Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59043
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

Summary

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Abstract

Son derece aktif bağışıklık hücreleri doku birikimi ezici çeşitli kronik inflamatuar hastalıklar damgasını temsil eder ve çekici bir terapötik hedef etkilenen hastaların klinik yönetim olarak ortaya çıktı. Daha fazla patolojik olarak dengesiz doku infiltrasyonu pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri tedavi düzenlenmesi nişan stratejileri iyileştirmek amacıyla bu gelişmiş anlayışlar içine hastalık ve organ özel ulaşmak için özellikle önem olacak Periferik lenfositler izleme özellikleri. Burada açıklanan deneysel protokol fluorescently etiketli ve adoptively transfer edilen insan lenfosit bağlamında papain kaynaklı akciğer iltihabı, akciğer birikimi izlemek için izin verir. Bağışıklık hücre göç ve kemotaksisi analizi için sık kullanılan standart tüp bebek deneyleri aksine şimdi tanıtılan içinde vivo hesap akciğer özgü yönlerini doku organizasyon ve karmaşık inflamatuar etkisi çıkar canlı fare organizma meydana senaryo. Ayrıca, üç boyutlu kesit ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme sadece Nicel veri bağışıklık hücrelerinin infiltre sağlamaz ama aynı zamanda bağışıklık hücre yerelleştirme iltihaplanmış akciğer içinde desen gösteriyor. Genel olarak, biz yüksek değeri sağlanan adım adım iletişim kuralı takip ederek kolayca uygulanabilir kronik inflamatuar akciğer hastalıkları alanında immünolojik araştırma için yeni bir teknik tanıtmak edebiliyoruz.

Introduction

Klasik enflamatuar bozuklukları gibi Alerjik astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), akciğerin Akciğer doku1,2aktive lenfositler artan bir işe tarafından yönlendirilmesi için bilinen. Lenfosit yayımlanan sitokinler (örneğin, Il-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN γ ve TNF-α) daha fazla kemotaksisi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücrelerinin desteklemek, fibrotik hava yolu remodeling teşvik veya doğrudan zarar akciğer parankimi2. Şimdiye kadar akciğer dokusu içinde lenfositler patolojik birikimi sorumlu temel mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılır değil. Gut ve cilt giriş için açıklanan doku-seçici T hücre sürecinden için cümle içinde pulmoner dendritik hücreler (DC) üzerinde Periferik T hücre için tercihli akciğer infiltrasyonu, en azından kısmen CCR4 ifade indüksiyon yoluyla Başbakan belli ki edebiliyoruz yüzey lenfositler3. CCR4 yanı sıra, hava yolu infiltre T hücreleri da Kemokin reseptörlerinin CCR5 ve CXCR3 T hücrelerinin periferik kan1,4,5içinde karşılaştırıldığında özellikle artan bir ifade ile karakterizedir. Genel olarak, varolan veri akciğer posta fizyolojik veya inflamatuar koşullar altında T lenfositlerin farklı Kemokin reseptörleri ve onların anılan sıraya göre ligandlar, içerir ve bu nedenle en önemlisi üzerinde bağlıdır konsepti ile tutarlı bir yakından Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücreleri1arasında işbirliği kontrol. Özellikle, patojen veya alerjen pozlama başlangıç aşamasında TLR stimülasyon veya derhal serbest bırakılmasını LTB4, CCL1, CCL17 gibi farklı chemoattractants tarafından IgE aracılıklı cross-linking doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin yanıt, CCL22, CCL20, CXCL10 ve PGD21,6,7. Bir ilk örnek olarak PGD2 chemoattractant reseptör etkileşimini CRTh2 kemotaksisi Th2 hücrelerinin için özel öneme sahip olduğu bilinmektedir ve böylece astım klinik yönetim olarak umut verici terapötik hedef ortaya çıktı. Gerçekten de, orta astımı olan hastaların bir iyileşme belirtileri ve tedavi sonrası bir saniye (FEV1) zorunlu Ekspiratuar hacminin önemli bir artış ile plasebo grubu8 ' e göre bir seçici CRTh2 antagonisti gösterdi ,9. Bir daha ilerledi inflamatuar yanıt, zaten işe T hücreleri daha da pulmoner lenfosit birikimi yolu ile belgili tanımlık serbest bırakmak Il-4 ve IL-13 olarak güçlü bir çekim gücü pulmoner DCs için yükseltmek mümkün durumdadır. Daha sonra bu elde edilen Miyeloid doğuştan gelen hücreler yukarı-CCL17 ve CCL22 ifade STAT6 bağlı bir şekilde1,10,11düzenler.  Açıklanan senaryo karmaşıklığı hala T hücre akciğer homing tam bir anlayış engel rağmen enflamatuar veya Alerjik göğüs hastalıkları potansiyel olarak en iyi duruma getirilmiş bir tedavi kontrolü için moleküler hedeflerin bir bolluk sunmaktadır. Bu nedenle, daha da derinleştirmek ve bilgimizi T hücre kemotaksisi ve akciğer posta alanında tamamlayıcı edebiliyoruz yenilikçi deneysel teknikleri acil ihtiyaç yoktur.

