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Medicine

फेफड़ों के उन्नत इमेजिंग के एक प्रयोगात्मक में एक प्रायोगिक में मानव लिम्फोसाइटों पर आधारित एलर्जी सूजन के प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के आधार पर

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59043
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

Summary

यहां शुरू की प्रोटोकॉल के तहत vivo भड़काऊ परिस्थितियों में प्राथमिक मानव लिम्फोसाइटों के फेफड़ों के अभिलक्ष्यन क्षमता के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है । दत्तक ग्रहण की फुफ्फुसीय घुसपैठ एलर्जी की सूजन के एक माउस मॉडल में मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को imaged और रासायनिक रूप से मंजूरी दे दी फेफड़ों के ऊतकों की प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है ।

Abstract

अत्यधिक सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भारी ऊतक संचय विभिन्न जीर्ण भड़काऊ रोगों की पहचान का प्रतिनिधित्व करता है और प्रभावित रोगियों के नैदानिक प्रबंधन में एक आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा । आदेश में और अधिक अनुकूलन प्रो भड़काऊ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रोगविज्ञान असंतुलित ऊतक घुसपैठ के चिकित्सकीय नियमन पर लक्ष्य रणनीतियों, यह विशेष महत्व का होगा रोग में सुधार अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए-और अंग विशिष्ट परिधीय लिम्फोसाइटों के अभिलक्ष्यन गुण । यहां वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की अनुमति देता है प्रतिदीप्ति के फेफड़ों के संचय की निगरानी और adoptively पापेन प्रेरित फुफ्फुसीय सूजन के संदर्भ में मानव लिम्फोसाइटों हस्तांतरित । विट्रो assays में मानक के विपरीत अक्सर प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन और chemoटैक्सियों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, अब vivo में शुरू की सेटिंग खाते में ले जाता है फेफड़े के विशिष्ट पहलुओं ऊतक संगठन और जटिल भड़काऊ के प्रभाव सजीव म्यूरिन जीव में होने वाला परिदृश्य । इसके अलावा, तीन आयामी क्रॉस-सेक्शनल प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति सूक्ष्म इमेजिंग न केवल घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है, लेकिन यह भी सूजन फेफड़ों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका स्थानीयकरण के पैटर्न को दर्शाया गया है । कुल मिलाकर, हम पुराने भड़काऊ फेफड़ों के रोगों के क्षेत्र में प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए उच्च मूल्य की एक अभिनव तकनीक शुरू करने में सक्षम हैं, जो प्रदान की कदम द्वारा कदम-चरण प्रोटोकॉल का पालन करके आसानी से लागू किया जा सकता है.

Introduction

ऐसे एलर्जी अस्थमा और क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग (copd) के रूप में फेफड़ों के क्लासिक भड़काऊ विकारों, अच्छी तरह से पल्मोनरी ऊतक1,2में सक्रिय लिम्फोसाइटों की एक वृद्धि की भर्ती के द्वारा संचालित हो जाना जाता है । लिम्फोसाइट जारी साइटोकिंस (जैसे, आईएल-4, आईएल-5, आईएल-9, आईएल-13, ifn-γ और tnf-α) आगे सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के chemoटैक्सियों को बढ़ावा देने, फाइब्रोटिक एयरवे remodeling प्रेरित या सीधे फेफड़ों पैरेन्काइमा2नुकसान. अब तक, अंतर्निहित फेफड़ों के ऊतकों के भीतर लिम्फोसाइटों की रोग संचय के लिए जिंमेदार तंत्र अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । ऊतक-चयनात्मक टी सेल imprinting के लिए सादृश्य में आंत और त्वचा homing के लिए वर्णित है, पल्मोनरी डेन्ट्राटिक कोशिकाओं (DCs) स्पष्ट रूप से अधिमानी फेफड़ों की घुसपैठ के लिए प्रधानमंत्री परिधीय टी कोशिकाओं को सक्षम कर रहे हैं, पर CCR4 अभिव्यक्ति के प्रेरण के माध्यम से कम आंशिक रूप से लिम्फोसाइटों की सतह3. CCR4 के अलावा, एयरवे-टी कोशिकाओं घुसपैठ भी chemokine रिसेप्टर्स की एक विशेष रूप से वृद्धि की अभिव्यक्ति की विशेषता है CCR5 और CXCR3 परिधीय रक्त1,4,5के भीतर टी कोशिकाओं की तुलना में । कुल मिलाकर, मौजूदा डेटा अवधारणा के साथ संगत कर रहे है कि फेफड़ों के अभिलक्ष्यन टी लिम्फोसाइटों शारीरिक या भड़काऊ शर्तों के तहत विभिंन chemokine रिसेप्टर्स और उनके संबंधित लाइगैंडों की एक संख्या शामिल है और इस प्रकार महत्वपूर्ण एक बारीकी पर निर्भर करता है सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच नियंत्रित सहयोग1. विशेष रूप से, रोगज़नक़ या allergen जोखिम के प्रारंभिक चरण के दौरान, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं TLR उत्तेजना या IgE-mediated पार अलग chemoattractants की तत्काल रिहाई, LTB4, CCL1, CCL17 की तरह से जोड़ने के लिए जवाब, CCL22, CCL20, CXCL10 और pgd21,6,7. एक प्रमुख उदाहरण के रूप में, PGD2 और chemoattractant रिसेप्टर CRTh2 के बीच बातचीत Th2 कोशिकाओं के chemoattractant के लिए विशेष महत्व का होने के लिए जाना जाता है और इस तरह अस्थमा के नैदानिक प्रबंधन में वादा चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में दिखाई दिया । दरअसल, उदारवादी अस्थमा के रोगियों के लक्षण और एक दूसरे में मजबूर expiratory मात्रा की एक महत्वपूर्ण वृद्धि (fev1) एक चयनात्मक CRTh2 विरोधी के साथ उपचार के बाद placebo समूह8 की तुलना में एक सुधार दिखाया ,9. भड़काऊ प्रतिक्रिया की एक अधिक प्रगति की स्थिति में, पहले से ही भर्ती टी कोशिकाओं को और अधिक पल्मोनरी डीसी के लिए शक्तिशाली उत्तेजन के रूप में IL-4 और आईएल-13 की रिहाई के माध्यम से फेफड़े लिम्फोसाइट संचय बढ़ाना कर सकते हैं । बाद में, इन myeloid व्युत्पन्न जन्मजात कोशिकाओं अप-एक STAT6-निर्भर तरीके से1,10,11में CCL17 और CCL22 की अभिव्यक्ति को विनियमित.  हालांकि वर्णित परिदृश्य की जटिलता अभी भी टी सेल फेफड़ों homing की एक पूरी समझ बाधा, यह भड़काऊ या एलर्जी फेफड़े के रोगों के एक संभावित अनुकूलित चिकित्सकीय नियंत्रण के लिए आणविक लक्ष्य के एक बहुतायत प्रदान करता है । इसलिए, अभिनव प्रायोगिक तकनीकों की तत्काल जरूरत है, जो टी सेल chemoटैक्सियों और फेफड़ों के homing के क्षेत्र में हमारे ज्ञान को और गहरा और पूरक करने में सक्षम हैं ।

