 mL のヘキサン 100 mL ビーカー、メスシリンダーからがゆっくりと。砂の上のヘキサンの ~0.5 cm がある場合は、活栓を閉じます。
    6. 中性アルミナを重量を量る。~ 50 g; を使用して、各の小さな列〜 大規模な列ごとに 175 g。アルミナを 1 L の三角フラスコに注ぐ。1 L フラスコあたりアルミナの 400 g を制限します。
    7. アクティブ化、(活動 III) アルミナ、アルミナの 6% に等しい量の脱イオン水をピペット質量 (すなわち、アルミナ、100 g の 6 mL の水を追加します)。アルミナ中の滴と水を追加します。
    8. アルミ箔やコルクとフラスコをカバーします。積極的に旋回 (振らないで) 電荷を均等に分散します。目に見える塊がなくなるまで続行します。
      注: 予想されるアルミナと水が反応してフラスコを暖かくします。
    9. アルミナ上のヘキサンの ~0.5 cm で、アルミナが完全に覆われるまでヘキサンを追加します。スラリーを形成するフラスコを旋回します。
    10. 列と列の下に 500 mL ガラス製ビーカーの貯水池に出された漏斗を配置します。活栓を開きます。アルミナを旋回し、着実に列に注ぐ。列と大きな気泡なしで均等に定着しつつある、アルミナ、アルミナのカラムに亀裂を形成していることを確認します。均等にアルミナを解決する列の側を軽くたたきます。
      注: 追加のヘキサンはスラリーを維持するために、追加の注ぐの追加する必要があります。ガラス製ビーカーは、開始時にきれいだった場合、列の下のビーカーに集めるヘキサンを再利用できます。
    11. アルミナのトップが安定と貯水池の基地で列の首の下に ~ 4 cm、列が形成されます。ヘキサン残留アルミナで貯留層の内部を洗浄するのにピペットを使用します。目標到達プロセスを使用して、優しく貯水池下 ~ 1 cm に、アルミナの上に砂の 2 番目の層を追加します。
      注: ヘキサンは、活栓が開いたままになる列から流れます。列を乾燥をさせてください。列が乾く、3.1.2 に再び、プロセスする必要があります開始。プロトコルは、列分別前日ならここで停止できます。しっかりと貯水池の上にコルクを置くかアルミホイルでしっかりとそれをカバーします。〜 100 ml のヘキサンのリザーバーします。活栓を締めます。
  2. 脂質抽出物の分別
    注: 列のサイズに関係なく脂質抽出画分個別に収集でき任意の知られている/識別対象の化合物が含まれていない場合、分数極性に基づいてまたは破棄されたを完全にプールします。レプリケート溶出のラウンド (n = 3 つの容積) 脂質の十分な溶出を確認する列を介して渡されます。大きな列溶出のテーブル 1に従う (エキス、質量 > 30 mg) または小さいコラム溶出 (エキス、質量 < 30 mg)。メチル ケトンだけを隔離するため合わせた溶出プロトコルは、表 2には。
    1. 大容量ピペットを使用して、列の上部に残りのヘキサンを削除したり、点滴をきれいなビーカーにヘキサンを設定できます。〜 3 mL のヘキサン、列の上部に砂の上を残します。
      注: 収集したヘキサンは純粋なきれいなガラスに連絡だけで、最初の分数でリサイクルすることができる場合です。
    2. 長いガラス ピペットを使用して、列に脂質抽出物を転送します。ゆっくりと砂の層を脅かさないよう抽出をピペットします。抽出バイアルまたはヘキサンの ~ 5 mL のフラスコを洗い、列に転送。
      注: 抽出は-20 ° C で保存されている場合、脂質は促進されます。これ以上沈殿物が表示されるまでは、バイアルを温めます。
    3. 活栓を開き、列に読み込むサンプルを許可します。抽出に腫瘤がある場合 (> 30 mg)、黄色バンドはアルミナ、上部に砂のすぐ下に表示されている可能性があります。このヘキサンはきれいな、もはや廃棄物ビーカーに流れを収集します。〜 3 mL が砂の上に残っている場合は、活栓を閉じる。
      注意: 脂質エキス、アルミナと列にバインドされたは乾くことはできませんまたはサンプルが失われます。
    4. 最初の分数を注ぐ前に、列の下に preweighed とラベル付き丸底フラスコ (100 mL、250 mL または 500 mL) を配置します。破棄する分数は、一般的なガラス容器で収集できます。
    5. 最初の分数を準備 (100% ヘキサン: 0% ジエチル エーテル [これまで、「エーテル」])、メスシリンダーで。場合は、分数、事前に箔でカバーかコルクで栓を準備しています。
      注: 分数進歩極性;したがって、シリンダーは、分数の間洗浄する必要はありません。
    6. 注ぐ経由で出されたガラス漏斗による貯留層に最初の分数は砂層を妨害を避けるために貯水池の側に指示を追加します。溶出を開始するバルブを開きます。〜 3 mL のヘキサンが列の上部に砂の上に残っている場合は、活栓を閉じる。
      注: は、溶出液の大部分を収集されている前に、活栓を閉じることによって個々 の分数内溶出をやめない。分数、間 ~ 1 h を超える品質と再現性、溶出の遅延を変更できますので閉鎖活栓を放置しないでください。
    7. 3.2.4 - 分数 2 と 3 の 3.2.6 の手順を繰り返します。分数がプールされている場合は特に、回転蒸発のヘッド スペースを許可する適切なサイズのフラスコで分数を収集します。
    8. 第 4 回分数 (2% エーテル) を準備し、貯水池に追加。列の下次のフラスコを置き、活栓を開いて 4 分を収集します。5 端数を準備します。その後、必要に応じてを続行します。
      注: 連続した画分を集めながら回転蒸発を介して最初 fraction(s) を蒸発させるため不可能です。
    9. ガスクロマトグラフィー質量分析で使用する分数を準備して、0.01、0.1 mg の精度のバランスを使用して分数質量を取得します。ヘキサン 1 mL あたり脂質の 1 mg を生成する脂質画分を可溶化します。

