Summary
פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.
Abstract
מהמם הצטברות רקמה של תאים חיסוניים מופעל מאוד מייצג סימן היכר של מחלות דלקתיות כרוניות שונות, הגיח יעד אטרקטיבי טיפולית בתחום ניהול קליני של חולים מושפעת. כדי לייעל עוד יותר אסטרטגיות מכוון טיפולית רגולציה של רקמות באופן פתולוגי מאוזנת חדירה של תאים חיסוניים הפרו דלקתיים, זה יהיה בעל חשיבות מיוחדת כדי להשיג שיפור תובנות לתוך המחלה איברים ספציפיים או תכונות ביות של לימפוציטים היקפיים. פרוטוקול הניסוי המתואר כאן מאפשר לעקוב אחר ריאות הצטברות של לימפוציטים אנושיים fluorescently שכותרתו, הועבר adoptively בהקשר של דלקת ריאות הנגרמת פפאין. בניגוד מבחני הפריה רגילה תכוף לניתוח של נדידת תאים חיסוניים ו כימוטקסיס, ההגדרה ויוו עכשיו הציג לוקח בחשבון ספציפי ריאות היבטי בארגון רקמות ואת ההשפעה של המתחם דלקתיות תרחיש מתרחשים האורגניזם החי מאתר. יתר על כן, קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך תלת מימדי הדמיה מיקרוסקופיים אינם מספקים נתונים כמותיים על הסתננות התאים החיסוניים, אבל גם מציג את הדפוס של תאים חיסוניים לוקליזציה בתוך הריאה מודלק. בסך הכל, אנו מסוגלים להכיר טכניקה חדשנית בעלת ערך גבוה עבור אימונולוגי במחקר בתחום מחלות ריאה דלקתיות כרוניות, אשר יכול להיות מיושם בקלות על ידי ביצוע פרוטוקול צעד אחר צעד שסופקו.
Introduction
הפרעות דלקתיות קלאסי של הריאות, כגון אסטמה אלרגית, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ידועים היטב כדי להיות מונע על ידי גיוס מוגבר לימפוציטים מופעל לתוך רקמת הריאה1,2. ציטוקינים שפורסמו לימפוציטים (למשל, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ ו- TNF-α) לקדם כימוטקסיס של תאים חיסוניים מולדת, גמישים, זירוז שיפוץ שהותירה דרכי הנשימה או ישירות לנזק parenchyma הריאה2. עד כה, המנגנון הבסיסי אחראי הצטברות פתולוגי של לימפוציטים בתוך רקמת הריאה אינם עדיין לגמרי מובנים. בהשוואה כדי החתמה תא T סלקטיבי רקמות המתוארות עבור יונת במעיים, עור, ריאות תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים כמובן פריים היקפיים בתאי T ריאות מועדף חדירה, לפחות חלקית דרך אינדוקציה הביטוי CCR4 על פני השטח של לימפוציטים3. חוץ CCR4, הסתננות דרכי הנשימה תאי T מאופיינים גם ביטוי מוגבר במיוחד של קולטני כימוקין CCR5, CXCR3 לעומת תאי T בתוך4,1,5דם היקפיים. באופן כללי, קיימים נתונים עקביים עם הרעיון כי הריאות יונת של לימפוציטים מסוג T בתנאים פיזיולוגיים או דלקתיים כרוך במספר רצפטורים שונים כימוקין ליגנדים בהתאמה שלהם, ובכך מכרעת תלוי מקרוב נשלט שיתוף פעולה בין תאים חיסוניים מולדת, מסתגלת1. במיוחד, בשלב הראשוני של חשיפה פתוגן או אלרגן, תאים של מערכת החיסון המולדת להגיב TLR גירוי או cross-linking בתיווך IgE על ידי שחרור מיידי של chemoattractants שונים, כמו LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 ו- PGD21,6,7. בתור דוגמה, האינטראקציה בין PGD2 הקולטן chemoattractant CRTh2 ידוע שיש חשיבות מיוחדת עבור כימוטקסיס תאי Th2 והופיע ובכך מבטיח כמו מטרה טיפולית ניהול קליני של אסטמה. אכן, חולי אסטמה מתונה הראה שיפור בסימפטומים, עלייה משמעותית של אמצעי האחסון expiratory בכפייה בשנייה אחת (FEV1) לאחר הטיפול עם אנטגוניסט CRTh2 סלקטיבית לעומת פלסבו קבוצה8 ,9. במצב יותר שהתמשכו של תגובת דלקתית, תאי T וגייסנו כבר מסוגלים להגביר עוד יותר לימפוציטים ריאתי הצטברות באמצעות השחרור של IL-4 ו- IL-13 בתור לגירויים חזק עבור בקרי התחום ריאתי. לאחר מכן, אלו תאים מולדת מיאלואידית נגזר למעלה-לווסת את הביטוי של CCL17, CCL22 STAT6 תלויית האופן1,10,11. למרות המורכבות של התרחיש המתואר מעכבת עדיין הבנה מלאה של תא T ריאות ביות, המלון מציע שפע של מטרות מולקולריות עבור פקד טיפולית פוטנציאל אופטימיזציה של מחלות דלקתיות או אלרגיות. לכן, יש צורך דחוף של טכניקות חדשניות ניסיוני, אשר מסוגלים להעמיק עוד יותר ולהשלים את הידע שלנו בתחום של תא T כימוטקסיס, יונת ריאות.