तथ्य यह है कि फेफड़ों के मानव शरीर के भीतर लिम्फोसाइटों के अभिलक्ष्यन कई सेलुलर, humoral और भौतिक मानकों1से प्रभावित है के कारण, मौजूदा प्रयोगात्मक विधियों में से अधिकांश इस प्रतिरक्षा प्रक्रिया की पूरी जटिलता मॉडल करने में सक्षम नहीं हैं । इसके बजाय, फेफड़ों के विश्लेषण के लिए कई मानक प्रोटोकॉल एक विशिष्ट लिम्फोसाइट आकर्षण, आसंजन, प्रवास और अवधारण के झरना में शामिल पहलू पर ध्यान केंद्रित अभिलक्ष्यन । परिधीय या फेफड़ों पर integrins और chemokine रिसेप्टर्स की एमआरएनए या प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के एक विशुद्ध रूप से वर्णनात्मक निर्धारण के अलावा लिम्फोसाइटों घुसपैठ और रक्त में संबंधित chemokine के स्तर के पूरक माप, ब्रोंकोएल्वेओलर लेवेज (बाल) या फुफ्फुसीय ऊतक12,13,14,15, विट्रो कोशिका संस्कृति में अच्छी तरह से स्थापित assays लिम्फोसाइट आसंजन या chemoटैक्सियों के एक कार्यात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति पर निर्धारित प्रयोगात्मक शर्तों16,17,18। सिद्धांत रूप में, विट्रो आसंजन assays में स्थैतिक एक endothelial मोनोलेयर करने के लिए या कांच की स्लाइड को पुनः संयोजक endothelial आसंजन अणुओं (जैसे, madcam-1, vcam-1), जबकि विट्रो में मानक के साथ लेपित करने के लिए सुसंस्कृत लिम्फोसाइटों की बाध्यकारी क्षमता की निगरानी chemoटैक्सियों assays आमतौर पर आदेश में लागू कर रहे है लिम्फोसाइटों की क्षमता एक transwell प्रणाली19में एक chemotaxis ढाल के साथ विस्थापित करने की मात्रा । दोनों विट्रो सेटिंग्स में एक नियंत्रित समायोजन और प्रयोगात्मक स्थितियों के मॉडुलन सक्षम है, लेकिन दूसरी ओर महत्वपूर्ण vivo chemoटैक्सियों और लिम्फोसाइटों की आसंजन में गंभीर रूप से प्रभावित करने के लिए जाना जाता चर की कमी है । मुख्य रूप से, स्थैतिक सेल संस्कृति assays कतरनी बलों के प्रभाव की उपेक्षा स्थाई रक्त प्रवाह19 और संभावित आसपास प्रतिरक्षा वातावरण की भागीदारी उपेक्षा और गैर लिम्फोसाइट प्रतिरक्षा कोशिकाओं बातचीत के कारण, दोनों एक जीवित जीव में मौजूद हैं । आदेश में इन सीमाओं को दूर करने के लिए, परिणामों की व्याख्या में स्थिर में प्राप्त विट्रो chemoटैक्सियों या पालन assays गतिशील आसंजन प्रयोगों में प्रवाह की स्थिति में आगे सत्यापन की जरूरत है20,21 और में विवो मॉडल भड़काऊ अंग विकृति के19। वास्तव में, टी के विनियमन पर महत्वपूर्ण निष्कर्ष सेल फेफड़े के तहत अभिलक्ष्यन भड़काऊ या एलर्जी की स्थिति पशु अध्ययन से तैयार किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित अलग फेफड़े के रोगों के परिभाषित मॉडल में चूहों का विश्लेषण3, 22 , 23. एक विशेष सेलुलर के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और मोटे तौर पर इस्तेमाल किया उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ब्याज की एक विशिष्ट जीन के लिए एक कमी के साथ वाइल्डटाइप चूहों और चूहों के बीच लिम्फोसाइटों घुसपैठ फेफड़ों की मात्रात्मक तुलना टी सेल वितरण के रोग चालित पैटर्न पर रास्ते या रिसेप्टर्स । हालांकि, विट्रो सेल संस्कृति assays में चर्चा से पहले के विपरीत, शास्त्रीय पशु मॉडल पर आधारित एक अध्ययन के डिजाइन का विश्लेषण करने और प्राथमिक मानव टी सीधे रक्त या एक भड़काऊ फेफड़ों से पीड़ित रोगियों के बाल से व्युत्पंन कोशिकाओं की निगरानी करने की क्षमता का अभाव रोग. इस प्रकार, यह अभी भी कार्यात्मक रूप से सत्यापित करना है कि क्या एक नैदानिक निर्दिष्ट फेफड़ों की बीमारी के लिए तरजीही फेफड़ों अनुवर्तन के लिए मानव लिम्फोसाइटों छाप में सक्षम है और कैसे दूर क्लिनिकल मापदंडों इस परिदृश्य पर प्रभाव पड़ सकता है चुनौतीपूर्ण रहता है । हाल ही में, vivo दृष्टिकोण में एक बहुत ही सुरुचिपूर्ण भड़काऊ आंत्र रोगों के संदर्भ में पेश किया गया था (ibd), जो इन सीमाओं के सबसे दूर करने में सक्षम था और आंतों लिम्फोसाइट अभिलक्ष्यन पर उन्नत शोधों अध्ययन के लिए नए रास्ते खोल दिया24 . एक शक्तिशाली इमेजिंग उपकरण के रूप में क्रॉस-सेक्शनल लाइट शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बाद विलायक-आधारित ऊतक समाशोधन के लिए प्रोटोकॉल का लाभ उठाते हुए, यह संभव था कि घुसपैठ और adoptively हस्तांतरित मानव टी कोशिकाओं के वितरण की कल्पना कोलाइटिक इमयूनो चूहों की आंत में24. विशेष रूप से, इस प्रायोगिक सेटिंग दो मुख्य नवाचारों को लागू किया: (1) प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के तहत वीवो शर्तों में परिभाषित प्रयोगात्मक विश्लेषण किया जा सकता है; (2) रोगग्रस्त अंग का एक अपेक्षाकृत बड़ा क्षेत्र (लगभग १.५ सेमी x १.५ सेमी) उच्च संकल्प गुणवत्ता में imaged जा सकता है, 3 डी पुनर्निर्माण के बाद । इसके अलावा, कई हाल ही के अध्ययनों को सफलतापूर्वक उंनत फेफड़ों इमेजिंग25,26के लिए महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सॉल्वेंट आधारित ऊतक समाशोधन और प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग की स्थापना की । आदेश में फेफड़े प्रतिरक्षा विज्ञान के क्षेत्र में इस तकनीकी प्रगति से लाभ के लिए, अब हम फेफड़ों के homing के विश्लेषण के लिए प्रणाली को अपनाया ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रदान करता है एक कदम दर कदम परिचय कैसे शुद्ध करने के लिए और प्रतिदीप् त लेबल प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं प्रेरित फेफड़े की सूजन के साथ चूहों में हस्तांतरण के लिए और, इसके अलावा, विस्तार से प्रकाश की अनुवर्ती प्रक्रिया में वर्णन करता है चादर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी इमेजिंग, अंग तैयार करने और छवि प्रसंस्करण सहित । कुल मिलाकर, हम एक परिष्कृत शुरू करने से भड़काऊ या एलर्जी फेफड़ों के रोगों के क्षेत्र में भविष्य शोधों अध्ययन का समर्थन करने की उंमीद है, लेकिन फिर भी संभव है, मानव लिम्फोसाइट की निगरानी के लिए प्रायोगिक मॉडल vivo स्थितियों में पर अभिलक्ष्यन फेफड़ों ।

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Protocol

जानवरों को शामिल करने के प्रयोगों Erlangen में प्रासंगिक स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया (Regierung वॉन Unterfranken, Würzburg, जर्मनी) । चूहों विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत घर में थे । मानव रक्त के संग्रह स्थानीय नैतिक समिति और Erlangen-न्यूरेमबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । प्रत्येक मरीज को लिखित सूचित सहमति दी ।

1. चूहों में एलर्जी फेफड़ों की सूजन को प्रेरित

नोट: पहले27अध्ययनों में वर्णित के रूप में, निंनलिखित प्रायोगिक प्रक्रिया चूहों में एलर्जी airway सूजन उत्प्रेरण की अनुमति देता है और, तदनुसार, बाल में जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संचय चलाता है । वर्णित प्रोटोकॉल C57BL/6J चूहों में स्थापित किया गया है, लेकिन अन्य मानक अंतर्जनित उपभेदों को अपनाने संभव होना चाहिए.

Vivo प्रयोगात्मक प्रक्रिया में एक सारांश के लिए चित्रा 1ए देखें ।

  1. Ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों Anesthetize/
    नोट:     केवल का उपयोग करें C57BL/6J चूहों से पुराने 6 सप्ताह और एक शरीर के वजन के साथ कम से 16 जी.
    1. पीबीएस (12 मिलीग्राम/एमएल ketamine; १.६ मिलीग्राम/एमएल xylazine) में ketamine/xylazine समाधान तैयार है और चूहों के सही शरीर के वजन का निर्धारण ।
    2. Ketamine के 8 μL/g bodyweight के साथ पहले माउस सुई/xylazine समाधान intraperitoneally और कदम १.३ करने के लिए आगे बढ़ने से पहले पंजा चुटकी पलटा की अनुपस्थिति के माध्यम से गहरी संवेदनाहरण की पुष्टि करें ।
  2. नए सिरे से पीबीएस में 5 मिलीग्राम/मिलीलीटर की तैयार करें । धीरे से पिपेट 10 μL (५० μg) नथुने में पापेन घोल का. ध्यान से जगाने तक माउस की निगरानी ।
  3. प्रयोग में शामिल सभी चूहों के लिए १.१ और १.२ चरणों को दोहराएं । लगातार तीन दिन पर कदम 1.1-1.3 प्रदर्शन ।