4. クリーニング

  1. 活栓を開いたままにして、廃棄物ビーカー内の列を反転します。アルミナと砂列がなくなるまた、プロセスを促進するために振る。それがスタックしている場合、ガラス繊維のウールをフェッチする 396209 ロッドを使用 (ガラスに傷を付けない) または N2ストリームにそれを吹き消します。
  2. (髪やプラスチック毛) のガラス ブラシとプラスチック製の浴槽でお湯で研究室グレードの洗浄剤を使用して、すべてのガラスをきれいと。3 x を洗います。ガラスがもはや接触に滑らかになるまで沢山の暖かい水で十分にすすぐ。
  3. ガラスを洗い、脱イオン水で 3 倍のツールします。風乾するラック上に置きます。乾燥を加速する追加少量ガラスにアセトン (3 mL)、旋回と空気乾燥または、N2ストリームで実行ことができます。

Representative Results

次の抽出、総脂質質量がここで提示されたプロトコルを介して取得することができますデータの最初の型。ただし、総脂質質量値はいくつかの試みが得られた値を標準化することがなく決して分析する必要があります。いくつかのアプローチを使用することができます、しかし、どちらか抽出された脂質質量 (センチ) で動物の SVL または抽出された小屋の皮の固まりを標準化することをお勧めします。前者では脂質質量あたり長さの値、後者はソースの割合になります質量。標準化の理由は、彼らはよりトータル皮膚の表面積を持っているのでより大きい動物自然より多くの肌脂質を生成です。図 1 aの質量を持つ直線抽出皮膚脂質の質量スケールが抽出した肌を当てる、この協会を例示しています。合計小屋皮膚質量標準化、この線形関係は完全に削除されます (図 1 b)。

次の分別、留分 (図 2) の固まりと同じ標準化アプローチを使用できます。このサンプル データ セットに各分画はありませんを均等に抽出された脂質質量: 中性脂質 (分数 1-3) より極性脂質 (分数 4-6、7-9、10-12) の各セットと比較して質量の割合による化合物の支配的なセット。