בשל העובדה כי יונת ריאות של לימפוציטים בתוך גוף האדם מושפע על ידי פרמטרים הסלולר, ההורמונאלית והפיזי מספר1, מרבית השיטות ניסיוני הקיימים אינם מסוגלים דגם כל המורכבות של תהליך אימונולוגי. במקום זאת, רבים פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח של הריאה ביות באופן סלקטיבי להתמקד על היבט מסוים מעורב המפל של לימפוציטים משיכה, הדבקות, העברה ושמירה. מלבד החלטה תיאורי גרידא של הדפוס ביטוי mRNA או חלבון של רצפטורים אינטגרינים ו כימוקין על לימפוציטים היקפיים או ריאות הסתננות ומדידה משלימים המתאימים כימוקין רמות בדם. bronchoalveolar שטיפה (BAL) או רקמת הריאה12,13,14,15, מבחני תרבות תא במבחנה ומבוססת לאפשר אפיון פונקציונלי של לימפוציטים אדהזיה או כימוטקסיס על הגדרת תנאים ניסיוני16,17,18. בעקרון, מבחני אדהזיה במבחנה סטטי לפקח הקיבולת איגוד של לימפוציטים בתרבית של טפט אנדותל או שקופיות זכוכית מצופה מולקולות אדהזיה אנדותל רקומביננטי (כגון MAdCAM 1, VCAM-1), תוך גופית רגילה מבחני כימוטקסיס חלים בדרך כלל על מנת לכמת את היכולת של לימפוציטים להעביר לאורך הדרגתי כימוקין מערכת transwell19. שתי ההגדרות במבחנה לאפשר התאמה מבוקרת עם אפנון של תנאי הניסוי, אך מאידך חסר משתנים חשובים ידוע באופן ביקורתי את ההשפעה על כימוטקסיס ויוו והצמדות של לימפוציטים. בעיקר, מבחני תרבות תא סטטי להתעלם השפעת כוחות הטיה הנגרמת על ידי זרימת דם קבוע19 , פוטנציאל להזניח את המעורבות של חצרו אימונולוגי שמסביב תאים חיסוניים אינטראקציה אי-לימפוציטים, שניהם מציגים אורגניזם חי. כדי להתגבר על מגבלות אלה, הפרשנות של התוצאות שהושגו סטטי במבחנה מבחני כימוטקסיס או הדבקות צריך עוד יותר אימות בניסויים אדהזיה דינמי תחת זרימה תנאים20,21 וב ב מודלים vivo של פתולוגיה דלקתית איברים19. אכן, חשוב יכול ניתן להסיק מסקנות על התקנון של תא T ריאות ביות בתנאים דלקתית או אלרגי מחקרים בבעלי חיים ניתוח גנטית שונה עכברים מודלים מוגדרים של מחלות שונות3, 22 , 23. ההשוואה הכמותית הריאה שחדר לימפוציטים בין wildtype עכברים ועכברים עם מחסור עבור גנים ספציפיים עניין מייצג כלי ומבוססת ומשמש באופן נרחב עבור הגדרת את ההשפעה של סלולרי מסוים מסלולים או רצפטורים על התבנית מונחה-מחלה של התפלגות T cell. עם זאת, בניגוד ל לפני דנו תא במבחנה מבחני תרבות, עיצוב המחקר מבוסס על מודלים קלאסיים חסרה את היכולת לנתח ולנטר העיקרי בתאי T האדם נגזרת ישירות בדם או BAL של חולים הסובלים ריאה דלקתיות המחלה. לכן, זה עדיין נשאר מאתגר לאמת באופן פונקציונלי אם מחלת ריאות אבחונית שצוין הוא מסוגל להטביע לימפוציטים אנושיים tropism ריאות מועדף, עד כמה פרמטרים קליניים העלולים להשפיע על התרחיש הזה. לאחרונה, בגישה ויוו אלגנטי מאוד הוצג בהקשר של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), אשר היה מסוגל להתגבר על רוב מגבלות אלה ופתח אפיקים חדשה השתלמות translational על לימפוציטים מעיים ביות24 . תוך ניצול פרוטוקולים עבור ניקוי רקמות ממס מבוסס ואחריו קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך הרוחב מיקרוסקופ הדמיה ככלי רב עוצמה, זה היה אפשר לדמיין את חדירה והפצה של תאי T אדם הועבר adoptively במעי של עכברים immunodeficient colitic24. בפרט, הגדרה ניסויית זו מיושמת שני חידושים עיקריים: (1) ראשי תאים חיסוניים האנושי ניתן לנתח בתנאים ויוו השפעול מוגדרים; (2) שטח די גדול של האיבר הפגוע (כ 1.5 ס מ x 1.5 ס מ) יכול לדימות באיכות ברזולוציה גבוהה, ואחריו 3D-שיקום. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מספר בהצלחה הקים השימוש ממס מבוסס רקמות ניקוי מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות ככלים חשובים ריאה מתקדם הדמיה25,26. על מנת להפיק תועלת זו התקדמות טכנולוגית בתחום אימונולוגיה ריאתי, אנחנו עכשיו אימצו את השיטה לניתוח של יונת ריאות.
פרוטוקול שהוצגו כאן מספק הקדמה צעד אחר צעד איך לטהר ותווית fluorescently T אנושיים ראשי תאים עבור העברת לתוך עכברים עם דלקת ריאות המושרה, יתר על כן, מתאר בפירוט את התהליך עוקבות של אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית הדמיה מיקרוסקופיים, כולל עוגב הכנה ועיבוד תמונה. בסך הכל, אנו מקווים לתמוך מחקרים translational עתידיים בתחום מחלות ריאה דלקתיות או אלרגי על ידי החדרת שילוב מתוחכם, אבל בכל זאת ריאלי, ניסיוני דגם לניטור לימפוציטים אנושיים יונת ריאות על התנאים ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים המערבות בעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על-ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיים בארלנגן (Regierung פון Unterfranken, וירצבורג, גרמניה). עכברים שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. האוסף של דם אנושי אושרה על ידי הוועדה המקומית אתית מוסדית מועצת המנהלים של אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג. כל מטופל נתן הסכמה בכתב.
1. לגרום לדלקת ריאות אלרגית בעכברים
הערה: כפי שמתואר מחקרים קודמת27, בהליך ניסיוני הבא מאפשר וגורם לדלקת אלרגית דרכי הנשימה בעכברים, בהתאם, מעורר ההצטברות של תאים חיסוניים מולדת, מסתגלת ב הכדור. הפרוטוקול המתואר הוקם בשנת C57BL/6J עכברים, אבל אימוץ זנים המפגרים סטנדרטיים אחרים צריך להיות אפשרי.
ראה איור 1A עבור סיכום של ההליך ניסיוני ויוו.
-
עזים ומתנגד עכברים באמצעות הזרקת בקרום הבטן של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים.
הערה: להשתמש רק C57BL/6J עכברים בוגרים מאשר 6 שבועות, עם משקל הגוף לפחות 16 גרם.- להכין קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים פתרון ב- PBS (12 מ"ג/מ"ל קטמין; חריגות השירותים הווטרינריים 1.6 מ"ג/מ"ל) ולקבוע את משקל הגוף המדויק של עכברים.
- להחדיר את העכבר הראשון 8 bodyweight µL/g של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים פתרון intraperitoneally ואשר הרדמה עמוקה דרך היעדר רפלקס הפינצ כפת לפני שתמשיך לשלב 1.3.
- טרי להכין 5 מ"ג/מ"ל של פפאין ב- PBS. לאט לאט פיפטה 10 µL (50 µg) של הפתרון פפאין לתוך הנחיר. לפקח בקפידה על העכבר עד התעוררות.
- חזור על הצעדים 1.1 ו- 1.2 עכברים כל כלול את הניסוי. בצע צעדים 1.1-1.3 שלושה ימים רצופים.
2. לטהר ויסמנו Fluorescently האנושי CD4 דם היקפיים+ תאי T
הערה: תאים תהליך בתנאים סטריליים.
-
לאסוף 18 מ של דם אנושי מלא וריד היקפיים. לבצע צנטריפוגה הדרגתיות Ficoll-Hypaque על מנת לבחור את השבר של תאי תאי דם היקפיים (PBMC).
הערה: איסוף וניתוח של חומר אנושי הראשי צריך יאושרו על-ידי הרשויות המקומיות אתית. רק אדם בעל הכשרה רפואית נאותה מותר לאסוף דם מווריד היקפיים.- לאסוף דם בחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-המכילים monovettes (1.6 מ ג דם EDTA/mL) כדי למנוע קרישה.
אופציונלי: להשתמש באפי המעיל דם, תוצר לוואי של תרומת דם מועשר בלויקוציטים, במקום מלא דם ורידי. - העברת דם לתוך צינור חרוטי 50 מ ל ו לדלל 1:2 בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). בזהירות להוסיף 10 מ של Ficoll-בינוני (צפיפות 1.077 g/mL) כשכבה תחתונה תחת דם מדולל. Centrifuge המדגם (800 x g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ללא בלמים).