2. शुद्ध और प्रतिदीप्ति लेबल मानव परिधीय रक्त सीडी 4+ टी कोशिकाओं

नोट: बाँझ शर्तों के तहत प्रक्रिया कक्ष ।

  1. एक परिधीय शिरा से 18 मिलीलीटर पूर्ण मानव रक्त लीजिए । परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMC) के अंश का चयन करने के क्रम में Ficoll-Hypaque ढाल अपकेंद्रण प्रदर्शन.
    नोट: प्राथमिक मानव सामग्री का संग्रह और विश्लेषण स्थानीय नैतिक अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किए जाने की आवश्यकता है । केवल एक पर्याप्त चिकित्सा योग्यता वाले व्यक्ति को परिधीय शिरा से रक्त एकत्र करने की अनुमति है ।
    1. के थक्के से बचने के लिए (१.६ मिलीग्राम EDTA/एमएल रक्त)-एटिलिनेडिऐमिनेटेट्राएसिटिक एसिड (EDTA) युक्त में रक्त ले लीजिए ।
      वैकल्पिक: Buffy कोट रक्त, ल्यूकोसाइट्स में समृद्ध रक्त दान के एक उप उत्पाद का उपयोग करें, बजाय पूरा शिरापरक रक्त की ।
    2. एक शंकु ५० मिलीलीटर ट्यूब में रक्त हस्तांतरण और फॉस्फेट buffered खारा (PBS) में 1:2 पतला । ध्यान से 10 मिलीलीटर की फिडॉल-मीडियम (घनत्व १.०७७ g/mL) को पतला रक्त के नीचे की परत के रूप में जोड़ें । सेंट्रीफ्यूज नमूना (ब्रेक के बिना कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ८०० एक्स जी ) ।
    3. ध्यान से सेंट्रीफ्यूज से ट्यूब निकालें और एक नया शंकु ५० मिलीलीटर ट्यूब में PBMC-युक्त इंटरफेज हस्तांतरण । ऊपरी और निचली परत छोड़ें । PBMC और सेंट्रीफ्यूज (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी ) के साथ pbmc युक्त ट्यूब भरें । अधिनतांत हटा दें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि आवश्यक हो, शेष एरिथ्रोसाइट्स के lysis प्रदर्शन । ध्यान से 3 मिलीलीटर अमोनियम क्लोराइड-पोटेशियम (एसीपी) lysis बफर (१५५ मिमी अमोनियम क्लोराइड, 19 मिमी पोटेशियम हाइड्रोजन कार्बोनेट और ०.६८ मिमी edta; पीएच ७.२७) के लिए सस्पेंड सेल गोली और भंवर नमूना जोड़ें । 3 मिनट के लिए ट्यूबों हिला । एसीपी lysis बफर को हटाने के लिए, PBS के ४० मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी ) जोड़ें । परवर्तनांत.
  2. सीडी 4 के माध्यम से 4+ टी कोशिकाओं को शुद्ध microbeads ।
    नोट: सामांय में, वहां मानव सीडी 4 के शुद्धिकरण के लिए चुंबकीय microbeads के कई वितरकों+ कोशिकाओं, जो कोशिका शुद्धता के तुलनीय स्तर में परिणाम होना चाहिए रहे हैं । उत्पाद विकल्प व्यक्तिगत वरीयताओं पर आधारित होना चाहिए । प्रोटोकॉल के निंनलिखित कदम (2.2.2 – 2.2.7) एक परिभाषित सीडी 4 माइक्रोमनका उत्पाद और संबंधित जुदाई कॉलम के रूप में आगे सामग्री की मेजमें संकेत करने के लिए समायोजित कर रहे हैं । प्रोटोकॉल के कुछ संशोधनों के मामले में आवश्यक हो सकता है कि एक वैकल्पिक सीडी 4 माइक्रोमनका उत्पाद चुना है ।
    1. प्रति 107 पीबीएमसी में ०.५% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 2 एमएम एडटा (पीबीएस/एफबीएस/एटीए-बफर) युक्त न्यूनतम ८० ΜL pbs में pbmc पैलेट को पुन भिजवाएं । के बारे में 30 x 10 6 pbmc की एक प्रारंभिक जनसंख्या का उपयोग करने के लिए अंत लगभग 3 x 106 से 6 x 106 शुद्ध मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं के साथ ।
    2. 107 PBMC प्रति सीडी 4 के माइक्रोमोड्स के 20 Μl जोड़ें, मिश्रण धीरे और 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेते । PBS/FBS/EDTA-बफर (4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा) और सेंट्रीफ्यूज (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g ) के साथ ट्यूब भरें । अधिनतांत निकाल.
    3. एक पृथक्करण कॉलम को चुंबकीय क्षेत्र में रखें । 3 मिलीलीटर PBS/FBS/EDTA-बफ़र के साथ स्तंभ कुल्ला । पीबीएस/एफबीएस/एटीए-बफर (4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा) के ५०० μL में कोशिका गोली को पुनः भिजवाएं और कोशिका निलंबन को एक चुंबकीय क्षेत्र के भीतर रखे गए रिनसेड पृथक्करण कॉलम पर अंतरित करें ।
    4. पृथक्करण कॉलम को तीन बार पीबीएस/एफबीएस/एटीए-बफर (4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा) के साथ कुल्ला करें और बहिस्त्राव को त्याग दें ।
    5. चुंबकीय क्षेत्र से पृथक्करण कॉलम निकालें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह है । प्लर का उपयोग करके 5 मिलीलीटर में PBS/FBS/EDTA-बफ़र में सीडी 4+ सेल अंश को elute ।
    6. PBS और सेंट्रीफ्यूज (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी ) के साथ ट्यूब भरें । अधिनतांत निकाल. इस वाशिंग स्टेप को दो बार दोहराएं ।
    7. पसंद की एक मानक विधि द्वारा उपज कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण (जैसे, Neubauer चैंबर).
  3. लेबल सीडी 4+ एक फ्लोरोसेंट सेल प्रसार डाई के साथ टी कोशिकाओं ।
    1. PBS (10 7 कक्षों/mL; PBS के ५०० μL से कम का उपयोग न करें) में Resuspend सीडी4 + टी कोशिकाओं ।
    2. एक लाल बत्ती के एक 6 μM समाधान तैयार सेल प्रसार डाई ( सामग्री की मेजदेखें) pbs में (कमरे के तापमान के लिए पूर्व गरम) । मिश्रण से पहले तैयार सेल निलंबन और भंवर अच्छी तरह से (3 μM अंतिम एकाग्रता) के साथ इस समाधान 1:2 ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस (प्रकाश से संरक्षित) में 10 मिनट के लिए सेते । बाद में, RPMI 10% FBS और बर्फ पर 5 मिनट के लिए (प्रकाश से संरक्षित) के लिए सेते युक्त मध्यम के पांच खंड जोड़ें ।
    4. लेबल कोशिकाओं को तीन बार धो RPMI 10% FBS (३०० x जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज) युक्त मध्यम में । रीसपेंड, पीबीएस में कोशिकाओं लेबल, बर्फ पर स्टोर और उपयोग तक प्रकाश से बचाने के लिए ।
      नोट: कोशिकाओं के लंबे समय तक भंडारण (> 60 मिनट) के सेल अस्तित्व पर नकारात्मक प्रभाव हो सकता है ।
      वैकल्पिक: सीडी 4+ सेल अंश की शुद्धता और प्रवाह cytometry द्वारा लेबलिंग प्रक्रिया की प्रभावकारिता का निर्धारण । Resuspend ०.५ x 106 करने के लिए 1 x 106 सीडी 4+ बफर के १०० μl में कोशिकाओं (1% fbs, PBS में 2 मिमी edta) और एक विरोधी मानव सीडी 4 पसंद की एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ युग्मित एंटीबॉडी जोड़ें । 4 ° c पर 30 मिनट के लिए इनसेबेट । 1 मिलीलीटर बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० एक्स जी ) । परवर्तनांत. नमूना के प्रवाह cytometric माप के साथ आगे बढ़ें (प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1बी, सी) में दर्शाया गया है.