Akciğer posta lenfositler insan vücudu içinde birden çok hücresel, humoral ve fiziksel parametrelerini1tarafından etkilenir nedeniyle gerçeğini, varolan deneysel yöntemlerin çoğu immünolojik bu işlem tüm karmaşıklığına modellemek mümkün değildir. Bunun yerine, seçmeli olarak homing akciğer analizi için birçok standart protokolleri belirli bir yönü lenfosit cazibe, adezyon, geçiş ve kalıcılık çağlayan dahil odaklanmak. Yanı sıra tamamen tasvir tayini periferik veya akciğer infiltre lenfositler üzerinde integrinler ve Kemokin reseptörlerinin mRNA veya protein ifade deseni ve kan, ilgili Kemokin düzeyleri tamamlayıcı ölçümü bronchoalveolar lavaj (BAL) ya da akciğer doku12,13,14,15, köklü in vitro hücre kültürü deneyleri lenfosit yapışma veya kemotaksisi işlevsel bir karakterizasyonu izin ver üzerine deneysel koşullar16,17,18tanımlı. Prensip olarak, statik içinde vitro yapışma deneyleri bir endotel monolayer veya rekombinant endotel adezyon molekülleri (örneğin, MAdCAM-1, VCAM-1), kaplamalı cam slaytlara kültürlü lenfositlerin Bağlama kapasitesi standart tüp bebek izlemek kemotaksis deneyleri genellikle bir transwell sistemi19Kemokin Gradyanda birlikte geçirmek için yeteneği lenfositlerin ölçmek için uygulanır. Tüp Bebek her iki ayar kontrollü ayarlama ve modülasyon deneysel koşullar etkinleştirir ancak öte yandan önemli değişkenler eleştirel içinde vivo kemotaksisi ve lenfositlerin adezyon etkisi bilinen eksikliği. Ağırlıklı olarak, statik hücre kültürü deneyleri kalıcı kan akışı19 tarafından neden kesme Kuvvetleri etkisi göz ardı ve potansiyel olarak çevredeki immünolojik çevre ve etkileşen lenfosit bağışıklık hücreleri katılımı ihmal, ikisi de canlı bir organizma. Bu sınırlamalarının üstesinden gelir için statik tüp bebek kemotaksisi veya bağlılık deneyleri içinde alınan sonuçları yorumlanması gerekir daha fazla doğrulama dinamik yapışma deneylerde akışı koşulları20,21 altında ve inç içinde vivo modelleri inflamatuar organ patoloji19. Gerçekten de, önemli sonuçlara T hücre akciğer iltihabi veya Alerjik koşullarda homing düzenlenmesinde hayvan çalışmaları çekilmiş olabilir genetik analiz tanımlanmış modeller farklı göğüs hastalıkları3, farelerde değiştirilme tarihi 22 , 23. köklü ve genel olarak kullanılan bir araç belirli hücresel etkisini tanımlamak için belirli bir gen ilgi temsil ettiği için wildtype fareler ve fareler bir eksikliği olan arasında lenfositler infiltre akciğer nicel karşılaştırılması yollar veya hastalık odaklı model T hücre dağıtım üzerinde reseptörleri. Ancak, aksine in vitro hücre kültürü deneyleri, tartışılan önce klasik hayvan modelleri alan bir çalışma tasarım analiz ve birincil insan T hücreleri doğrudan kan veya hastaların bir inflamatuar akciğer acı BAL elde izlemek için yeteneği yoksun hastalık. Böylece, işlevsel olarak bir tanıyla belirtilen akciğer hastalığı için tercihli akciğer tropism ve ne kadar klinik parametreler bu senaryo üzerinde etkisi olabilir insan lenfosit Künye mümkün olup olmadığını doğrulamak için zorlu kalıyor. Son zamanlarda, çok zarif bir içinde vivo yaklaşım bağlamında bu sınırlamaların çoğunu aşmak başardı ve bağırsak lenfosit24 homing üzerinde gelişmiş translasyonel çalışmalar için yeni yollar açtı, iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD), tanıtıldı . Solvent bazlı doku takas kesitsel ışık sayfalık Floresans mikroskobu güçlü görüntüleme aracı olarak ardından protokollerde yararlanarak, infiltrasyon ve dağıtım adoptively transfer edilen insan T hücrelerinin görselleştirmek mümkün colitic immünyetmezligi fareler24bağırsaklarda. Özellikle, uygulanan bu deneysel ayarı iki ana yenilikler: (1) birincil insan bağışıklık hücreleri analiz deneysel olarak tanımlanmış içinde vivo koşullarda; (2) bir büyükçe alanı hastalıklı organ (yaklaşık 1,5 cm x 1,5 cm) 3D-imar tarafından takip yüksek çözünürlük kalitesinde görüntüsü. Ayrıca, birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda başarılı solvent bazlı doku takas ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu kullanımı gelişmiş akciğer25,26görüntüleme için önemli araçlar olarak kurdu. Bu teknolojik ilerlemeden pulmoner İmmünoloji alanında faydalanmak için şimdi akciğer posta analiz için sistem evlat edindik.

Burada sunulan Protokolü nasıl arındırmak ve fluorescently birincil insan T transfer içine indüklenen akciğer iltihabı ile fareler için hücreleri ve ayrıca, ışık sayfalık sonraki süreci ayrıntılı olarak açıklayan etiket adım adım bir giriş niteliğindedir. Floresans mikroskobik görüntüleme, organ hazırlık ve görüntü işleme de dahil olmak üzere. Genel olarak, karmaşık, ama yine de mümkün, deneysel model insan lenfosit akciğer posta içinde vivo koşulları üzerine izleme tanıtarak enflamatuar veya Alerjik akciğer hastalıkları alanında gelecek translasyonel çalışmaları desteklemek umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deney hayvanları içeren Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Almanya) ilgili yerel yetkilileri tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. Fareler patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza. İnsan kanı topluluğu yerel etik kurul ve üniversite Erlangen-Nürnberg, Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi. Her hastanın yazılı onay verdi.

1. neden Alerjik akciğer iltihabı farelerde

Not: Daha önceki çalışmalar27' de açıklandığı gibi deneysel yordamını Alerjik hava yolu iltihabı farelerde inducing sağlar ve buna göre BAL doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücreleri birikimi tetikler. Açıklanan protokol C57BL/6J farelerde kuruldu ancak diğer standart doğuştan suşları için evlat edinmek mümkün olmalıdır.

Şekil 1A içinde vivo deneysel işlemin Özeti için bkz.