- בזהירות להסיר את הצינור לצנטריפוגה ולהעביר את לאטמוספרה המכילות PBMC לתוך צינור חרוטי 50 מ. למחוק את העליונה ואת לשכבה התחתונה. ממלאים את הצינור המכיל PBMC PBS, צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). הסר את תגובת שיקוע.
הערה: באופן אופציונלי, במידת הצורך, לבצע פירוק של אריתרוציטים הנותרים. להוסיף בזהירות 3 מ"ל של אמוניום כלוריד-אשלגן מאגר של פירוק (ACP) (pH 7.27; 155 מ מ אמוניום כלוריד; 19 מ מ אשלגן מימן קרבונט ו מ מ 0.68 EDTA) התא resuspended צנפה ואת מערבולת המדגם. לנער את הצינורות במשך 3 דקות. כדי להסיר את המאגר פירוק ACP, להוסיף 40 מ"ל של PBS, צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
- לאסוף דם בחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-המכילים monovettes (1.6 מ ג דם EDTA/mL) כדי למנוע קרישה.
-
לטהר CD4+ T תאים באמצעות גרגרי CD4.
הערה: באופן כללי, ישנם מספר מפיצים של גרגרי מגנטי לטיהור של CD4 האנושי+ תאים, אשר יביא רמות דומות של התא טוהר. מוצר הבחירה צריכה להתבסס על העדפות אישיות. השלבים הבאים של הפרוטוקול (2.2.2–2.2.7) מותאמים ל CD4 המוגדר microbead מוצר ועמודות ההפרדה המתאימים כפי שמצוין נוסף שולחן של חומרים. ייתכן שיהיה צורך מספר שינויים בפרוטוקול במקרה כי מוצר חלופי microbead CD4 נבחרה.- Resuspend בגדר PBMC במינימום של PBS 80 µL המכילה 0.5% סרום שור עוברית (FBS) ו 2 מ מ EDTA (PBS/FBS/EDTA-מאגר) לכל 107 PBMC. שימוש אוכלוסיה ההתחלתי של בערך 30 x 106 PBMC על מנת מקצה את עם 3 x 106 6 x 106 מטוהרים CD4 האנושי+ T תאים.
- הוסף 20 µL של גרגרי CD4 לכל 107 PBMC, לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C. ממלאים את הצינור PBS FBS/EDTA-מאגר / (מקורר עד 4 ° C), צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). הסר את תגובת שיקוע.
- המקום עמודה ההפרדה לתוך שדה מגנטי. יש לשטוף את העמודה עם 3 מ"ל של PBS/FBS/EDTA-מאגר. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של PBS FBS/EDTA-מאגר / (מקורר עד 4 ° C) והעבר התליה תא אל העמודה ההפרדה שטופים ממוקם בתוך שדה מגנטי.
- לשטוף את העמודה ההפרדה שלוש פעמים עם 3 מ"ל של PBS FBS/EDTA-מאגר / (מקורר עד 4 ° C) וזורקים למסקנות.
- הסר את העמודה ההפרדה השדה המגנטי ולמקם אותו לתוך צינור 15 מ"ל. Elute של CD4+ תא שבר ב 5 מ של PBS/FBS/EDTA-מאגר באמצעות הבוכנה.
- ממלאים את הצינור PBS, צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). הסר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה כביסה פעמיים.
- לקבוע את מספר התאים לא הניבה על ידי שיטה סטנדרטית של בחירה (למשל, נויבאואר קאמרית).
-
תווית CD4+ T תאים עם צבע התפשטות תא פלורסנט.
- Resuspend CD4+ T תאים ב- PBS (עד 107 תאים למ"ל; אל תשתמש µL פחות מ-500 ל- PBS).
- להכין פתרון מיקרומטר 6 של שגשוג תאים אור אדום-טמפרמנט לצבוע (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS (טרום להתחמם לטמפרטורת החדר). לערבב זה פתרון 1:2 עם לפני מוכן תא הבולם, מערבולת ביסודיות (3 ריכוז סופי מיקרומטר).
- תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (מוגן מפני אור). לאחר מכן, הוסף בחמישה כרכים בינוני RPMI המכיל 10% FBS דגירה למשך 5 דקות על קרח (מוגן מפני אור).
- שטיפת שכותרתו תאים שלוש פעמים ב RPMI בינוני המכיל 10% FBS (צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 ° C). Resuspend תאים עם תוויות PBS, לאחסן בקירור, להגן מפני אור עד השימוש.
הערה: ממושך אחסון של תאים (> 60 דקות) העלולים להשפיע לרעה על הישרדות cell.
אופציונלי: לקבוע את הטוהר של CD4+ תא שבר והיעילות של ההליך תיוג על ידי cytometry זרימה. Resuspend 0.5 x 106 עונה 1 פרק 106 CD4+ תאי µL 100 מאגר (1% FBS, 2 מ מ EDTA ב- PBS) ולהוסיף נוגדן נגד CD4 בשילוב עם צבע פלורסנט של בחירה. תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. מוסיפים 1 מ"ל מאגר צנטריפוגה (300 x g 10 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע. להמשיך עם cytometric מדידת המדגם (תוצאה נציג מתואר באיור 1ב, ג).
3. adoptively להעביר CD4 האנושי+ T תאים לתוך החשופים פפאין Mmice הנמען
הערה: ראה איור 1A עבור סיכום של ויוו לבצע ניתוח ניסיוני. לבצע העברה תא יום לאחר מתן תוך-אפי האחרונה של פפאין.
- להתאים את התליה של CD4 האנושי שכותרתו fluorescently+ T תאים (שלב 2.3.4) ריכוז עונה 1 פרק 107 תאים/מ ב- PBS. מילוי 100 µL של התליה תא לתוך 1 מ"ל/30 G-מזרק.
- בזהירות המקום הראשון החשופים פפאין C57BL/6J העכבר (שלבים 1.1-1.3) לתוך התקן ריסון להזרקה וריד הזנב. השתמש במזרק מוכן (שלב 3.1) כדי לנקב את הווריד הזנב ולהזריק לאט µL 100 של התליה תא המכיל 1 x 106 שכותרתו CD4 האנושי+ תאים. לא מיד להוציא את המחט לאחר ההזרקה, אך לחכות 5 שניות נוספות על מנת למנוע פריקה של התליה תא.
- שחרר את לחצן העכבר מהתקן ריסון והמשך עם החיה הבאה. לשמור על חיים חשופים פפאין אחד לפחות, אשר אינו עובר העברה עם תאים עם תוויות fluorescently לשמש בקרה שלילית של מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה.
4. מכינים את רקמת הריאה של מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית
הערה: השלבים הבאים מבוצעות 3 h לאחר העברה של fluorescently שכותרתו תאים אנושיים (שלב 3.2). ניסיוני ההליכים המתוארים כולל קציר של רקמת הריאה, קיבוע ורקמות ממס מבוסס ניקוי היו ממאמרו של הפרוטוקולים כיום מתואר24,28.