3. Adoptively स्थानांतरण मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं में papain-उजागर प्राप्तकर्ता mmice

नोट: देखें चित्रा 1एक सारांश के लिए vivo में प्रयोगात्मक प्रक्रिया का प्रदर्शन किया । पापेन के अंतिम दुराकाल प्रशासन के एक दिन बाद कक्ष हस्तांतरण निष्पादित करें ।

  1. प्रतिदीप्ति के निलंबन को समायोजित करें लेबल मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं (चरण 2.3.4) 1 x 107 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए/ सेल सस्पेंशन के १०० μL को 1 mL/30 ग्राम सिरिंज में भरें ।
  2. ध्यान से पहले papain-उजागर C57BL/6J माउस (कदम 1.1-1.3) पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एक संयम डिवाइस में जगह है । तैयार सिरिंज (चरण ३.१) का उपयोग करने के लिए पूंछ नस पंचर और धीरे से सेल निलंबन के १०० μL इंजेक्शन 1 x 106 लेबल मानव सीडी 4+ कोशिकाओं से युक्त । तुरंत इंजेक्शन के बाद सुई बाहर खींच नहीं है, लेकिन अतिरिक्त 5 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें ताकि सेल निलंबन के निर्वहन को रोकने के लिए ।
  3. संयम डिवाइस से माउस को छोड़ें और अगले जानवर के साथ आगे बढ़ें । एक papain-उजागर पशु है, जो प्रतिदीप्ति लेबल कोशिकाओं के साथ स्थानांतरण से गुजरना नहीं प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए रखें ।

4. प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए फेफड़ों के ऊतकों को तैयार

नोट: निम्न चरणों का पालन किया जाता है 3 ज प्रतिदीप्ति मानव कोशिकाओं के स्थानांतरण के बाद (चरण ३.२). फेफड़ों के ऊतकों की कटाई, निर्धारण और विलायक आधारित ऊतक समाशोधन सहित वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं वर्तमान में वर्णित प्रोटोकॉल24,28से अनुकूलित किया गया ।

  1. कार्बन डाइऑक्साइड (C02) सांस लेना द्वारा माउस बलिदान ।
  2. 5 मिमी EDTA युक्त PBS के साथ सीटू में फेफड़ों Perfuse.
    1. दिल को बेनकाब करने के लिए उरोस्थि के साथ काटने के माध्यम से छाती खोलें. एक 21 ग्राम कैंला एक कैथेटर से जुड़ा के साथ सही वेंट्रिकले कबरा ।
    2. काटने से बाईं वेंट्रिकले खोलें और जिससे रक्त और छिड़काव द्रव बाहर निकलने के लिए अनुमति देते हैं । धीरे से 20 मिलीलीटर बर्फ के साथ फेफड़े शवद-ठंडे pbs कैथेटर के माध्यम से 5 मिमी edta युक्त ।
  3. आदेश में फेफड़ों के यथास्थान निर्धारण में प्रदर्शन करने के लिए, सही वेंट्रिल से कैथेटर को दूर नहीं है । 2 मिलीलीटर बर्फ से ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ फेफड़ों को धीरे से गंजा कर PBS में हल करें । कैथेटर और प्रवेसूल निकालें ।
    नोट: पीएफए आधारित फेफड़ों के ऊतकों की यथास्थान निर्धारण में एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक का प्रतिनिधित्व करने के लिए बाद में सूक्ष्म विश्लेषण के लिए म्यूरिन फेफड़ों के ऊतकों को तैयार करने के लिए29,30.
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और देखभाल के साथ एक डाकू के तहत संभाला जाना है ।
  4. ०.७५% ऐगेरोस के साथ फेफड़ों को सीटू में भरें ।
    1. Pbs में ०.७५% ऐगेरोस तैयार है और यह एक थर्मो-शेखर में ५० डिग्री सेल्सियस पर ठोस रखने के लिए उपयोग जब तक । माउस की लार ग्रंथियों को हटा दें, sternohyoid मांसपेशियों में कटौती और नीचे एक संदंश फिसलने से श्वासनली बेनकाब ।
    2. एक 30 ग्राम सुई के साथ उजागर श्वासनली को विराम दें और यह एक कुंद 30 ग्राम कैथेटर द्वारा प्रतिस्थापित करने के लिए आगे की क्षति को रोकने के लिए श्वासनली के अवांछित रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप अग्राज । एक सुई धारक का उपयोग कर डाला कैथेटर और श्वासनली के बीच जंक्शन सील.
      वैकल्पिक: बाल संग्रह के साथ यहां वर्णित प्रक्रिया का मिश्रण के रूप में हाल ही में विस्तार से31 में वर्णित bal में घुसपैठ मानव कोशिकाओं का विश्लेषण (प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्रा 2ई देखें) ।
    3. ध्यान से ०.७५% ऐगेरोस के साथ एयरवेज को भरने (शरीर के तापमान को ठंडा) कैथेटर के माध्यम से फेफड़ों का पूरा खुलासा जब तक; अग्रोस के पूर्ण पिंडन तक रुको । कैथेटर निकालें और ध्यान से एक अंधेरी 2 मिलीलीटर 4% पीएफए से भरा ट्यूब में फेफड़ों फसल ।
  5. अतिरिक्त निर्धारण के लिए 4% में सैंपल को सेने के लिए पीबीएस में 2 ज के लिए सतत रोटेशन (31 rpm) के तहत हल किया गया ।
  6. बाद में सतत घूर्णन (31 rpm) के अंतर्गत नमूने को इन्सेलेट करके ५०% एथेनोल (पीएच 9), ७०% एथेनोल (पीएच 9) और १००% एथेनोल में 4 ° सेल्सियस पर डिहाइड्रेट ऊतक; के लिए हर कदम कम से 4 एच । अंत में, 4 एच के लिए ताजा १००% इथेनॉल में एक दूसरे ऊष्मायन प्रदर्शन ।
  7. एथिल सिनेमेट (ईसीआई) का उपयोग कर ऊतक के विलायक-आधारित समाशोधन प्रदर्शन । इसलिए, नमूना ईसीआई में स्थानांतरित करें । कमरे के तापमान पर रात भर सेते (निरंतर रोटेशन के तहत) जब तक ऊतक पारभासी प्रतीत होता है (प्रतिनिधि छवियों के लिए चित्रा 1डी देखें) ।
    नोट: निर्वाचन आयोग में कमरे के तापमान (प्रकाश से संरक्षित) पर संग्रहित नमूने कई हफ्तों से महीनों से स्थिर हैं ।

5. प्रकाश-चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के Wwhole म्यूरिन फेफड़ों Lobes प्रदर्शन

नोट: कृपया प्रकाश-पत्रक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और इसी सॉफ्टवेयर, जिस पर निंनलिखित कदम आधारित है पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें । अंय निर्माताओं द्वारा तुलनीय प्रणालियों, तथापि, के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है डेवलपर के साथ-निंनलिखित प्रोटोकॉल के विशिष्ट संशोधनों । शुरू करने से पहले, माइक्रोस्कोप से परिचित हो-विशिष्ट ऑपरेटिंग मैनुअल और साइट पर जिंमेदार व्यक्ति द्वारा तकनीकी निर्देशों का पालन करें ।

  1. लाइट-शीट माइक्रोस्कोप को सेट करें ।
    1. प्रकाश-पत्रक माइक्रोस्कोप को चालू करें और कंप्यूटर पर संगत इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें । फ़िल्टर ECi (१०० μm फिल्टर) के साथ नमूना चैंबर भरें और लेजर बीम के बीच अपनी स्थिति में जगह है ।
    2. नमूना धारक के लिए फेफड़ों छड़ी करने के लिए कार्बनिक विलायक स्थिर गोंद की एक छोटी सी बूंद का प्रयोग करें । प्रकाश-पत्रकों की आवश्यक पैठ गहराई को यथासंभव छोटा रखने के लिए, फेफड़े के पालि को सीधा सेट करें । अगले, अपने चैंबर में नमूना धारक जगह है ।
    3. ३.५ को समाशोधन अभिकर्मक के रूप में ईसीआई का उपयोग करते समय उद्देश्य का अपवर्तनांक निर्धारित करें ।
  2. पूरे अंग के संदर्भ में मानव कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रकाश-पत्रक माइक्रोस्कोप पर सेटिंग्स समायोजित करें ।
    1. आवश्यक लेजर का चयन करें (माप के लिए फिल्टर > आवश्यक लेजर के चेक बॉक्स को सक्रिय) और नियंत्रण सॉफ्टवेयर में उचित तीव्रता का चयन (लेजरसंचरण नियंत्रण > स्लाइडर का उपयोग करें लेज़र तीव्रता सेट करने के लिए > लागू) । लाल स्पेक्ट्रम में एक फ्लोरोफोर उत्सर्जक के साथ लेबल मानव कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए autofluorescent फेफड़ों के ऊतकों और ६४० एनएम (680/30 फिल्टर) का पता लगाने के लिए ४८८ एनएम (525/50 फिल्टर) के एक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें ।
    2. ४८८ एनएम पर उत्साहित नमूना पर ध्यान केंद्रित करने और ६४० एनएम के उत्तेजन तरंग दैर्ध्य में ' रंगीन सुधार ' उपकरण के माध्यम से ध्यान अनुकूलन (रंगीन सुधार सेट > लागू करने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें) ।
    3. एक उपयुक्त ज़ूम फैक्टर चुनें; फेफड़ों के ऊतकों के भीतर लेबल कोशिकाओं के समग्र वितरण का निर्धारण करने के लिए एक कम आवर्धन सिंहावलोकन (उदा., 6.3 x) का उपयोग करें और विस्तृत स्थानीयकरण के लिए छवियों (उदा., 32x) बढ़ाया ।
    4. एक पत्रक चौड़ाई का चयन करें समान रूप से पूरे अंग या रुचि के एक विशिष्ट अनुभाग (प्रकाशिकी > पत्रक चौड़ाई सेट करने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें, आमतौर पर के बीच 20 – 40%) । पत्रक संख्यात्मक एपर्चर (NA) को उच्च ना बनाने के साथ परिभाषित करें तेज छवियां (प्रकाशिकी > शीट को सेट करने के लिए स्लाइडर का उपयोगकर सकते हैं; एक म्यूरिन फेफड़ों के लिए अपने शारीरिक आकार ०.०२५% की एक NA का विस्तार अक्सर इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
    5. ' उंनत माप सेटिंग्स ' के अंतर्गत उपयोग किए जाने वाले प्रकाश-पत्रकों की संख्या का चयन करें । द्विदिश रोशनी के मामले में, विलय छोड़ दिया और सही प्रकाश चादरें एक homogenously प्रबुद्ध छवि बनाने के लिए (उंनत > lightsheets > का चयन करें मिश्रण मोड > स्लाइडर्स का उपयोग करने के लिए दोनों प्रकाश चादरें के बीच ओवरलैप परिभाषित) ।
      नोट: यह तीन प्रकाश-चादरें प्रत्येक के साथ नमूना की द्विदिश रोशनी का लाभ लेने के लिए सिफारिश की है ।
      वैकल्पिक: छवि गुणवत्ता को आगे बढ़ाने के लिए, गतिशील फ़ोकस कार्रवाई का उपयोग करें । यह छवि अधिग्रहण के दौरान x-दिशा में फ़ोकस स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है ।
    6. मापा जा करने के लिए z-स्टैक के प्रारंभ और समाप्ति स्थितियां निर्धारित करें और चरण आकार 5 μm (xyz-Table z > स्कैन श्रेणी) के लिए सेट करें ।
      नोट: एक जेड स्टैक की शुरुआत और अंत पदों नमूना कक्ष के भीतर फेफड़ों के पालि के आकार और स्थिति पर निर्भर करते हैं । हालांकि, के बारे में ३०० करने के लिए ८०० z-स्टैक आमतौर पर एक एकल फेफड़े पालि (5 μm चरण आकार) के लिए प्राप्त कर रहे हैं ।
    7. ' स्वत: सहेजें सेटिंग्स ' का उपयोग कर फ़ाइलें सहेजें और छवियों पर कब्जा करने के लिए माप शुरू करते हैं । डाटा अधिग्रहण खत्म करने के बाद, ईसीआई-प्रदूषित नमूना धारक और रनिंग वाटर के चैंबर को साफ करें ।
      नोट: छवि के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें कई फेफड़े lobes कि बाद में तुलना की जानी चाहिए रहे हैं ।