  1. Fareler ketamin/xylazine mayi enjeksiyonu ile anestezi.
    Not:     sadece C57BL/6J fareler büyük 6 hafta daha ve en az 16 g vücut ağırlığı ile kullanın.
    1. PBS (12 mg/mL ketamin; 1.6 mg/mL xylazine) ketamin/xylazine çözümde hazırlamak ve fareler tam vücut ağırlığını belirlemek.
    2. Birinci fare ketamin/xylazine çözüm vücut 8 uzun µL/g ağırlığı ile intraperitoneally enjekte ve pençe çimdik refleks yokluğu ile derin anestezi 1.3 adıma geçmeden önce onaylayın.
  2. 5 mg/mL papain PBS yılında taze hazırlayın. Yavaş yavaş 10 µL (50 µg) papain çözümü burun pipet. Dikkatle fare uyanış kadar izleyin.
  3. 1.1 ve 1.2 denemeye dahil tüm fareler için yineleyin. 1.1-1.3 üç gün üst üste adımları.

2. arındırmak ve Fluorescently insan periferik kan CD4 etiket+ T hücreleri

Not: İşlem hücreleri steril koşullarda.

  1. Tam insan kanı 18 mL periferik ven toplamak. Ficoll-Hypaque degrade Santrifüjü periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kısmını seçmek için gerçekleştirin.
    Not: Toplama ve çözümleme birincil insan malzemenin yerel etik yetkilileri tarafından onaylanması gerekiyor. Sadece bir kişinin yeterli bir tıbbi yeterlilik ile kan periferik ven toplamak için izin verilir.
    1. Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) kan toplamak-koagülasyon önlemek için monovettes (1.6 mg EDTA/mL kan) içeren.
      İsteğe bağlı: Buffy ceket kan, kan bağışı lökosit, tam Venöz kan yerine zenginleştirilmiş bir yan ürün kullanın.
    2. Kan bir konik 50 mL tüp içine aktarmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 1:2 oranında seyreltin. Dikkatle Ficoll-orta 10 mL ekleyin (yoğunluk 1.077 g/mL) seyreltilmiş kan altında bir alt katman. Örnek (800 x g için oda sıcaklığında fren olmadan 15 dk) santrifüj kapasitesi.
    3. Dikkatle santrifüj tüpü çıkarması ve PBMC içeren Interphase yeni konik 50 mL tüp içine aktarın. Üst ve alt tabaka atmak. PBMC içeren tüp PBS ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika) ile doldurun. Süpernatant kaldırın.
      Not: İsteğe bağlı olarak, gerekirse, kalan eritrositler lizis gerçekleştirin. Dikkatle amonyum klorür potasyum (ACP) lizis arabellek (155 mM amonyum klorür; 19 mM potasyum hidrojen karbonat ve 0.68 mM EDTA; pH 7,27) 3 mL resuspended hücre Pelet ve girdap örnek ekleyin. Tüpler 3 dakika çalkalanır. ACP lizis arabellek kaldırmak için PBS ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dk) 40 mL ekleyin. Süpernatant atmak.
  2. CD4 arındırmak+ T hücreleri CD4 lastikteki.
    Not: Genel olarak, birçok insan CD4 arınma için manyetik lastikteki dağıtıcılar tarafından+ hücreleri, hücre saflık karşılaştırılabilir düzeyde yol açmalıdır. Ürün seçimi bireysel tercihlerine göre. Protokolü (2.2.2–2.2.7) aşağıdaki adımlardan tanımlanmış CD4 microbead ürün ve Malzemeler tablodaha da belirtildiği gibi ilgili ayırma sütunlar için ayarlanır. Bazı değişiklikler Protokolü'nün bir alternatif CD4 microbead ürün seçili durumda gerekli olabilir.
    1. En az % 0.5 fetal sığır serum (FBS) ve 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-tampon) başına 10 içeren 80 µL PBS PBMC Pelet resuspend7 PBMC. Kullanım başlangıç Vaha'da yaklaşık 30 x 106 PBMC sonuna kadar 6 x 106 yaklaşık6 3 x 10 için saf insan CD4+ T hücreleri.
    2. CD4 lastikteki 10 başına 20 µL eklemek7 PBMC, karışımı yavaşça ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Tüp PBS/FBS/EDTA-tampon (4 ° C aşağı soğutmalı) ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika) ile doldurun. Süpernatant kaldırın.
    3. Bir ayrılık sütun bir manyetik alana yerleştirin. Sütun 3 mL PBS/FBS/EDTA-tamponu ile yıkayın. PBS/FBS/EDTA-arabelleği (4 ° C aşağı soğutmalı) 500 µL hücre Pelet resuspend ve hücre süspansiyon bir manyetik alan içinde yerleştirilmiş durulanır ayrılık sütun üzerine aktarın.
    4. Üç kez ile 3 mL (4 ° C aşağı soğutmalı) PBS/FBS/EDTA-arabellek ayırma sütun durulayın ve atık atın.
    5. Manyetik Ayırma sütun kaldırırsanız ve 15 mL tüp içine yerleştirin. CD4 elute+ hücre kesir PBS/FBS/EDTA-tampon pistonu kullanarak 5 ml.
    6. Tüp PBS ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika) ile doldurun. Süpernatant kaldırın. İki kez bu çamaşır tekrarlayın.
    7. Seçim (örneğin, Neubauer odası) standart bir yöntem tarafından vermiştir hücre sayısı belirler.
  3. Etiket CD4+ T hücreleri floresan Hücre proliferasyonu boya ile.
    1. CD4 resuspend+ T hücreleri içinde PBS (yukarı 107 hücre/mL; PBS az 500 µL kullanmayın).
    2. Bir kırmızı ışık telaşlı hücre çoğalması 6 µM çözeltisi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) (oda sıcaklığında önceden ısındı) PBS içinde boya. Bu çözüm 1:2 ile karıştırın daha önce hazırlanan hücre süspansiyon ve girdap iyice (3 µM son konsantrasyonu).
    3. (Işıktan korunan) 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya. Daha sonra RPMI orta % 10 içeren beş ciltlik eklemek FBS ve buz (ışıktan korunan) 5 min için kuluçkaya.
    4. Yıkama etiketli hücreleri üç kez RPMI orta içeren %10 FBS (4 ° C'de 10 dakika santrifüj vasıl 300 x g ). PBS etiketli hücreleri resuspend, buz üzerinde depolamak ve ışıktan kadar kullanmak korumak.
      Not: Uzun süreli depolama hücre (> 60 dk) hücre sağkalım üzerinde olumsuz etkisi olabilir.
      İsteğe bağlı: CD4 saflığı belirlemek+ hücre kesir ve etiketleme yordam etkinliğini Akış Sitometresi tarafından. 0.5 x 10 resuspend6 ' 1 x 106 CD4+ 100 µL arabelleği (%1 FBS, 2 mM EDTA PBS) içinde hücreleri ve seçim floresan bir boya ile birleştiğinde bir anti-insan CD4 antikor ekleyin. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 1 mL tampon ve santrifüj (300 x g 4 ° C'de 10 dakika için) ekleyin. Süpernatant atmak. Örnek akış sitometrik ölçüm ile devam (temsilcisi sonucu tasvir şekil 1B, C).