Figure 1
図 1: 間の関係抽出脂質質量と入力素材。(A) 爬虫類の合計小屋関係皮膚の質量と抽出された皮膚脂質質量は正の相関関係 (P 0.001 <)。(B) とき抽出皮膚脂質質量の合計質量を流す標準化された (脂質小屋で割った質量質量)、この関係が存在しない (P = 0.46)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 次の溶出割合大衆を標準化します。カラム ・ クロマトグラフィを使用すると、皮膚脂質抽出物が化合物の極性に基づく分数に溶出することができます。分数質量、総脂質抽出物 (分数質量 [ミリグラム] で [ミリグラムで総脂質抽出物の質量で割った値) の比率で表されます、分数の間または実験の違いは、8をグループ化を決定します。バーは、手段を表します。最上位のエラーは、SEM;下部のエラーは、95% 信頼区間です。個々 のデータ ポイントは、わかりやすくするため提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: メチル ケトン分数の代表的なガスクロマト グラフ。(A) 適切な溶出メチル ケトンテーブル 2から 7 画分で最も豊富な化合物、ピークの対句として見なすことができます (保存期間 = 24 34 分)。ただし、(B) 分画 6テーブル 2、のみ非標的化合物が得られます。これと同じ結果は、移動相の極性溶媒の期限が切れている場合、または列が長期間停止した場合に発生する可能性が (> 1 h) 分数の間。2 つのトレース間の分子豊富の違いに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

分数 ヘキサン (mL) ジエチル エーテル (mL)
1,2,3 100 [30] 0 [0]
4,5,6 98 [29.4] 2 [0.6]
7,8,9 96 [28.8] 4 [1.2]
10,11,12 92 [27.6] 8 [2.4]。
13,14,15 84 [25.2] 16 [4.8]

表 1: 皮膚脂質分画の標準的な溶出ボリューム。溶媒のボリュームと割合大ボリューム (例えば、250 mL) と [少量] (例えば、100 mL) ためにアルミナ (活動 III) を用いたクロマトグラフィ用カラムを与えられます。ヘキサンはキャリア溶媒;ジエチル エーテルは、モバイルのフェーズです。

分数 ヘキサン (mL) ジエチル エーテル (mL) ノート
1, 2, 3 30 0 溶出します。収集しません
4、5 28.8 1.2 溶出します。収集しません
6、7、8 28.8 1.2 個別に収集します。メチル ケトンの大半質量割合 7; になります6 と 8、ケトンの適切な溶出を確保するために GC MS 品質管理チェックを実行します。

表 2: ガータースネーク メチル ケトンの変更された溶出スキーム。これらのボリュームは、使用少量のカラムと現在入手可能なアルミナのブランド。メチル ケトン陽性溶出画分は、求愛男性ガーターヘビ17野生のフィールド試金の強い生物活性。メチル経由でGC さん行い 1 mg/mL に希釈することができますターゲット分数、サンプル中のケトンの存在を確認するには、は、図 3は、正と負の結果を次の溶出の代表的なクロマト グラムを示します。

Discussion

爬虫類の皮膚脂質の抽出は、小屋の皮、このテクニックの実験用途の多様性を提供するだけでなく、生活や死者の皮膚に適用できます。さらに、幅広い生物学者2,13にメソッドの動的なアプリケーションを有効にする、フィールドで皮膚脂質の抽出を行うことができます。皮膚脂質の抽出は簡単です。したがって、抽出実験や設計のあたり、必要に応じて拡張する簡単だし、メソッドの実行に重要な専門知識が必要な実務家。スケール アップのための唯一の制限要因は、ヒューム フードの空席状況、きれいな、密閉式のガラス製品、溶剤ストレージ ・ スペースの豊富さです。