6. पोस्ट-छवि प्रसंस्करण और फेफड़ों के परिमाणन मानव कोशिकाओं संचित

नोट: कृपया 3D विश्लेषण के लिए पोस्ट-इमेजिंग सॉफ़्टवेयर पर विवरण के लिए सामग्रियों की तालिका देखें, जिस पर निंन चरण आधारित हैं । हालांकि, वैकल्पिक पोस्ट इमेजिंग सॉफ्टवेयर के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. एक जेड स्टैक की पहली छवि लोड (बढ़चढ़कर बटन, फ़ाइल > खुला > का चयन छवि को सक्रिय) के लिए चुना जेड स्टैक और उनके स्वचालित 3 डी पुनर्निर्माण के अन्य सभी छवियों को खोलने शुरू करने के लिए ।
  2. एक्स, वाई और जेड आयामों का सही प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए, voxel आकार की जाँच करें और उन्हें समायोजित यदि आवश्यक हो तो (संपादित > छवि गुण > voxel आकार मैन्युअल दर्जकरें). Z के voxel आकार के लिए, दो छवियों के बीच चुना कदम आकार दर्ज करें (यहां 5 μm) ।
  3. प्रत्येक चैनल को एक अलग रंग में प्रदर्शितकरें (संपादन > प्रदर्शन समायोजन दिखाएं) । एक के बाद एक दूसरे चैनल पर क्लिक करें पसंद का एक रंग को परिभाषित करने के लिए ( चित्रा में 2ए, बी, सी, डी autofluorescence संकेत ग्रे में प्रदर्शित किया जाता है और लेबल मानव सीडी 4+ लाल में कोशिकाओं) ।
  4. चैनल सलाखों में त्रिकोण का उपयोग कर या चैनल सेटिंग्स में सही संख्या में प्रवेश प्रत्येक चैनल (संपादित > शो प्रदर्शन समायोजन) के लिए तीव्रता, काले स्तर और कंट्रास्ट समायोजित करें । तीव्रता समायोजन के लिए, सही त्रिकोण का उपयोग करें । काले स्तर के समायोजन के लिए, बाएँ त्रिकोण का उपयोग करें और इसके विपरीत समायोजन के लिए, मध्य त्रिकोण का उपयोग करें.
    नोट: कोशिका हस्तांतरण के बिना नियंत्रण माउस से व्युत्पंन फेफड़े का प्रयोग करें (कदम ३.३) के लिए विशिष्ट मानव कोशिका व्युत्पंन संकेतों और अविशिष्ट पृष्ठभूमि के बीच अंतर ।
  5. उपकरण पट्टी में फेफड़े के ऊतकों का उपयोग करें ' नए धब्बे जोड़ें ' के भीतर लेबल कोशिकाओं का परिमाण निर्धारित करने के लिए और मैनुअल सेल गिनती के लिए ' स्वत: निर्माण छोड़ें, मैन्युअल रूप से संपादित करें ' चुनें.
    नोट:     वैकल्पिक रूप से, ' स्पॉट ' के अंतर्गत स्वचालित सेल गिनती उपकरण का उपयोग करें । हालांकि, मैनुअल गिनती के लिए विशिष्ट और अविशिष्ट संकेतों के बीच अंतर अधिक ठीक अनुमति देता है ।
    1. विभिन्न नमूनों में मानव कोशिकाओं के संचय की तुलना करने के लिए, एक विशिष्ट मात्रा के साथ एक फेफड़ों घन परिभाषित 3 डी काटने के उपकरण का उपयोग (संपादित > फसल 3 डी) (यहाँ ८१३ μm x ८१३ μm x १,००० μm).
    2. संचित कोशिकाओं गिनती करने के लिए ६४० एनएम चैनल का चयन करें और 10 μm के एक ' त्रिज्या पैमाने ' को परिभाषित । फिर, पर क्लिक करें 'संपादितकरें ', सूचक मेनू में 'चुनें' चेक और बाईं माउस बटन के साथ shift-क्लिक के माध्यम से एक डॉट के साथ प्रत्येक सेल चिह्नित । आँकड़ों में प्रदर्शित गिने जाने वाले कक्षों की समग्र संख्या ढूँढें.
      नोट: यह अत्यधिक फेफड़ों पालि प्रति कई cubes गिनती की सिफारिश की है (यहां पांच) परिणामों की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए और वैज्ञानिक के लिए क्षतिपूर्ति-गिना फेफड़ों की मात्रा के आश्रित चयन (quantification रणनीति और प्रतिनिधि परिणाम में चित्रित कर रहे हैं चित्र 2D) ।
  6. ' ' स्नैपशॉट उपकरण का उपयोग कर एक छवि पर कब्जा और/या ' एनीमेशन ' उपकरण का उपयोग कर एक वीडियो ले लो । समायोजित फ़ाइलें. ims फ़ाइलें (फ़ाइल > निर्यात) के रूप में सहेजें ।
    नोट: प्रतिनिधि उद्देश्यों के लिए, उपकरण पट्टी में फ़्रेम को चेक या अनचेक करके फ़्रेम दिखाएं या छुपाएं । इसके अलावा, या तो अधिक तीव्रता प्रक्षेपण (MIP) (टूलबार > मात्रा > मोड > mip जांच) के रूप में प्रदर्शित छवियों या ' सतह मोड ' (टूलबार > नई सतहों जोड़ने) का उपयोग करें । ' सतह मोड ' ऊतक वास्तुकला और/या सेल निकायों को उजागर करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए अलग से सक्रिय किया जाना है (प्रतिनिधि छवियों चित्रा 2सीमें दिखाया गया है) ।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल है, जो निगरानी और adoptively स्थानांतरित मानव टी लिम्फोसाइटों के प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से फेफड़ों के संचय को बढ़ाता की अनुमति देता है वर्णन करता है । चित्रा 1 एक प्रयोगात्मक अनुसूची के vivo कदम में एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन प्रदान करता है । आदेश में विश्वसनीय परिणाम की गारंटी के लिए, यह काफी महत्व का है एक अच्छी गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए अलग और प्रतिदीप्ति लेबल मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं, जो बाद में चूहों में स्थानांतरित किया जाएगा । चित्र 1ख, गमें प्रतिनिधित्व के रूप में दर्शाया गया है, माइक्रोमनका आधारित सेल संवर्धन और बाद में प्रतिदीप्ति के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया-लेबल आमतौर पर एक प्रवाह cytometrically निर्धारित सीडी 4+ टी सेल शुद्धता > 95% में परिणाम और सफल प्रतिदीप्ति-सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लेबल । प्रकाश की गुणवत्ता और पैठ गहराई-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी गंभीर ऊतक समाशोधन के एक उपयुक्त ग्रेड पर निर्भर करता है । जैसा कि चित्रा 1डीमें प्रदर्शित किया गया है, ईसीआई आधारित ऊतक समाशोधन के लिए यहां एप्लाइड प्रोटोकॉल अंग पारदर्शिता के एक उच्च स्तर की गारंटी करने में सक्षम था, एक सफल अपवर्तनांक मिलान का संकेत । अंत में, पूरी तरह से संसाधित प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों के रूप में वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का एक प्रतिनिधि समग्र परिणाम चित्रा 2बी, सी, डी और अनुपूरक वीडियोमें प्रदर्शित किया जाता है । Autofluorescent संकेत (ग्रे में प्रदर्शित) इमेजिंग फेफड़ों की अपरमाणुक संरचना के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है । लाल संकेत फेफड़ों संचित मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है । प्रकाश-पत्रक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का परिमाणन, सूजन फेफड़ों के ऊतकों के परिभाषित क्षेत्र के अनुसार मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं संचित फेफड़ों की कुल संख्या का निर्धारण करने की अनुमति देता है । मानव कोशिका घुसपैठ के परिमाण के लिए एक रणनीति चित्रा 2ईमें सचित्र है । (वैकल्पिक) फ्लोरेबल प्राप्तकर्ता चूहों के बाल के भीतर कोशिकाओं लेबल के प्रवाह cytometric का पता लगाने, चित्रा 2एफमें चित्रित के रूप में, एक पूरक तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए adoptively के सफल ऊतक प्रवास की पुष्टि सीडी 4+ टी कोशिकाओं का तबादला । इसके अलावा, यहां वर्णित प्रयोगात्मक सेटिंग में सूजन फेफड़ों के ऊतकों में चयनात्मक संचय के लिए स्थानांतरित मानव टी कोशिकाओं की वरीयता आगे तथ्य यह है कि मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं आंतों म्यूकोसा में प्राप्त नहीं किया जा सकता द्वारा समर्थित किया गया था चित्र 2ख (दायां फलक) में दर्शाए अनुसार प्राप्तकर्ता जानवरों का ।