3. adoptively insan CD4 Transfer+ T hücreleri alıcı Mmice Papain maruz

Not: Bkz: şekil 1A içinde vivo Özeti için deneysel bir işlem yapılır. Hücre aktarımı bir gün sonra papain son burunici yönetimini gerçekleştirmek.

  1. Fluorescently etiketli insan CD4 süspansiyon ayarlamak+ T hücreleri (Adım 2.3.4) 1 x 107 hücre/mL PBS bir konsantrasyon için. Hücre süspansiyon 100 µL bir 1 mL/30 G içine doldurun-şırınga.
  2. Dikkatle ilk papain maruz C57BL/6J fare (Adım 1.1-1.3) kuyruk ven enjeksiyon için bir kısıtlama aygıt içine koyun. Hazır şırınga (Adım 3.1) kuyruk ven ponksiyon ve yavaş yavaş 1 x 106 insan CD4 etiketli içeren hücre süspansiyon 100 µL enjekte kullanmak+ hücreleri. Hemen iğneyi enjeksiyon sonra çekmeyin ama hücre süspansiyon deşarj önlemek için ek 5 saniye bekleyin.
  3. Kısıtlama aygıttan fare düğmesini bırakın ve sonraki hayvan ile devam edin. En az bir papain maruz hayvan ışık sayfalık floresan mikroskopi için negatif kontrol olarak hizmet için transfer fluorescently etiketli hücreleri ile geçmesi değil tutmak.

4. Akciğer doku ışık sayfalık floresan mikroskopi için hazırlayın

Not: Transferini fluorescently insan hücreleri (Adım 3.2) etiketli sonra aşağıdaki adımları 3 h gerçekleştirilir. Akciğer dokusunun hasat dahil açıklanan deneysel prosedürler fiksasyon ve solvent bazlı doku takas şu anda açıklanan protokoller24,28adapte edildi.

  1. Fare karbon dioksit (C02) inhalasyon tarafından kurban.
  2. Akciğer yerinde 5 mM EDTA içeren PBS ile sıvı.
    1. Göğüs kalp ortaya çıkarmak için göğüs kemiği boyunca kesme ile açın. Punctate 21 G kanül ile sağ ventrikül bir kateter bağlı.
    2. Sol ventrikül keserek açmak ve böylece çıkmak kan ve perfüzyon sıvı izin vermek. Yavaş yavaş akciğer ile buz gibi PBS kateter yolu ile 5 mM EDTA içeren 20 mL sıvı.
  3. Akciğer yerinde fiksasyonu gerçekleştirmek için kateter sağ ventrikül kaldırmayın. Yavaş yavaş akciğer ile PBS içinde çözülmüş buz gibi %4 paraformaldehyde (PFA) 2 mL sıvı. Kateter ve kanül kaldırın.
    Not: İngiltere'de yılın tabanlı Akciğer doku yerinde fiksasyonu iyi kurulmuş bir teknik fare akciğer dokusu daha sonraki mikroskopik analiz29,30için hazırlamak için temsil eder.
    Uyarı: İngiltere'de yılın toksik ve itina ile bir başlık altında ele alınması gerekiyor.
  4. Akciğer % 0.75 özel yerinde ile doldurun.
    1. % 0.75 özel PBS içinde hazırlamak ve 50 ° c ısı shaker kullanımı kadar sağlam tutun. Tükürük bezleri fare kaldırmak, sternohyoid kas kesmek ve trakea altında bir forseps kaydırarak ortaya çıkarmak.
    2. Maruz Trakea 30 G iğne ile noktalamak ve özel istenmeyen sızıntı kaynaklanan Trakea daha fazla zarar önlemek için bir künt 30 G kateter ile değiştirin. Eklenen kateter ve bir iğne bağı kullanarak nefes borusu arasındaki kavşak kapatın.
      İsteğe bağlı: Burada açıklanan yordamı insan hücrelerinde infiltre: BAL gibi son ayrıntı31 ' de açıklanan analiz etmek için BAL koleksiyonu ile birleştirin (bkz: Şekil 2E temsilcisi sonuçları için).
    3. Dikkatle solunum yolları ile % 0.75 özel (vücut sıcaklığında soğuduktan) kateter yolu ile tam akciğer unfolding kadar doldurun; özel tam katılaşma kadar bekleyin. Kateter kaldırmak ve dikkatle %4 ile dolu bir karanlık 2 mL tüp akciğerde hasat PFA.
  5. Ek fiksasyon kuluçkaya için İngiltere'de yılın sürekli rotasyon (31 devir/dakika) altında 4 ° C'de 2 h için PBS içinde çözüldü % 4 örnekte.
  6. Doku daha sonra örnek sürekli rotasyon (31 devir/dakika) altında kuluçka tarafından % 50 etanol (pH 9), % 70 etanol (pH 9) 4 ° C'de kurutmak ve % 100 etanol; her adım için en az 4 h. Sonunda, ikinci bir kuluçka taze % 100 etanol 4 h için gerçekleştirin.
  7. Solvent bazlı takas etil cinnamate (ECI) kullanarak doku gerçekleştirin. Bu nedenle, örnek ECI aktarın. Kuluçkaya gecede, oda sıcaklığında (altında sürekli rotasyon) doku yarı saydam (bakınız şekil 1D temsilcisi görüntüler için) görünene kadar.
    Not: (Işıktan korunan) oda sıcaklığında ECI içinde depolanan örnekleri ay birkaç hafta boyunca stabildir.