- להקריב את העכבר על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני (C02).
-
Perfuse הריאה באתרו עם PBS המכיל 5 מ מ EDTA.
- לפתוח את בית החזה באמצעות חיתוך לאורך עצם החזה כדי לחשוף את הלב. Punctate החדר הימני עם בצינורית 21 G מחובר צנתר.
- פתח החדר השמאלי על ידי חיתוך, ובכך לאפשר את נוזל הדם זלוף לצאת. לאט לאט perfuse הריאה עם 20 מ של PBS קר כקרח המכיל 5 מ מ EDTA דרך הקטטר.
- על מנת לבצע קיבוע באתרו של הריאה, אל תסיר את הצנתר החדר הימני. לאט לאט perfuse הריאה עם 2 מ של paraformaldehyde 4% קר כקרח (PFA) נפתר ב- PBS. הסר את הצנתר את הצינורית.
הערה: מבוסס-PFA קיבוע באתרו של רקמת הריאה מייצג טכניקה ומבוססת על מנת להתכונן רקמת הריאה מאתר לאחר מכן ניתוח מיקרוסקופי29,30.
התראה: כדורגלן הוא רעיל ויש לטפל ברדס בזהירות. -
למלא את הריאות agarose 0.75% באתרו.
- להכין agarose 0.75% ב- PBS ולשמור אותו מוצק ב 50 מעלות צלזיוס ב התרמו-שייקר עד השימוש. הסרת בלוטות הרוק של העכבר, לחתוך את השריר sternohyoid ולחשוף את קנה הנשימה על ידי הזזה של מלקחיים מתחת.
- תנקד את קנה הנשימה חשוף עם מחט 30 G ולהחליף אותו על ידי צנתר 30 G בוטה כדי למנוע נזק נוסף של קנה הנשימה וכתוצאה מכך זליגת רצויה של agarose. חותם הצומת בין הקטטר שנוספו קנה הנשימה באמצעות בעל מחט.
אופציונלי: לשלב הכאן את תיאר נוהל עם אוסף BAL לנתח הסתנן תאים אנושיים ב BAL לאחרונה שמתואר לפרטים31 (ראה איור 2E לתוצאות נציג). - בזהירות למלא את דרכי הנשימה עם agarose 0.75% (התקררה לטמפרטורת הגוף) דרך הקטטר עד התפתחות מלאה של הריאות; לחכות עד ייבוש מלא של agarose. להסיר את הצנתר ולקצור בקפידה את הריאה בשפופרת החשוך mL 2 מלא עם 4% מחברים.
- עבור קיבוע נוסף דגירה המדגם ב 4% PFA נפתר ב- PBS עבור 2 h ב 4 ° C תחת סיבוב רציף (31 סל ד).
- מייבשים רקמות על ידי לאחר מכן המקננת הדגימה תחת סיבוב רציף (31 סל ד) ב 4 ° C ב- 50% אתנול (pH 9), 70% אתנול (pH 9) ו- 100% אתנול; כל שלב במשך לפחות 4 שעות. בסוף, ביצוע של דגירה השני אתנול 100% טריים במשך 4 שעות.
- לבצע סליקה ממס מבוסס של הרקמה באמצעות אתיל cinnamate (ECi). לכן, להעביר את הדגימה ECi. דגירה לילה בטמפרטורת החדר (תחת סיבוב קבוע) להופעת רקמת שקוף (ראה איור 1D עבור להחליפן בתמונות).
הערה: דוגמאות המאוחסן ב- ECi בטמפרטורת החדר (מוגן מפני אור) יציבים במשך מספר שבועות עד חודשים.
5. ביצוע מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה של אונות הריאה מאתר Wwhole
הערה: נא עיין טבלה של חומרים לפרטים על מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, התוכנה המתאימים, שעליו מבוססים בשלבים הבאים. מערכות דומות על ידי יצרנים אחרים, עם זאת, ניתן להשתמש גם עם שינויים ספציפיים מפתח של פרוטוקול הבאים. לפני שמתחילים, עירכו היכרות עם מדריכי הפעלה ספציפית מיקרוסקופ ובצע את ההוראות טכני על ידי האדם אחראי באתר.
-
בצע כיוונון מיקרוסקופ אור גיליונות.
- הפעלת מיקרוסקופ אור גיליונות ופתח המתאימה imaging התוכנה במחשב. למלא את התא מדגם ECi מסוננים (מסנן 100 מיקרומטר) ומקם אותה במיקומה בין הקורות לייזר.
- השתמש טיפה קטנה של דבק יציב הממס האורגני מקל הריאה אל המחזיק לדוגמה. כדי לשמור את עומק החדירה נדרש הסדינים האור קטן ככל האפשר, הגדר האונה ריאות זקוף. בשלב הבא, מקום בעל מדגם בחדר שלה.
- הגדר את מקדם שבירה של המטרה 3.5 בעת שימוש ECi כמו ניקוי מגיב.
-
לכוונן הגדרות במיקרוסקופ אור גיליונות כדי לזהות תאים אנושיים בהקשר של האיבר כולו.
- בחר לייזרים הנדרש (מסנן עבור מדידה > להפעיל את תיבות הסימון של לייזרים נדרש) ובחר עוצמות המתאים תוכנת שליטה (לייזר בקרת שידור > השתמש במחוון כדי להגדיר לייזר בעוצמה > החל). השתמש של גל עירור של 488 ננומטר (מסנן 525/50) כדי לזהות רקמת הריאה autofluorescent, 640 nm (מסנן 680/30) כדי לעורר תאים אנושיים המסומנת fluorophore פולטות בספקטרום אדום.
- להתמקד המדגם מתרגשים לקראת 488 ננומטר ולהתאים את המוקד באמצעות הכלי 'תיקון כרומטי'-אורך הגל עירור של 640 nm (השתמש במחוון כדי להגדיר תיקון כרומטית > להחיל).
- בחר גורם זום המתאים; השתמש סקירה הגדלה נמוכה (למשל, 6.3 x) כדי לקבוע את חלוקת תאים עם תוויות בתוך רקמת הריאה ותמונות מוגדל (למשל, 32 x) הכוללת בלוקאליזציה מפורט.
- בחר רוחב הגיליון בצורה אחידה שחקרתי את כל האיבר או מקטע מסוים עניין (אופטיקה > השתמש במחוון כדי להגדיר רוחב גיליון; בדרך כלל בין 20-40%). הגדר את גליון מספרי הצמצם (NA) עם נה גבוהה יותר ביצירת תמונות חדות יותר (אופטיקה > השתמש במחוון כדי להגדיר NA גיליון; עבור האונה מאתר הריאה התרחב לגודלו פיזיולוגיים נה של 0.025% יכול לשמש לעתים קרובות).
- בחר את מספר גליונות אור כדי לשמש תחת 'הגדרות מדידה מתקדמים'. במקרה של דו-כיווניות תאורה, מיזוג ימינה ושמאלה גליונות אור כדי ליצור תמונה למשל מואר (מתקדמים > מיזוג lightsheets > בחר למזג מצב > להשתמש במחוונים כדי להגדיר החפיפה בין שני גליונות אור).