Figure 1
चित्रा 1 : Vivo प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह में की योजनाबद्ध सिंहावलोकन । (क) C57BL/6j चूहों में एलर्जिक फेफड़ों की सूजन को लगातार तीन दिनों (d0, ड1ी और ड2) पर पापेन (५० μg/mouse) के साँस लेने से प्रेरित किया गया । अगले दिन (डी 3), हौसले से अलग और प्रतिदीप्ति लेबल मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं adoptively पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से चूहों में हस्तांतरित किया गया । एक और तीन घंटे के बाद, चूहों बलिदान, स्वस्थानी छिड़काव और फेफड़ों के निर्धारण में पीछा किया गया । अंत में, फेफड़ों और explanted और आगे प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा vivo विश्लेषण किया गया । वैकल्पिक रूप से, बाल फेफड़े एक्सप्लांटेशन से पहले एकत्र किया जा सकता है सफलतापूर्वक और मानव कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए विस्तारित पूर्व vivo विश्लेषण प्रदर्शन । (B) प्रतिनिधि हिस्टोग्राम प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित के रूप में पृथक सीडी 4+ टी सेल अंश की शुद्धता की पुष्टि । एक विरोधी मानव सीडी 4 एंटीबॉडी या समप्ररूप नियंत्रण द्वारा दाग कोशिकाओं क्रमशः काले और भूरे रंग में प्रदर्शित कर रहे हैं । (ग) दत्तक अंतरण से पहले मानव सीडी 4+ कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-लेबलिंग की प्रभावकारिता की पुष्टि करने वाला प्रतिनिधि हिस्टोग्राम । (घ) निर्वाचन आयोग के साथ समाशोधन से पहले और बाद में एक perfused म्यूरिन फेफड़ों के पालि के प्रतिनिधि चित्र । फाई, प्रतिदीप्ति तीव्रता । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : मानव सीडी 4 के फेफड़े के संचय के प्रतिनिधि विश्लेषण+ vivo में फेफड़ों की सूजन के संदर्भ में कोशिकाओं । मानव सीडी 4+ कोशिकाओं परिधीय रक्त से अलग किया गया घनत्व ढाल केंद्रापसारक का उपयोग कर एक चुंबकीय माइक्रोमनका आधारित शुद्धि कदम के बाद । मानव सीडी 4+ कोशिकाओं एक लाल बत्ती उत्तेजित सेल प्रसार डाई का उपयोग कर लेबल और papain में नसों में इंजेक्शन-उजागर C57BL/ तीन घंटे के बाद, चूहों को इकट्ठा करने और आगे प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से फेफड़ों के ऊतकों का विश्लेषण बलि दिया गया । (क) एक 3 डी पुनर्निर्माण के murine के प्रतिनिधि सिंहावलोकन, papain-उजागर फेफड़ों के ऊतकों (ग्रे) लेबल मानव सीडी 4+ कोशिकाओं के नसों में इंजेक्शन के बाद तीन घंटे (लाल) के रूप में प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज की गई । (ख) एक प्राप्तकर्ता माउस के फेफड़ों के ऊतकों तीन घंटे के बाद सेल हस्तांतरण सिंहावलोकन या उच्च आवर्धन खंड (बाएं पैनल) के रूप में दिखाया गया है । अभिगमन तिथि: मानव सीडी 4+ कोशिकाओं लाल संकेतों के रूप में कल्पना किया जा सकता है और या तो फेफड़ों के ऊतकों के autofluorescence संकेत के साथ या एकल चैनल छवि के रूप में ओवरले में दर्शाया गया था. पता लगाया संकेत की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, नसों में कोशिका हस्तांतरण के बिना नियंत्रण फेफड़ों के ऊतकों नकारात्मक नियंत्रण (मध्य पैनल) के रूप में कार्य किया । फेफड़ों के ऊतकों के विपरीत, कोई लेबल मानव सीडी 4+ कोशिकाओं (लाल) एक ही प्राप्तकर्ता माउस (सही पैनल) के शेषान् त्र में पाया जा सकता है । (ग) पोस्ट इमेज प्रोसेसिंग फेफड़ों के ऊतकों के एकल स्लाइस के विश्लेषण की अनुमति देता है और साथ ही पूरे अंग खंड के 3 डी रिकंस्ट्रक्शन का उत्पादन करता है जिसे या तो अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) या सतही मोड के रूप में दर्शाया जा सकता है । प्रतिनिधि छवियों को दर्शाया गया है । (घ) परिमाणन कार्यनीति को उसी फेफड़े में एक ही रूप में दर्शाया गया है जैसा कि चित्रा 2 विश्लेषण किया फेफड़ों खंड के परिभाषित cubes चयनित और मानव सीडी 4 की संख्या+ कोशिकाओं (लाल) प्रत्येक घन के लिए मात्रा निर्धारित गया था । बाद में निष्पादित परिमाणन के परिणाम (इवेंट/813 μm x ८१३ μm x १,००० μm घन) को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया गया है । (ङ) एक अतिरिक्त विकल्प के रूप में, प्राप्तकर्ता पशुओं के बाल में प्रतिदीप् त रूप से लेबल मानव टी कोशिकाओं के प्रवाह cytometric का पता लगाने जा सकता है जमा मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं के सफल ऊतक प्रवास की पुष्टि करने के क्रम में प्रदर्शन किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Video
अनुपूरक वीडियो: प्रतिनिधि वीडियो अनुक्रम-म्यूरिन फेफड़ों के ऊतकों के भीतर संचित मानव सीडी 4+ कोशिकाओं दिखा । 3 डी म्यूरिन फेफड़ों की पूंछ नस में अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद तीन घंटे फेफड़े के ऊतकों (ग्रे) के संदर्भ में संचित मानव सीडी 4+ कोशिकाओं (लाल) प्रदर्शित करने के पुनर्निर्माण । छवियां शुरुआत में MIP के रूप में और अंत में सतह मोड में दिखाए जाते हैं । छवियां प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त की और 3 डी विश्लेषण के लिए पोस्ट-इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा संसाधित किया गया । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यहां वर्णित प्रयोगात्मक सेटिंग के तहत vivo भड़काऊ परिस्थितियों में प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की फेफड़ों के अभिलक्ष्यन क्षमता की निगरानी और इस तरह प्रासंगिक रूप से प्रतिष्ठित विट्रो आसंजन और chemoटैक्सियों में प्रदर्शन पूरक का अवसर प्रदान करता है assays. फेफड़ों के विशिष्ट अपरमाणुवीय अंग विशेषताओं में लेने के लिए, प्रतिरक्षा सेल अभिलक्ष्यन के महत्वपूर्ण पहलुओं (लक्ष्य अंग के भीतर chemoटैक्सियों और सेल वितरण सहित) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक प्रासंगिकता और अधिग्रहण डेटा के हस्तांरणीयता, हम ले लिया तीन तकनीकी प्रमुख विशेषताओं का लाभ: (1) एक जीवित म्यूरिन जीव के भीतर प्राथमिक मानव कोशिकाओं का विश्लेषण; (2) फुफ्फुसीय शोथ के पापेन-मध्यस्थता प्रेरण; और (3) प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की मंजूरी दे दी फेफड़ों के ऊतकों ।