5. ışık-yapraklık Floresans mikroskobu Wwhole antikorundan akciğer LOB gerçekleştirmek

Not: Lütfen ayrıntılar için Malzemeler tablo bkz: ışık sayfalık Floresans mikroskobu ve üzerinde aşağıdaki adımları temel alan karşılık gelen yazılım. Diğer üreticiler tarafından benzer sistemleri ancak, aşağıdaki Protokolü geliştirici özel değişiklikleri ile de kullanılabilir. Başlamadan önce mikroskop özel işletim Kılavuzu ile tanımak ve sitesindeki sorumlu kişi tarafından teknik yönergeleri izleyin.

  1. Işık sayfalık mikroskobu hazırlayın.
    1. Işık sayfalık mikroskobunun açmak ve görüntüleme yazılımı bilgisayarda karşılık gelen açın. Örnek odası süzülmüş ECI (100 µm filtre) ile doldurun ve konumunu lazer ışınları arasında yere koyun.
    2. Akciğer örnek sahibi için sopa için organik çözücü-kararlı tutkal küçük bir damla kullanın. Işık-yaprak gerekli penetrasyon derinliği olabildiğince küçük tutmak için Akciğer lobu dik ayarlayın. Daha sonra örnek sahibi onun odasına koyun.
    3. Kırılma indisi amacın ECI reaktif takas olarak kullanırken 3.5 için ayarlayın.
  2. İnsan hücreleri tüm organ bağlamda algılamak için ışık sayfalık mikroskop, ayarları.
    1. Gerekli lazerler seçin (ölçüm için Filtre > gerekli lazerler onay kutularını etkinleştirmek) ve uygun yoğunluklarda kontrol yazılımı seçin (lazer iletim Denetimi > yoğunluk lazer ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın > Geçerli). Bir uyarma dalga boyu 488 kullanın autofluorescent Akciğer doku ve 640 algılamak için nm (525/50 filtre) insan hücreleri fluorophore kırmızı spektrumunda yayan ile etiketli heyecanlandırmak için nm (680/30 filtre).
    2. Örnek 488 heyecanlı odaklanmak nm ve odağı uyarma dalga boyu 640, 'renk düzeltme' aracı ile uyum nm (renk düzeltme ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın > uygulamak).
    3. Bir uygun büyütme faktörü seçin; düşük büyütme genel bakış kullanın (örneğin, 6.3 x) detaylı yerelleştirme için genel dağıtım akciğer dokusu ve büyütülmüş resimler (örneğin, 32 x) içindeki etiketli hücreleri belirlemek için.
    4. Aynı şekilde bütün organ veya faiz belirli bir kısmını elucidating bir levha genişliği seçin (optik > sayfa genişliğini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın; genellikle % 20-40 arasında). Daha yüksek NA daha net görüntü oluşturma sayfası sayısal diyafram (NA) tanımlamak (optik > sayfası NA ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın; NA % 0,025-ebilmek sık sık var olmak kullanılmış fizyolojik boyutuna genişletilmiş bir fare Akciğer lobu için).
    5. 'Altında Gelişmiş ölçüm ayarlarını' kullanılmak üzere ışık-yaprak sayısını seçin. Sol ve sağ ışık-levhalar homojen bir görüntü oluşturmak için çift yönlü aydınlatma durumunda birleştirme (Gelişmiş > birleştirme lightsheets > Seç karışım modu > her iki ışık sayfaları arasında örtüşme tanımlamak için kaydırıcıları kullanın).
      Not: Bu örnek üç ışık-sayfalarıyla birlikte her iki yönlü aydınlatma yararlanmak için tavsiye edilir.
      İsteğe bağlı: Daha fazla görüntü kalitesini artırmak için dinamik odaklama işlemini kullanıyorsunuz. Bu resim alma sırasında x-yönünde odağı taşımak sağlar.
    6. Z-yığının ölçülebilir ve 5 mikron için adım boyutunu belirlemek için başlangıç ve bitiş konumlarını tanımlamak (xyz-tablo Z > Tarama aralığı).
      Not: Başlangıç ve bitiş konumlarını z-yığın boyutu ve Akciğer lobu örnek odası içinde konumlandırma bağlıdır. Ancak, yaklaşık 300-800 z-yığınlar genellikle tek Akciğer lobu (5 µm adım boyu) elde edilir.
    7. 'Otomatik kaydetme ayarları' kullanarak dosyaları kaydetmek ve esir alma imge için ölçüm başlamak. Bitirme veri toplama sonra ECI kontamine örnek sahibi ve akan suyun altında odası temiz.
      Not: Daha sonra karşılaştırılmak üzere gereken birkaç akciğer lobları görüntü için aynı ayarları kullanın.

6. işleme ve insan hücre akciğer biriken miktar sonrası görüntü

Not: Malzemeler tablo , aşağıdaki adımları temel 3D analiz sonrası görüntüleme yazılımı hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız. Ancak, program sonrası Imaging alternatif de kullanılabilir.