皮膚脂質抽出分画は研究者のニーズに合わせてすることができますそして、したがって、脂質の抽出する同じような柔軟性があります。たとえば、中性脂質を溶出し、関心の化合物の浄化、生物検定を簡素化したターゲット分数のため、破棄できます。分別は、複数の縮尺内および脂質のサンプル間で実行できます。たとえば、プロセスをより効率的に複数の列を同時に実行できます。または、総脂質抽出物の部分だけはしたがって、試薬および時間を倹約する小さい列に分別できます。分別は主に総脂質抽出物の質量と研究者に利用できる機器の精度によって制限されます。たとえば、質量、したがって研究者に 10.0 mg 精度、端数の決定とバランスがある場合ガスクロマトグラフィー質量分析のための試料の前処理の精度は大幅にいない場合は、完全に阻害します。ガラスの場合も同じです。研究者分別の大ボリューム列が分離する小さな総脂質質量場合、溶出したり、化合物の分離が進行するが、溶剤、試薬、時刻、および可能性のある、ターゲットの重要な消耗が必要になります自分自身を化合物します。

表 2で見られるように溶出スキームを決定する前に品質管理チェックを実行し、どのような分数を破棄可能性がありますを決定するをお勧めします。列必要な脂質の溶出を確認するには、ことができます実行各分画、1-15 が個別に収集され、分析され、使用する GC MS。図 3に代表的なガスクロマト トレースを見るとガーターヘビからメチル ケトンが特定の割合の列からのみ溶出します。この品質管理手順を実行すると、興味の化合物の最大収量を確保するため特定の種の変更された溶出スキームを開発できます。サプライヤーやアルミナのロットまたはジエチル エーテルの年齢など、材料の変更は品質管理テストの実行によっての制御されるべき溶出の違いで絶対になります。

説明した手法は、主に得ることができるキューの化学的性質によって制限されます。主に、これらのメソッドは、分離し、爬虫類の皮膚から長鎖脂質を分離する研究者をのみ許可します。爬虫類の多くの種、化学的な信号として空中やタンパク質の手がかりを使用して記述されているメソッドは当該合図を分離すると互換性がないです。さらに、無極性の溶媒が爬虫類の表面や豊富な化学信号を含めることができます確かにキュー沈着量 (例えばケージ水、糞便、水生基板) のソースから水性の手がかりを抽出できません。手がかりのこれらのタイプを取得するための適切な方法が (例えば固相固相マイクロ抽出 [SPME] 揮発性キューとキューの水性高性能液体クロマトグラフィー [高速液体クロマトグラフィー]) の研究者に利用できる方法のように上記で説明した、技術的な学習曲線があります。

最も重要なは、研究者に最終的な化学混合物の有用性は、使用方法を導くべきであります。例えば、研究者は、男性焦点動物男性女性異性対象生物検定によって生成されるキューを区別できるかどうかを知りたいと、抽出は唯一の方法は、23を必要なです。ただし、抽出は特定の分子または分子による化学分析の1、グループ識別子を割り当てることで大きな自信を有効に浄化されるすべき場合、目的である性的に二形の化合物の同定 6,9,11。ただし、脂質ソース クロマトグラフィーを行うも、抽出を開始の重要な質量が必要、測定可能な割合の固まりを得ることができる;それ以外の場合、サンプルのプーリング追求できる、最適な14ではありません。

このプロトコルの将来の発展には活用しより爬虫類種の手順を適応するための措置が含まれます。皮膚の脂質を抽出追加非侵襲的方法も開発されています。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

これらのメソッド、特に小屋皮膚脂質抽出の開発は、ジェームズ ・ マディソン大学 (作る) と米国農務省の動物の間の協力協定 (14-7412-1061-CA、15-7412-1155-CA、および 16-7412-1269-CA) 中に発生しましたおよび植物の健康点検サービス (APHIS)。M.R.P. 小屋肌メソッドの開発に次の学生の貢献を認め: s. パテル (ワシントン ・ アンド ・ リー大学 [WLU])、j. Zachry (WLU)、r. フローレス (作る)、j. ノル (作る)、s. アシュトン (作る)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

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References

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爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離
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Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

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