हालांकि adoptively के कार्यात्मक अध्ययन एक जीवित murine जीव के भीतर मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं हस्तांतरित कुछ रिसेप्टर में संभावित प्रासंगिक incompatibilities के कारण पहलुओं में सीमित किया जा सकता है-ligand-चूहों और पुरुषों के बीच बातचीत, सामांय अवधारणा के humanized माउस मॉडल सफलतापूर्वक शोधों दवा के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रायोगिक उपकरण के रूप में पिछले दशकों के दौरान स्थापित किया गया है24,३२,३३,३४,३५ . शास्त्रीय पशु मॉडल की तुलना में, humanized चूहों में अध्ययन करने के लिए सीधे रोगी का विश्लेषण करने के लिए लाभ की पेशकश में एक vivo परिदृश्य में प्रतिरक्षा कोशिकाओं व्युत्पंन और इस तरह के लिए विशेष रोग३२द्वारा मुद्रित कार्यात्मक परिवर्तन की पहचान करने के लिए, ३६,३७. मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सतह पर परिभाषित रिसेप्टर्स के बीच संभावित बेमेल की प्रासंगिकता के बारे में और उनके संबंधित म्यूरिन लाइगैंडों या इसके विपरीत, पूर्व अध्ययनों से पहले ही संकेत दिया है कि मानव सीडी 4+ टी कोशिकाओं को कुशलता से बातचीत करने में सक्षम हैं के साथ म्यूरिन आसंजन अणुओं madcam-1 और vcam-1, जो integrin-mediated लिम्फोसाइट अभिलक्ष्यन३२के लिए महत्वपूर्ण लाइगैंडों प्रतिनिधित्व करते हैं । तदनुसार, इंट्रावैस्क्यूलर स्थानांतरण मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को म्यूरिन आंत ऊतक में सफलतापूर्वक विवो में नैदानिक प्रयुक्त α4β7 integrin एंटीबॉडी vedolizumab३२के साथ उपचार के द्वारा अवरोधित किया जा सकता है । हालांकि, यह भी है कि एक विशिष्ट रिसेप्टर-ligand-प्रासंगिकता के संपर्क में एक पूरी तरह से मानव/murine बेमेल दिखा सकता है, यह संभवतः आनुवंशिक इंजीनियरिंग द्वारा इस सीमा पर काबू पाने के लिए संभव हो जाएगा और, उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक overexpression द्वारा संबंधित मानव लिगल, विकास कारक, cytokine या रिसेप्टर के भीतर murine जीव३३,३५.

Chemokines के स्थानीय स्राव पर जीर्ण सूजन का एक महत्वपूर्ण प्रभाव के रूप में, आसंजन अणुओं की endothelial अभिव्यक्ति और लिम्फोसाइटों के बाद संचय कई प्रकाशनों में वर्णित किया गया है३८,३९ ,४०, फुफ्फुसीय सूजन के एक उपयुक्त प्रायोगिक मॉडल का चुनाव एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हुए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल की स्थापना और प्रत्येक व्यक्ति के अध्ययन के नैदानिक संदर्भ पर निर्भर हो सकता है अनुकूलित । पापेन के यहां चयनित सेटिंग-प्रेरित एलर्जी फेफड़ों की सूजन का प्रतिनिधित्व करता है एक अच्छी तरह से वर्णित प्रयोगात्मक मॉडल, जो स्थानीय रूप से प्रशासित सिस्टीन प्रोटीज़ papain की क्षमता पर आधारित है airway उपकला परेशान और ट्रिगर अलमिंस27,४१,४२के बाद जारी । दिलचस्प रूप से, papain को आकस्मिक प्रदर्शनी के रूप में अच्छी तरह से४३मनुष्यों में अस्थमा के विकास के कारण जाना जाता है । Papain की सांस की खुराक पर निर्भर, उजागर चूहों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं और प्रकार के उच्च स्तर के एक संचय दिखाने के 2 साइटोकिंस में फेफड़ों27। जबकि खुराक वृद्धि बाहर हवाई स्थानों की एक वृद्धि में परिणाम (copd के क्लासिक ऊतकीय घटना) और बाद में नकसीर के साथ रक्त वाहिका दीवारों का विनाश, उदारवादी खुराक कार्यक्रम एक प्रमुख फेफड़े इओसिनरागिता के साथ चला गया और इस प्रकार मानव अस्थमा27के एक महत्वपूर्ण ऊतकीय विशेषता मजाक उड़ाया । जैसा कि हमारे उद्देश्य के लिए इस प्रायोगिक मॉडल का उपयोग करने के लिए फेफड़े के प्रतिरक्षा सेल homing के विश्लेषण के लिए एक भड़काऊ संदर्भ उत्पंन था, हम ध्यान से papain से बचने की कोशिश की-रक्त वाहिकाओं, जो अंयथा एक गैर शारीरिक परिणाम हो सकता है प्रेरित नुकसान मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहिर्वेशन endothelial अखंडता के कारण परेशान । तदनुसार, हम ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में प्रति दिन माउस की ५० μg की एक मध्यवर्ती खुराक का चयन किया । हालांकि papain प्रेरित एयरवे सूजन के विकास भी बी और टी लिम्फोसाइटों की अनुपस्थिति में होता है, फेफड़ों की घुसपैठ अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रोग के पाठ्यक्रम पर काफी प्रभाव के लिए जाना जाता है27,४२। उदाहरण के लिए, विनियामक टी कोशिकाओं को पापेन-प्रेरित एयरवे इओसिनोफिलिया27के प्रबल नियामकों के रूप में पहचाना जा सकता है । परिप्रेक्ष्य में, papain के भड़काऊ रोगजनन में फुफ्फुसीय लिम्फोसाइटों की सक्रिय भागीदारी-उजागर चूहों कि ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल इसके अलावा में adoptively हस्तांतरित की कार्यात्मक क्षमता का विश्लेषण करने के लिए सक्षम हो सकता है सफलतापूर्वक फेफड़ों संचित मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं फेफड़ों की विकृति को मिलाना (जैसे, बाल में इओसिनोफिलिक गिनती के प्रवाह cytometric अधिग्रहण के माध्यम से). इसके अलावा, एक अतिरिक्त चयनित रोग के इंट्रानासल प्रशासन का प्रदर्शन किया-प्रासंगिक मानव chemokines बस intravascular सेल हस्तांतरण करने से पहले के लिए अलग मानव की फेफड़ों अभिलक्ष्यन प्रक्रिया पर इन humoral मध्यस्थों के प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति हो सकती है विवो सेटिंग में एक में प्रतिरक्षा सेल आबादी । इसी तरह, फेफड़ों अभिलक्ष्यन प्रक्रिया पर inhibitors के प्रभाव और, बाद में, भड़काऊ फेफड़ों की विकृति पर अध्ययन किया जा सकता है ।