  1. Bir z yığının ilk resim yüklemek (surpass düğmesini etkinleştirin, Dosya > Aç > select görüntü) açılış tüm diğer görüntülerin seçilen z yýðýn ve onların otomatik 3D yeniden başlatmak için.
  2. X doğru görüntülenmesini sağlamak için y ve z boyutları, voxel boyutları kontrol edin ve gerekirse onları ayarlayın (Düzenle > görüntü özellikleri > Voksel boyutu el ile girmek). Z Voksel boyutu için seçilen adım boyu iki resim arasında (burada 5 µm) girin.
  3. Her kanal farklı renkte görüntüleme (Düzenle > görüntü ayarı göstermek). Her kanal bir seçim bir renk tanımlamak için birbiri ardına'i ( Şekil 2A, B, C, D autofluorescence sinyal gri renkle görüntülenir ve insan CD4 etiketli+ kırmızı hücreleri).
  4. Yoğunluk, siyah seviyesi ve her kanal için kontrastı ayarlamak (Düzenle > görüntü ayarı göstermek) kanal barlarda üçgenler kullanarak veya tam sayı kanal ayarları girme. Yoğunluk ayarı için dik üçgen kullanın. Siyah seviyesi Ayarlamas∂, sol üçgen kullanın ve kontrast ayarı için orta üçgen kullanın.
    Not: Denetim fare kullanmadan belirli insan hücre kaynaklı sinyalleri ve belirsiz arka plan arasında ayırt etmek için hücre aktarımı (Adım 3.3) kullanım akciğer türetilmiş.
  5. Ölçmek için etiketli hücre Akciğer doku içinde 'yeni noktalar Ekle' araç çubuğunu kullanın ve select 'otomatik oluşturma atlamak, el ile düzenleme' için el ile Hücre sayımı.
    Not:     alternatif olarak, Sayma Aracı 'noktalar' altında otomatik hücresini kullanın. Ancak, el ile sayım daha doğrusu belirli ve belirsiz sinyaller arasında ayırt etmek için izin verir.
    1. Farklı örnekler üzerindeki insan hücresi birikimi karşılaştırmak için 3D kesici alet kullanarak belirli bir ses ile bir akciğer küp tanımlamak (Düzenle > 3D kırpma) (burada 813 mikron x 813 mikron x 1,000 mikron).
    2. Birikmiş hücreleri seçin 640 nm kanal ve 10 µm bir 'RADIUS ölçek' tanımlamak için. 'Düzenle' yi, "seçin" işaretçi menüsü kontrol ve shift tuşunu basılı tutarak farenin sol tuşu ile üzerinden bir nokta içeren her hücreyi işaretleyin. Sayılan hücreleri istatistiklere görüntülenen genel numarasını bulun.
      Not: Sayılan akciğer hacmi bilim adamı bağımlı seçim için çeşitli küpleri sonuçları güvenilirliğini sağlamak ve telafi etmek için Akciğer lobu (burada beş) başına saymak için önerilir (miktar strateji ve temsilcisi sonuçları tasvir içinde Rakam 2D).
  6. 'Anlık' aracını kullanarak bir yansıma yakalama ve/veya 'animasyon' aracını kullanarak bir video çekmek. Save dosyaları .ims dosyaları olarak ayarlanabilir (Dosya > Dışa Aktar).
    Not: Temsilcisi amacıyla gösterebilir veya çerçeve denetimi veya araç çubuğunda çerçeve işaretleri kaldırarak gizleyebilirsiniz. Ayrıca, ekran maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) olarak görüntüler (araç çubuğu > Ses > modu > MIP kontrol) veya 'yüzey modu' kullanın (araç çubuğu > yeni yüzeyler ekleme). 'Yüzey modu' doku mimarisi ve/veya hücre ( Şekil 2Ctemsilcisi görüntüler gösterildiği) organları vurgulamak her kanal için ayrı ayrı etkinleştirilmesi gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sunulan Protokolü izleme ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu ile akciğer adoptively transfer edilen insan T lenfositler birikimi miktarının sağlar bir deneysel fare modeli açıklar. Resim 1 A deneysel zamanlama içinde vivo adımlardan şematik bir genel bakış sağlar. Güvenilir sonuçlar sağlamak için o izole ve fluorescently iyi kalite sağlamak için önemli önemi insan CD4 etiketli+ T hücreleri, daha sonra fareler aktarılır. Şekil 1B, C, microbead tabanlı cep zenginleştirme ve sonraki floresan-genellikle etiketleme için yukarıda açıklanan yordamı dinlerinden tasvir olarak bir akış cytometrically sonuçlarında CD4 tespit+ T hücre saflık > % 95 ve tüm CD4, başarılı Floresans etiketleme+ T hücreleri. Işık sayfalık Floresans mikroskobu kaliteli ve penetrasyon derinliği eleştirel doku takas uygun bir sınıf üzerinde bağlıdır. Şekil 1' deDgibi burada uygulanan protokol ECI tabanlı doku takas için organ şeffaflık, eşleşen bir başarılı Kırılma indisi gösteren yüksek düzeyde garanti başardı. Son olarak, tam olarak işlenen ışık sayfalık Floresans mikroskobu görüntüleri şeklinde açıklanan deneysel protokol bir temsilcisi genel sonucu Şekil 2B, C, D ve Ek Videogösterilmiştir. (Gri renkle gösterilmiştir) autofluorescent sinyal akciğer Anatomik yapısını görüntüleme için yararlı bir araçtır. Kırmızı sinyal temsil akciğer biriken insan CD4+ T hücreleri. Miktar ışık sayfalık Floresans mikroskobu görüntüleme sağlar genel belirleme akciğer taşına insan CD4+ T hücreleri iltihaplanmış Akciğer doku tanımlanmış alanı. İnsan hücre infiltrasyonu miktar için bir strateji Şekil 2'Egösterilmektedir. (İsteğe bağlı) akış sitometrik tespiti fluorescently alıcı fare, BAL içindeki hücreleri Şekil 2' deF, tasvir olarak etiketlendirilmiş bir ek teknik başarılı doku göç adoptively onaylamak için kullanılabilir CD4 transfer+ T hücreleri. Ayrıca, transfer edilen insan T hücrelerinin tercih deneysel ayarı seçici birikimi iltihaplanmış akciğer dokusu burada açıklanan için daha fazla insan o CD4 Aslında tarafından desteklenen+ T hücreleri-değil var alındı bağırsak mukoza Şekil 2B (doğru kapı aynası) tasvir olarak alıcı hayvanların.