הערה: מומלץ לנצל ההארה דו-כיווני המדגם עם שלושה אור גליונות בכל.
אופציונלי: כדי להגביר עוד יותר את איכות התמונה, השתמש בפעולה מיקוד דינמי. זה מאפשר להעביר את המוקד x-כיוון במהלך ייבוא תמונות. - להגדיר עמדות התחלה וסיום של z-המחסנית להיות נמדד, קבע את גודל שלב 5 מיקרומטר (Z xyz-טבלה > סרוק טווח).
הערה: עמדות התחלה וסיום של z-מחסנית תלויים בגודל ובמיקום של האונה ריאות בתוך תא הדגימה. עם זאת, בערך 800 300 z-במחסן נרכשים בדרך כלל עבור האונה ריאה בודדת (5 µm גודל צעד). - שמירת קבצים בעזרת 'שמירה אוטומטית הגדרות' ולהתחיל מדידה כדי ללכוד תמונות. לאחר ייבוא נתונים גימור, לנקות את ECi שזוהמו בעל מדגם והרכבים תחת מים זורמים.
הערה: להשתמש באותן ההגדרות תמונה מספר אונות הריאה שאמורים להיות מושווה לאחר מכן.
6. פוסט תמונה עיבוד של כימות של צבר-ריאות תאים אנושיים
הערה: נא עיין טבלה של חומרים לקבלת פרטים על תוכנת הדמיה שלאחר ניתוח תלת-ממד, שעליו מבוססים בשלבים הבאים. עם זאת, חלופה פוסט-הדמיה תוכנות יכול לשמש גם כן.
- לטעון את התמונה הראשונה של z-מחסנית (הפעילו את כפתור surpass, קובץ > פתח > בחר תמונה) על מנת ליזום הפתיחה של כל תמונות אחרות של הערימה-z שבחרת ושחזור אוטומטיים 3D שלהם.
- כדי להבטיח תצוגה תקינה של x, y ו- z מידות, לבדוק voxel גדלים ולהתאים אותם במידת הצורך (עריכה > תמונה מאפיינים > להזין באופן ידני voxel בגודל). עבור גודל voxel z, הזן את גודל הצעד שבחרת בין שתי תמונות (כאן 5 מיקרומטר).
- להציג לכל ערוץ צבע ברורים (עריכה > הצג תצוגה התאמה). לחץ על כל ערוץ אחד אחרי השני כדי להגדיר צבע של בחירה ( איור 2A, B, C, D האות autofluorescence הוא מוצג באפור ומתויגים CD4 האנושי+ תאים בצבע אדום).
- כוונון עוצמת, רמת השחור והחדות לכל ערוץ (לערוך > הצג תצוגה התאמה) באמצעות המשולשים בברים ערוץ או הזנת מספרים מדוייקים בהגדרות של הערוץ. התאמת עוצמת, להשתמש של משולש ישר-זווית. עבור התאמת רמת השחור, להשתמש המשולש השמאלי, החדות, להשתמש המשולש האמצעי.
הערה: שימוש הריאה נגזר שליטה בעכבר ללא מעבר תאים (שלב 3.3) כדי להבדיל בין אותות מסוימים נגזר התא האנושי ואת הרקע לא ספציפי. -
כדי לכמת תאים עם תוויות בתוך רקמת הריאה להשתמש 'להוסיף נקודות חדש' בסרגל הכלים, בחר 'דלג על יצירה אוטומטית, לערוך באופן ידני' לספירת תא ידנית.
הערה: לחילופין, להשתמש התא אוטומטי ספירת כלי תחת 'מקומות'. עם זאת, ספירה ידנית מאפשרת להבחין בין סימנים ספציפיים, לא ספציפי בצורה מדויקת יותר.- כדי להשוות את הצטברות תאים אנושיים מדגמים שונים, הגדרת קוביה ריאות עם אחסון מסוים באמצעות הכלי חיתוך תלת-ממד (עריכה > חיתוך תלת-ממד) (כאן 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
- כדי לספור תאים שהצטברו בחר בערוץ nm 640 ולהגדיר מידה רדיוס של 10 מיקרומטר. לאחר מכן, לחץ על 'ערוך', בדוק 'בחר' בתפריט מצביע ולסמן כל תא עם נקודה באמצעות shift-לחץ עם לחצן העכבר השמאלי. למצוא את המספר הכולל של תאי שנספרו מוצגים הנתונים הסטטיסטיים.
הערה: מומלץ מאוד כדי לספור את מספר קוביות לכל ריאה האונה (חמישה כאן) כדי להבטיח אמינות התוצאות וכדי לפצות לבחירה מדען תלויי נפח הריאות שנספרו (כימות אסטרטגיה ונציג תוצאות מתוארים ב- איור דו-ממדי).
- לכידת תמונה באמצעות הכלי 'תצלום בזק' ו/או לקחת וידאו באמצעות הכלי 'הנפשה'. שמור מותאם קבצים כקבצי .ims (קובץ > ייצוא).
הערה: למטרות נציג, להציג או להסתיר את המסגרת על-ידי בדיקת או ביטול הסימון של המסגרת בסרגל הכלים. בנוסף, תצוגת תמונות כמו הטלה בעוצמה מירבית (MIP) גם (הכלים > נפח > מצב > בדוק MIP) או להשתמש את 'מצב השטח' (הכלים > להוסיף משטחים חדשים). 'מצב השטח' חייב להיות מופעל בנפרד לכל ערוץ לסמן רקמות אדריכלות ו/או גוף התא (להחליפן בתמונות מוצגות באיור 2C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול הציג מתאר מודל העכבר ניסיוני, אשר מאפשר ניטור וכימות ההצטברות של לימפוציטים T אנושיים הועבר adoptively בריאה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה. איור 1 א מעניק סקירה סכמטי של השלבים ויוו של לוח הזמנים ניסיוני. על מנת להבטיח תוצאות אמינות, הוא בעל חשיבות משמעותית כדי להבטיח באיכות טובה מבודד, fluorescently שכותרתו CD4 האנושי+ T תאים, אשר לאחר מכן יועברו לתוך עכברים. כמו representatively מתוארים איור 1ב, ג, ההליך המתואר לעיל מבוסס microbead תא העשרה ולקרוא עוקבות זריחה-בדרך כלל תוצאות cytometrically זרימה נחוש CD4+ טוהר תא T > 95% מוצלח זריחה-תיוג והצהרה של CD4 כל+ T תאים. העומק איכות, חדירה של מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות תלוי באופן ביקורתי כיתה המתאימה של ניקוי רקמות. כפי שמתואר באיור 1D, פרוטוקול המוחלת כאן עבור ניקוי רקמות מבוסס-ECi הצליח להבטיח רמה גבוהה של שקיפות איברים, המציינת את ההתאמה המוצלחת מקדם שבירה. לבסוף, תוצאה הכולל נציג של פרוטוקול נסיוני תיאר בצורה של תמונות מיקרוסקופ מעובד באופן מלא אור גיליונות פלורסצנטיות הוא הפגין איור 2B, C, D וידאו משלימים. האות autofluorescent (מוצג באפור) מספק כלי שימושי עבור הדמיה של מבנה אנטומי של הריאה. האות האדום מייצג את הריאות המצטבר CD4 האנושי+ T תאים. כימות של הדמיה במיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות מאפשר קביעת הכולל מספר ריאות שנצבר CD4 האנושי+ T תאים לכל אזור מוגדר של רקמת הריאה מודלק. אסטרטגיה על כימות של התא האנושי הסתננות מודגם באיור 2E. גילוי cytometric זרימה (אופציונלי) של fluorescently עם התווית תאים בתוך הכדור של עכברים הנמען, כפי שהיא מתוארת באיור 2F, יכול לשמש טכניקה משלימה כדי לאשר את ההעברה רקמות מוצלחת של adoptively הועבר CD4+ T תאים. יתר על כן, ההעדפה של תאי T אדם שהועברו הצטברות סלקטיבי ברקמת הריאה מודלק כאן תיאר הגדרת הניסוי היה נוסף הנתמך על-ידי העובדה CD4 האנושי הזה+ T לא היתה אפשרות לאחזר תאים של רירית המעי של חיות הנמען כמו מתוארים איור 2B (לוח נכון).