यहां की एक विशेष लाभ प्रयोगात्मक प्रक्रिया शुरू की सटीक ट्रैकिंग और फेफड़ों के स्थानीयकरण उच्च अंत प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के इमेजिंग गुणवत्ता से मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ है । हाल के अध्ययनों से पहले ही प्रदर्शन किया है कि प्रकाश की तकनीक शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है आंतों प्रतिरक्षा कोशिका शोधों ibd अनुसंधान में अभिलक्ष्यन और की मुख्य सीमाओं को दूर करने में सक्षम है पारंपरिक इमयूनोफ्लोरीसेंस माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry24,३२। जबकि विश्लेषण पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के आधार पर आम तौर पर एक बहुत छोटे और संभावित अंग और प्रवाह cytometry के प्रतिनिधि क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित कर रहे है खाते में ऊतक संगठन के पहलू बिल्कुल नहीं ले, प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रासायनिक मंजूरी दे दी ऊतक के समाधान के प्रमुख नुकसान के बिना एक वृद्धि की पैठ गहराई की अनुमति देता है और इस प्रकार बल्कि बड़े अंग वर्गों के एक 3 डी पुनर्निर्माण सक्षम बनाता है (अप करने के लिए १.५ सेमी x १.५ सेमी)24,28,४४। यकीन के लिए, गुणवत्ता और अधिग्रहण 3 डी सलाइन की वैधता गंभीर ऊतक निकासी के प्रदर्शन पर निर्भर करते हैं । यहां वर्णित सेटिंग में, हम ईसीआई आधारित ऊतक समाशोधन४४के लिए हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक थोड़ा अपनाया संस्करण शामिल हैं । सॉल्वेंट आधारित ऊतक समाशोधन के लिए अन्य अच्छी तरह से स्थापित रणनीतियों की तुलना में26,४५,४६, ईसीआई आधारित प्रोटोकॉल उत्कृष्ट समाशोधन गुणों के लाभों को जोड़ती है, इस्तेमाल की कम विषाक्तता अभिकर्मकों और एक उदारवादी समय की आवश्यकता४४। के रूप में मानक प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की क्षमता के रूप में बेहतरीन ऊतक संरचनाओं को हल करने के लिए एल्वेओलर केशिकाओं अभी भी इष्टतम समाशोधन की शर्तों के तहत सीमित है28, यह किसी भी तरह मज़बूती से अंतर करने के लिए मुश्किल हो सकता है के बीच intravascular और पहले से ही प्रतिरक्षा कोशिकाओं बहिर्वातित । एक अतिरिक्त मानक प्रतिदीप्ति का समावेश-यहां वर्णित प्रोटोकॉल में धुंधला आधारित रक्त वाहिका सबसे शायद पूरी तरह से इस सीमा को दूर करने में सक्षम नहीं होगा । इस प्रकार, फेफड़े microcirculation या उनके diapedesis के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के व्यवहार पर एक विशेष ध्यान के साथ अध्ययन के लिए बेहतर खाते में हाल ही में एक प्रकाशित और बहुत सुरुचिपूर्ण प्रोटोकॉल intravital फेफड़ों के लिए 2-photon के आधार पर इमेजिंग ले सकता है माइक्रोस्कोपी४७। इस प्रयोगात्मक सेटिंग में, एक वक्ष खिड़की ऊपर और हवादार चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था, जिसके माध्यम से स्थिर फेफड़ों एक गुंजयमय स्कैनिंग 2-photon माइक्रोस्कोपी मॉड्यूल द्वारा निगरानी की जा सकती है, में उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति श्वसन चक्र पर संरक्षित वेंटिलेशन और छिड़काव४७,४८। इस तकनीक को सफलतापूर्वक विभिंन अध्ययनों में लागू किया गया है और उदाहरण के लिए कल्पना करने में सक्षम था intraफुफ्फुसीय प्लेटलेट जीवजनन और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं४९,५०के फेफड़ों के प्रवेश द्वार । हालांकि, परिष्कृत वाद्य यंत्रों (जैसे, माउस वेंटिलेशन सिस्टम) की आवश्यकता और जीवित पशुओं में व्यापक इनवेसिव जोड़तोड़ की जरूरत (वक्ष खिड़की और intravital माइक्रोस्कोपी के आरोपण), मुख्य सीमा के अलावा इस लाइव फेफड़ों माइक्रोस्कोपी प्रणाली के सीमित z-अक्ष पैठ है । प्रदर्शन किया फेफड़ों की सतह इमेजिंग केवल बाहरी १०० μm subpleural फेफड़ों के ऊतकों का विश्लेषण करने की अनुमति देता है४७,४८। वैज्ञानिक संदर्भ पर निर्भर है, यह एक मूल्यवान को लागू करने के लिए एक बहुमूल्य विकल्प हो सकता है 2-ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में एक अतिरिक्त प्रक्रिया के रूप में explanted फेफड़ों के photon माइक्रोस्कोपी । 2 से पहले ही फेफड़ों का विश्लेषण-photon माइक्रोस्कोपी और बाद में प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एक रणनीति का प्रतिनिधित्व करने के वितरण और मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीयकरण के भीतर की एक मात्रात्मक सिंहावलोकन प्राप्त कर सकते है ( प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) और, एक ही समय में, सेलुलर या microscopy प्रक्रियाओं में अधिक विस्तृत अंतर्दृष्टि हासिल (2-photon माइक्रोस्कोपी). वास्तव में, 2 photon माइक्रोस्कोपी के म्यूरिन वातक explants का प्रतिनिधित्व करता है एक स्थापित इमेजिंग उपकरण का विश्लेषण करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार के संदर्भ में प्रयोगात्मक प्रेरित फेफड़ों की सूजन५१,५२. इसके बजाय छोटे फेफड़े केशिकाओं visualizing के, हमारे प्रायोगिक मॉडल में स्थानांतरित मानव टी कोशिकाओं के सफल बहिर्वेशन और फेफड़ों के ऊतकों घुसपैठ भी प्रतिदीप्ति का पता लगाने से साबित किया जा सकता है प्राप्तकर्ता के बाल के भीतर मानव कोशिकाओं लेबल प्रवाह cytometry के माध्यम से पशुओं के रूप में आदर्श चित्रा 2ईमें दर्शाया गया है । सामांय में, सेलुलर बाल डिब्बे का विश्लेषण एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का प्रतिनिधित्व करने के लिए भड़काऊ श्वसन रोगों के संदर्भ में फेफड़े के प्रतिरक्षा कोशिका तांता की विशेषता31। अंत में, दत्तक ग्रहण के लिए एक और प्रवाह cytometric रणनीति adoptively हस्तांतरित प्रतिरक्षा कोशिकाओं फेफड़ों के ऊतकों के भीतर Galkina एट अल द्वारा वर्णित किया गया था (२००५)५३ और संभवतः यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त किया जा सकता है. Galkina एट अल द्वारा अध्ययन में, एक प्रतिदीप्ति के एक एकल अंतःशिरा इंजेक्शन-संयुग्मित विरोधी सीडी 8 एंटीबॉडी शीघ्र ही फेफड़ों के एक विशेष और पूर्ण लेबलिंग के परिणामस्वरूप से पहले फेफड़े के भीतर सीडी 8+ टी कोशिकाओं का तबादला संवहनी डिब्बे, जबकि पहले से ही सीडी 8+ T कोशिकाओं के भीतर फेफड़े interstitium अनसना बना हुआ । विवो में बाद में विश्लेषण के लेबल फेफड़े की प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह cytometrically पूर्व के बाद vivo फेफड़े के ऊतकों५३के पाचन प्रदर्शन किया गया । बेशक, ऊतक पाचन की प्रक्रिया का मतलब है कि अंत और बहिर्वाहिकीय फेफड़े के डिब्बे के बीच अपरमाणुवीय जुदाई निष्प्रभाव है और, इस प्रकार, वहां एक सामांय जोखिम है की झूठी-सकारात्मक बीचवाला प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कारण प्रतिपिंड रिसाव की लेबलिंग दोनों डिब्बों के बीच । यह जोखिम केवल दाईं ओर अनलेबल्ड एंटीबॉडी५३ की मात्रा संतृप्त की उपस्थिति में ऊतक पाचन प्रदर्शन द्वारा या कम किया जा सकता है, संभवतः, प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो यह संभव बनाता है द्वारा प्रवाह cytometric विश्लेषण की जगह पूरी तरह से ऊतक संरचना के विनाश से बचने के लिए ।

संक्षेप में, यहां के संयोजन की शुरुआत में vivo के अभिलक्ष्यन में प्रतिदीप्ति लेबल प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं और बाद में प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मज़बूती से पहचान करने में सक्षम है, यों तो और एक में फेफड़ों संचित मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को स्थानीयकरण फेफड़े के सूजन के प्रायोगिक माउस मॉडल ।

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Disclosures

एमएफ हुसैन Neurath ने Pentax के लिए एक सलाहकार के रूप में सेवा की है, Giuliani, MSD, Abbvie, जनससेन, Takeda और Boehringer. शेष लेखक किसी भी संघर्ष का खुलासा नहीं करते ।

Acknowledgments

लेखक आभार DFG सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र SFB ११८१ और TRR २४१ द्वारा वित्त पोषण स्वीकार करते हैं । ऑप्टिकल इमेजिंग सेंटर Erlangen (ओआईसीए) और विशेष रूप से Ralf पाल्मिस्नो, फिलिप Tripal और टीना Fraaß (DFG CRC ११८१ की परियोजना Z2) प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति सूक्ष्म इमेजिंग के लिए विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) anprotec AC-AF-0018
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 mL B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 mL, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32

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चिकित्सा १४६ मुद्दा फेफड़ों homing परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एलर्जी फेफड़ों की सूजन तीन आयामी इमेजिंग
फेफड़ों के उन्नत इमेजिंग के एक प्रयोगात्मक में एक प्रायोगिक में मानव लिम्फोसाइटों पर आधारित एलर्जी सूजन के प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के आधार पर
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Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).

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