Figure 1
Resim 1 : İçinde vivo deneysel iş akışı şematik bakış. (A)Alerjik akciğer iltihabı papain (50 µg/fare) inhalasyon üç ardışık günlerde (d0, d1 ve d2) tarafından C57BL/6J farelerde indüklenen. Ertesi gün (d3), taze izole ve fluorescently insan CD4 etiketli+ T hücre adoptively kuyruk ven enjeksiyon yolu ile fareler transfer. Başka bir üç saat sonra fareler, ardından yerinde perfüzyon ve akciğerleri fiksasyonu kurban edildi. Son olarak, akciğer explanted ve daha fazla ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından ex vivo analiz. İsteğe bağlı olarak, başarılı bir şekilde extravasated ve geçirilen insan hücreleri ex vivo analizleri gerçekleştirmek için akciğer explantation genişletilmiş önce BAL toplanabilir. (B) temsilcisi çubuk grafik izole CD4 saflığı teyit+ Akış Sitometresi tarafından belirlenen T hücre kesir. Hücreler tarafından bir anti-insan CD4 antikor veya izotip kontrol lekeli siyah ve gri, sırasıyla görüntülenir. (C) temsilcisi histogram Floresans etiketleme insan CD4 ve etkinliğini onaylayan+ hücreleri önce evlatlık transfer. (D) bir fare akciğer periosteum LOB önce ve sonra takas ECI ile temsilcisi görüntüler. FI, floresan yoğunluğu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : İnsan CD4 pulmoner birikimi temsilcisi analizi+ hücreleri içinde vivo akciğer iltihabı bağlamında. İnsan CD4+ hücrelerin periferik kan degrade aralıklarla manyetik microbead tabanlı arıtma adım takip yoğunluğu kullanarak yalıtılmış. İnsan CD4+ hücreleri bir kırmızı ışık telaşlı Hücre proliferasyonu boya kullanarak etiketli ve intravenöz papain maruz C57BL/6J fareler enjekte. Üç saat sonra fareler toplamak ve akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu ile daha ileri düzeyde çözümlemek için kurban edildi. 3D yeniden üç saat sonra etiketli insan CD4 intravenöz enjeksiyon fare, papain maruz Akciğer doku (gri)(a)temsilcisi bakış+ hücreleri (kırmızı) tarafından ışık sayfalık Floresans kaydedildiği şekilde mikroskobu. (B) Akciğer doku alıcı fare yüksek büyütme kesimi (sol panelde) veya genel gösterilen hücre transferden sonra üç saat. Alındı insan CD4+ hücreleri kırmızı sinyaller olarak görüntülenmiştir ve ya autofluorescence sinyal Akciğer doku veya tek kanallı görüntü olarak kaplamasıyla tasvir edildi. Algılanan sinyal özgüllük onaylamak için denetim Akciğer doku intravenöz cep transfer olmadan negatif kontrol (orta Masası) görev yaptı. Akciğer dokusu, etiketli hiçbir insan CD4 aksine+ hücreleri (kırmızı) aynı alıcı fare (doğru kapı aynası) ileum algılanan. (C) sonrası görüntü işleme sağlar tek dilimleri akciğer dokusunun yanı sıra 3D rekonstrüksiyonlar bütün organ parçasının nesil analizi de yüzey modunda veya maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) olarak temsil edilebilir. Temsilcisi görüntüleri tasvir edilmektedir. Strateji exemplarily aynı akciğerde olarak zaten gösterilmiştir (D) miktar Şekil 2içindeAtasvir. Analiz akciğer segmentin tanımlanmış küplerin seçildi ve insan CD4 sayısı+ hücreleri (kırmızı) her bir küp için sayısal. Daha sonra gerçekleştirilen miktar (olaylar/813 µm x 813 µm x 1,000 µm küp) sonuçlarını gösterilir ortalama ± SEM (E) ek bir seçenek olarak, akış sitometrik hafiye-in alıcı hayvanların BAL fluorescently etiketli insan T hücrelerinde olabilir birikmiş insan CD4 başarılı doku geçişini onaylamak amacıyla gerçekleştirilen+ T hücreleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Video
Takıma giren Video: Temsilcisi video sırasını gösteren insan CD4 birikmiş+ hücreleri fare akciğer dokusu içinde. Fare akciğer görüntüleme 3D imar birikmiş insan CD4+ Akciğer doku (gri) üç saat sonra kuyruk ven içine intravenöz enjeksiyon bağlamı içinde (kırmızı) hücreleri. Görüntüleri MIP başında ve sonunda yüzey modunda gösterilir. Görüntü ışık sayfalık Floresans mikroskobu edinilen ve sonrası görüntüleme yazılımı 3D analiz için tarafından işlenen. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan deneysel ayarı içinde vitro yapışma ve kemotaksisi birincil insan bağışıklık hücreleri içinde vivo inflamatuar koşulları ve böylece relevantly tamamlar altında akciğer izleme kapasitesini klasik izlemek için fırsat gerçekleştirilen sağlar deneyleri. Akciğer hesap belirli anatomik organ özellikleri almak için bağışıklık hücre (dahil kemotaksisi ve hücre dağıtım hedef organ içinde) yanı sıra klinik önemi ve lisans alınan veri transferi homing önemli yönlerini aldık Üç teknik anahtar özelliklerinden faydalanabilirsiniz: (1) birincil insan hücreleri içinde yaşayan bir fare organizma; analizi (2 papain aracılı indüksiyon akciğer iltihabı; ve (3) ışık sayfalık Floresans mikroskobu temizlenen akciğer dokusunun.