איור 1 : סקירה סכמטי של זרימת העבודה ניסיוני ויוו. דלקת ריאות אלרגית (א) היה המושרה בעכברים C57BL/6J על ידי שאיפת פפאין (µg 50/עכבר) על שלושה ימים רצופים (d0, d1 ו- d2). למחרת (d3), טרי מבודד ומתויגים fluorescently CD4 האנושי+ T תאים היו adoptively לתוך עכברים באמצעות הזרקת וריד הזנב. לאחר שלוש שעות נוספות, עכברים הוקרבו, ואחריו זלוף באתרו, קיבוע של הריאות. לבסוף הריאות היו explanted, בהמשך נותחו ex-vivo על ידי מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה. לחלופין, ניתן לאסוף BAL לפני ריאות explantation לבצע מורחב ex-vivo ניתוחים של תאים אנושיים extravasated, שהועברו בהצלחה. היסטוגרמה מייצגת (B) המאשרת את טוהר CD4 מבודד+ שבר תא T כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה. תאים מוכתמת נגד CD4 נוגדן או isotype פקד מוצגים שחור, אפור, בהתאמה. (ג) היסטוגרמה הנציג המאשר את היעילות של זריחה-תיוג של CD4 האנושי+ תאים לפני העברת המאמצת. (ד) נציג תמונות של האונה ריאות מאתר perfused לפני ואחרי ניקוי עם ECi. . פי, עוצמת קרינה פלואורסצנטית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ניתוח נציג של הצטברות CD4 האנושי ריאתי+ תאים בהקשר של דלקת ריאות ויוו. CD4 האנושי+ תאים הם בודדו אותנו מהמתרחש דם היקפיים באמצעות צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות ואחריו שלב טיהור מגנטי מבוסס microbead. CD4 האנושי+ תאים היו תוויות באמצעות צבע התפשטות אור אדום-טמפרמנט תא, מוזרק לווריד החשופים פפאין C57BL/6J עכברים. אחרי שלוש שעות, עכברים הוקרבו לאיסוף וניתוח נוסף רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה. (א) סקירה נציג של שחזור תלת-ממד של רקמת הריאה מאתר, החשופים פפאין (אפור) כשלוש שעות לאחר ורידיות שכותרתו CD4 האנושי+ תאים במיקרוסקופ (אדום) כפי שנרשמו על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות. (B) רקמת הריאה של עכבר הנמען שלוש שעות לאחר העברה התא המוצג כ סקירה או בהגדלה מקטע (החלונית הימנית). שאוחזרו CD4 האנושי+ תאים יכול להיות דמיינו כמו אותות אדום, גם מתוארים בכיסוי עם האות autofluorescence של רקמת הריאה או כתמונת ערוץ אחד. על מנת לאשר יחודיות של האות שאותרו, שליטה רקמת הריאה ללא מעבר תאים תוך ורידי שימש שליטה שלילי (לוח האמצעי). בניגוד רקמת הריאה, אין CD4 האנושי שכותרתו+ יכול לזהות תאים (אדום) מעי של העכבר הנמען באותו (לוח נכון). (ג) פוסט עיבוד תמונה מאפשר ניתוח של פרוסות יחיד של רקמת הריאה, כמו גם הדור של שחזורים תלת-ממד של המקטע כל האיבר כי יכול להיות מיוצג הטלה בעוצמה מירבית (MIP) או במצב משטח. להחליפן בתמונות מתוארים. (D) כימות אסטרטגיה מודגם exemplarily בריאה אותו כפי שכבר מתואר באיור 2א. קוביות מוגדרים של המקטע ריאות שנותחה נבחרו ואת המספר של CD4 האנושי+ תאים (אדום) היה לכמת על כל קוביה. תוצאות כימות שבוצעו לאחר מכן (813 אירועים מיקרומטר x 813 מיקרומטר x 1,000 מיקרומטר קוביה) מסומנים כמו זאת אומרת ± ב- SEM (E) כאופציה נוספת, זרימה זיהוי cytometric תאי T אנושיים שכותרתו fluorescently הכדור של נמענים בעלי חיים יכול להיות מבוצע על מנת לאשר את ההעברה רקמות מוצלחת של CD4 האנושי המצטבר+ T תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו משלימים: נציג רצף וידאו מראה שנצבר CD4 האנושי+ תאים בתוך רקמת הריאה מאתר. שחזור תלת-ממד של הריאה מאתר הצגת שנצבר CD4 האנושי+ תאים (אדום) בתוך ההקשר של רקמת הריאה (אפור) שלוש שעות לאחר הזרקת עירוי לווריד הזנב. תמונות מוצגות כפי MIP בהתחלה ורק במצב משטח בסופו של דבר. תמונות רכשה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, שעובדו על-ידי תוכנה להדמיית שלאחר ניתוח תלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההגדרה ניסיוני שתואר כאן מספק ההזדמנות כדי לפקח על ביות ריאות של תאים חיסוניים האנושי הראשי תחת התנאים דלקתית ויוו, ובכך relevantly משלים בסגנון קלאסי הופיעה אדהזיה במבחנה כימוטקסיס מבחני. כדי לקחת בחשבון מאפיינים איבר אנטומי ספציפי של הריאה, היבטים חשובים של תאים חיסוניים ביות (כולל הפצה כימוטקסיס ותא בתוך איבר היעד) כמו גם הרלוונטיות הקלינית ואת transferability של הנתונים שהושגו, לקחנו היתרון של שלוש תכונות מרכזיות טכני: (1) הניתוח של תאים אנושיים העיקרי בתוך אורגניזם חי מאתר; (2) בתיווך פפאין אינדוקציה של דלקת ריאות; מיקרוסקופ אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית (3) של רקמת הריאה שנוקה.
למרות מחקרים פונקציונלי של הועבר adoptively האנושי תאים חיסוניים בתוך אורגניזם חי מאתר עשויה להיות מוגבלת בהיבטים מסוימים עקב אי תאימויות שעשוי להיות רלוונטי בתחום קולטן-ליגנד-האינטראקציות בין עכברים ואנשים, הרעיון הכללי של העכבר humanized מודלים הקימה בהצלחה ומהווה כלי חשוב ניסיוני בתחום translational רפואה במהלך האחרון עשרות שנים24,32,33,34,35 . לעומת מודלים קלאסיים, מחקרים בעכברים humanized מציעים את היתרון לנתח ישירות נגזר החולה תאים חיסוניים בתרחיש ויוו וע י כך כדי לזהות שינויים פונקציונליים מוטבע על ידי ממחלה מסוימת32. 36,37. בדבר הרלוונטיות של אי התאמות אפשריות בין שהוגדרו הקולטנים על פני השטח של תאים חיסוניים האנושית ואת ליגנדים מאתר בהתאמה שלהם או להיפך, מחקרים לשעבר כבר ציינה את האדם CD4+ T תאים מסוגלים לתקשר ביעילות עם מולקולות אדהזיה מאתר MAdCAM 1 ואת VCAM-1, אשר מייצגים ליגנדים מכריע עבור לימפוציט בתיווך אינטגרין ביות32. בהתאם לכך, ההעברה של תאים חיסוניים האנושי intravascularly מועברת לתוך הבטן מאתר רקמות בהצלחה תיחסם ויוו על ידי טיפול עם vedolizumab32נוגדן אינטגרין α4β7 בשימוש קליני. עם זאת, אפילו במקרה ספציפי קולטן-ליגנד-האינטראקציה של רלוונטיות יראה האדם/מאתר חוסר התאמה מוחלט, זה ככל הנראה ניתן יהיה להתגבר על מגבלה זו על-ידי הנדסה גנטית ועל, למשל, על ידי ביטוי הטרנסגניים של ליגנד האנושי בהתאמה, פקטורי גדילה, ציטוקינים או קולטן בתוך האורגניזם מאתר33,35.
כמו השפעה משמעותית של דלקת כרונית על הפרשה מקומית של נוגדנים, הביטוי אנדותל של מולקולות אדהזיה ואת הצטברות עוקבות של לימפוציטים שתיארנו אינספור פרסומים38,39 ,40, הבחירה של דגם ניסיוני מתאים של דלקת ריאות ייצג שלב קריטי בזמן יצירת פרוטוקול המתואר לעיל ובכל יכול להיות מותאם התלוי על ההקשר הקליני של כל לשעות הלימודים. הגדרת שנבחר כאן של דלקת ריאות אלרגית פפאין-induced מייצג דגם ניסיוני היטב תיאר, אשר מבוססת על היכולת של פפאין פרוטאז ציסטאין מנוהלת באופן מקומי כדי לעצבן את אפיתל דרכי הנשימה ואת הגורם המפעיל שחרור עוקבות של alarmins27,41,42. מעניין, תערוכות בשוגג כדי פפאין ידוע לגרום לפיתוח אסטמה אצל בני אדם כמו גם43. . תלויה על המינון בשאיפה של פפאין, עכברים חשוף הצג הצטברות של תאים חיסוניים מולדת, גמישים, רמות גבוהות של ציטוקינים מסוג 2 הריאות27 בעוד המינון התברר התוצאה הגדלה של airspaces (תופעה היסטולוגית קלאסי של COPD) והרס של כלי דם קירות עם דימום שלאחר מכן, בינוני מינון לוחות זמנים הלך עם אאוזינופיליה ריאתי בולטים ובכך חיקה היסטולוגית תכונה חשובה של אסטמה אנושי27. המטרה שלנו הייתה להשתמש מודל ניסיוני זה כדי ליצור של ההקשר דלקתיות לניתוח של תאים חיסוניים ריאתי ביות, ניסינו בקפידה למנוע נזק פפאין-induced של כלי דם, אשר עלול לגרום אחרת של unphysiological extravasation של תאים חיסוניים האדם עקב תקינות אנדותל מופרע. בהתאם לכך, בחרנו מנה ביניים של 50 µg של פפאין לכל העכבר ליום בפרוטוקול שתואר לעיל. למרות התפתחות פפאין-induced דלקת דרכי הנשימה מתרחש גם בהיעדר B, לימפוציטים מסוג T, ריאות שחדר תאים חיסוניים מסתגלת ידועים כדי להשפיע באופן משמעותי על הקורס של המחלה27,42. למשל, יכול להיות מזוהה בתאי T רגולטוריים כמבקרי חזק של דרכי הנשימה הנגרמת פפאין אאוזינופיליה27. בפרספקטיבה, מעורבות פעילה של לימפוציטים ריאתי בפתוגנזה דלקתיות של עכברים שנחשפו פפאין מרמז כי הפרוטוקול המתואר לעיל עשויות בנוסף לאפשר לנתח את יכולת תפקודית של הועבר adoptively ו בהצלחה שנצבר ריאות אדם תאים חיסוניים לווסת ריאות פתולוגיה (לדוגמה, באמצעות זרימת cytometric רכישת ספירות אאוזינופילית ב BAL). יתר על כן, בנוסף שבוצעו תוך-אפי הממשל של הנבחרת נוגדנים האנושית מחלות רלוונטיות רק לפני העברת תאי קרישה תוך-כלית עלול לאפשר לנתח את ההשפעה של אלה מגשרים ההורמונאלית על תהליך הביות הריאות של האדם ברורים אוכלוסיות תאים חיסוניים באווירה ויוו. באופן דומה, ניתן יהיה ללמוד את ההשפעה של מעכבי על תהליך הביות ריאות ו, לאחר מכן, על פתולוגיה ריאה דלקתיות.
היתרון של ההליך ניסיוני הציג כאן הוא מעקב מדויק לוקליזציה של הריאה שחדר תאים חיסוניים האנושי על פי איכות הדמיה באיכות גבוהה מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה. מחקרים שנעשו לאחרונה כבר הוכיחה כי הטכניקה של מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות מייצג כלי ניסיוני רב ערך לניתוח של מעיים תא החיסון ביות במחקר מחלת המעי הדלקתי translational והוא מסוגל להתגבר על המגבלות העיקריות של immunofluorescence המקובלת מיקרוסקופ וזרימה cytometry24,32. ניתוח המבוסס על-קונבנציונאלי מיקרוסקופ מוגבלים בדרך כלל קטן מאוד ואילו אזור פוטנציאלי לא נציג עוגב ו לזרום cytometry לוקח בחשבון את ההיבט של רקמות הארגון בכלל, אור גיליונות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רקמת כימית שנוקה מאפשר על עומק החדירה מוגברת ללא אובדן גדול של רזולוציה, ובכך מאפשר שחזור תלת-ממד סעיפים עוגב גדול למדי (עד 1.5 ס מ x 1.5 ס מ)24,28,44. כמובן, האיכות ואת החוקיות של שחזורים תלת-ממד רכשה אנושות תלויים הביצועים של סיווג רקמות. בהגדרה שתואר כאן, כללנו בגירסת פרוטוקול שפורסמו לאחרונה עבור רקמות מבוסס-ECi ניקוי44מעט מאומץ. לעומת אחרים אסטרטגיות וותיקה של רקמות ממס מבוסס ניקוי26,45,46, פרוטוקול מבוסס-ECi משלב את היתרונות של מאפייני ניקוי מעולה, רעילות נמוכה של משומש ריאגנטים, דרישה זמן בינוני44. כגודל הקיבולת של מיקרוסקופ רגיל פלורסצנטיות אור גיליונות כדי לפתור את מיטב מבנים רקמות כמו נימים מכתשי הוא עדיין מוגבל אפילו תחת אופטימלית ניקוי תנאים28, ייתכן איכשהו שיהיה קשה להבחין בצורה אמינה בין תאים חיסוניים קרישה תוך-כלית, כבר extravasated. הכללת נוספים רגיל המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית כלי דם מכתים לתוך הפרוטוקול המתואר כאן ככל הנראה לא תוכל להתגבר על מגבלה זו במלואה. לכן, מחקרים עם דגש מיוחד על ההתנהגות של תאים חיסוניים בתוך את microcirculation ריאתי או diapedesis שלהם אולי מעדיפים לקחת בחשבון עבור ריאות intravital הדמיה המבוססת על פוטון 2 פרוטוקול שפורסמו לאחרונה, מאוד אלגנטי מיקרוסקופ47. בהגדרה ניסיוני, חלון בית החזה היה מושתל לתוך עכברים ומורדמת ומאווררת, שדרכו ניתן לנטר את הריאה מיוצב על ידי תהודה סריקה מודול 2-פוטון מיקרוסקופ, המאפשר ברזולוציה גבוהה הדמיה לאורך מחזור נשימה על משומר אוורור זלוף47,48. טכניקה זו יושם בהצלחה במחקרים שונים והיה מסוגל לדמיין למשל טסיות intrapulmonary להן והכניסה ריאות של מחזורי גידול תאים49,50. עם זאת, מלבד הדרישה של ציוד מתוחכם פלייבק (למשל, מערכת האוורור של העכבר), את הצורך של מניפולציות פולשנית נרחב בבעלי חיים (implantation של חלון בית החזה, מיקרוסקופ intravital), המגבלה העיקרית זו הריאה בשידור חי מיקרוסקופ מערכת היא החדירה חיכוכים ציר z. ההדמיה משטח ריאות שבוצעו רק מאפשרת לנתח את 100 מיקרומטר החיצוני של47,של רקמת הריאה subpleural48. תלויה בהקשר מדעי, זה יכול להיות אופציה יקר ליישום 2-פוטון מיקרוסקופיה של הריאות explanted כמו הליך נוסף לתוך הפרוטוקול המתואר לעיל. ניתוח הריאה אותו תחילה על ידי מיקרוסקופ פוטון 2 ולאחר מכן על ידי מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות עשוי לייצג אסטרטגיה כדי לקבל סקירה כמותית של התפלגות ולוקליזציה של תאים חיסוניים אנושי בתוך (ריאות מאתר מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה), באותו הזמן, לקבל תובנות מפורט יותר לגבי תהליכים הסלולר או microvascular (2-פוטון מיקרוסקופ). אכן, פוטון 2 מיקרוסקופיה של מאתר explants בקנה הנשימה מייצגת כלי דימות הוקמה לניתוח התנהגות תא החיסון בהקשר של51,של דלקת ריאות השפעול המושרה52. במקום להמחיש נימים קטנים ריאתי, extravasation ואת ריאות רקמות חדירה מוצלחת של תאים T אנושיים שהועברו במודל ניסיוני שלנו ניתן גם להוכיח על ידי גילוי תאים אנושיים fluorescently שכותרתו בתוך הכדור של נמען בעלי חיים באמצעות cytometry זרימה כמו exemplarily מתואר באיור 2E. באופן כללי, ניתוח של תא BAL הסלולר מייצגים שיטה וותיקה לאפיין זרם תא החיסון ריאתי בהקשר של מחלות דלקתיות במערכת הנשימה31. לבסוף אחר אסטרטגיה cytometric זרימה לכימות תנועת את extravasation של תאים חיסוניים הועבר adoptively בתוך רקמת הריאה תוארה על ידי Galkina et al. (2005)53 , באופן פוטנציאלי יכול להיות משולב עם הפרוטוקול המתואר כאן. במחקר על-ידי Galkina et al., זריקה תוך ורידי אחת של נוגדן anti-CD8 מצומדת פלורסצנטיות זמן קצר לפני כריתה של הריאה כתוצאה בלעדיות ושלמה תיוג של לפני שהועברו CD8+ T תאים בתוך הריאה תא כלי הדם, תוך CD8 כבר extravasated+ T תאים בתוך interstitium ריאות נותרה וללא רבב. ניתוחים עוקבות של ויוו שכותרתו תאים חיסוניים ריאתי היו cytometrically זרימה שבוצעו לאחר עיכול ex-vivo של רקמת הריאה53. כמובן, תהליך העיכול רקמות משמעה ההפרדה אנטומי בין אינטרה - תא extravascular ריאות הוא יושב, לפיכך, יש סיכון כללי של מצב רוח חיובי-false interstitial תאים חיסוניים בשל דליפה נוגדן בין שני תאים. סיכון זה בלבד ניתן למזער על ידי ביצוע עיכול רקמת בנוכחות קולח כמויות של נוגדן ללא תווית53 או, באופן פוטנציאלי, על-ידי החלפת ניתוח תזרים cytometric על ידי מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, מה שהופך את זה אפשרי להימנע לחלוטין הריסת מבנה רקמות.
לסיכום, הציג הכאן שילוב של יונת ויוו של תאים חיסוניים fluorescently שכותרתו הראשית והוא פלורסצנטיות אור גיליונות עוקבות מיקרוסקופ מסוגל לזהות בצורה אמינה, לכמת, לשפה תאים חיסוניים האנושי ריאות שנצבר ב דגם העכבר ניסיוני של דלקת ריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F. נוירת שימש כיועץ עבור Pentax, ג'וליאני, MSD, Abbvie, ינסן, טקדה ו- Boehringer. המחברים הנותרים לא יחשוף בכל סכסוך.
Acknowledgments
המחברים להכיר בהכרת תודה מימון על ידי 1181 SFB של מרכזי מחקר DFG שיתופי trr ב 241. אופטי הדמיה מרכז ארלאנגן (OICE) ואת מסוים ראלף Palmisano, פיליפ Tripal, טינה Fraaß (פרוייקט Z2 של 1181 CRC DFG) הם הכירו עבור מומחה תמיכה טכנית עבור הדמיה מיקרוסקופי אור גיליונות זריחה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
| Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
| Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
| FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
| Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
| Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
| ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
| Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
| Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
| 30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
| Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
| LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
| PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
| Syringe 1 mL | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
| Syringe 5 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Syringe 20 mL | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Tube 1.5 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
| Tube 2 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
| Tube 2 mL, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
| Tube 15 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
| Tube 50 mL | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |
References
- Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
- Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
- Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
- Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
- Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
- Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
- Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
- Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
- Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
- Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
- Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
- Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
- Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
- Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
- Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
- Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
- Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
- Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
- Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
- Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
- Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
- Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
- Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
- Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
- Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
- Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
- Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
- Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
- Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
- Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
- Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
- Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
- Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
- Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
- Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
- Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
- Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
- Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