Her ne kadar fonksiyonel çalışmaları adoptively insan transfer bağışıklık hücreleri içinde yaşayan bir fare organizma bazı yönleriyle Reseptör-ligand-etkileşimleri fareler ve insanlar, genel kavram arasında potansiyel olarak ilgili uyumsuzluklar nedeniyle sınırlı insanlaşmış fare modelleri son yıllarda24,32,33,34sırasında,35 translasyonel tıp alanında önemli bir deneysel araç olarak başarıyla kuruldu . Klasik hayvan modellerle karşılaştırıldığında, çalışmalar insanlaşmış farelerde doğrudan hasta kaynaklı bağışıklık hücreleri içinde vivo bir senaryoda analiz etmek ve böylece fonksiyonel değişiklikler belirli hastalığı32tarafındanbaskılı tanımlamak için avantaj sunuyor, 36,37. Olası uyuşmazlıkları uygunluğu ile ilgili olarak arasında reseptörleri insan bağışıklık hücreleri ve onların anılan sıraya göre fare ligandlar yüzeyinde tanımlanan veya tersi, eski çalışmalar zaten o insan belirtilen CD4+ T hücreleri verimli bir şekilde etkileşim edebiliyoruz fare adezyon molekülleri MAdCAM-1 ve VCAM-1 ile hangi lenfosit integrin aracılı izleme32için çok önemli ligandlar temsil eder. Buna göre intravascularly transfer edilen insan bağışıklık hücreleri geçiş fare bağırsak dokusu içine başarıyla içinde vivo tedavi ile klinik olarak kullanılan α4β7 integrin antikor vedolizumab32tarafından engellenmiş olabilir. Ancak, hatta durumda bir belirli Reseptör-ligand-etkileşim konu ile ilgili tam bir insan/antikorundan uyumsuzluk gösterebilir Bu muhtemelen genetik mühendisliği ve, örneğin, tarafından transgenik overexpression bu sınırlamayı aşmak mümkün ilgili insan ligand, büyüme faktörü, sitokin veya reseptör içinde fare organizma33,35.

Üzerinde önemli bir etkisi kronik inflamasyon kemokinler yerel salgılanmasını, adezyon moleküllerinin endotel ifade ve lenfositler sonraki birikimi çok sayıda yayınlar38,39 tanımlanmıştır ,40, akciğer iltihabı uygun bir deneysel modeli seçimi temsil önemli bir adım yukarıda açıklanan protokol ve -ebilmek var olmak kurmak her bireysel çalışma klinik bağlamında bağımlı adapte ederken. Papain kaynaklı Alerjik akciğer iltihabı burada seçili ayarı yerel olarak yönetilen sistein proteaz papain kapasitesi hava yolu epitel ve tetikleyici tahriş üzerinde dayanır iyi tarif bir deneysel model temsil eder. alarmins27,41,42sonraki sürümü. İlginçtir, papain için yanlışlıkla Fuar astım gelişme insanlarda iyi43neden olduğu bilinmektedir. Papain, maruz kalan fareler Haritayı doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücreleri birikimi ve tip 2 sitokinler akciğer27' deki yüksek seviyede bir inhale doz bağımlı. Doz yükseltme bir genişleme sonucu hava sahaları (Klasik histolojik olgusu KOAH) ve damar duvarları sonraki kanama ile imha ortaya çıktı ise, zamanlamaları dozaj orta belirgin pulmoner eozinofili ile birlikte gitti ve böylece insan astım27önemli bir histolojik özelliği taklit. Bizim amacımız bu deneysel model homing pulmoner bağışıklık hücre analizi için inflamatuar bir bağlam oluşturmak için kullanmak için olduğu gibi dikkatli bir şekilde papain indüklenen zarar kan damarlarının aksi takdirde bir unphysiological neden olabilir önlemek çalıştı insan bağışıklık hücreleri nedeniyle rahatsız endotel bütünlük ekstravazasyonu. Buna göre yukarıda açıklanan protokolünde papain fare günlük başına 50 µg ara bir doz seçili. Her ne kadar gelişimi papain kaynaklı hava yolu iltihabı da B yokluğunda oluşur ve T lenfositleri, adaptif bağışıklık hücrelerinin infiltre akciğer hastalığı27,42sahasında önemli ölçüde etkisi olduğu bilinmektedir. Örneğin, düzenleyici T hücreleri papain kaynaklı hava yolu Granülom27güçlü düzenleyiciler belirlenmiştir. Yukarıda açıklanan Protokolü Ayrıca, fonksiyonel kapasite analiz etmek için adoptively transfer etkinleştirmek perspektif, papain maruz farelerin inflamatuar patogenezinde pulmoner lenfositleri aktif katılımı implicates ve Akciğer patoloji (örneğin, üzerinden akış sitometrik BAL Eozinofilik sayıları edinimi) modüle için başarıyla akciğer biriken insan bağışıklık hücreleri. Ayrıca, seçili hastalık ilgili insan kemokinler intravasküler hücre aktarımı hemen önce bir ek olarak gerçekleştirilen burunici yönetimine farklı insan akciğer izleme işlemi bu humoral arabulucu etkisini analiz etmek için izin vermek bağışıklık hücre popülasyonlarının içinde vivo ortamda. Aynı şekilde, inhibitörleri etkisi akciğer izleme süreci ve daha sonra inflamatuar akciğer patoloji Tarih okudu olabilir.

Burada tanıtılan deneysel işlemin belirli bir avantajı hassas izleme ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu yüksek kaliteli görüntüleme kalitesi ile insan bağışıklık hücrelerinin infiltre akciğer yerelleştirme olduğunu. Son yıllarda yapılan çalışmalarda zaten ışık sayfalık Floresans mikroskobu tekniği translasyonel IBD araştırmada homing bağırsak bağışıklık hücre analizi için değerli bir deneysel araç temsil eder ve ana sınırlamaları aşmak mümkün gösterdi geleneksel ayirt mikroskobu ve Akış Sitometresi24,32. İken geleneksel mikroskobu dayalı analizleri çok küçük ve genellikle sınırlı ve potansiyel olarak değil temsili organ ve Akış Sitometresi alanının almaz dikkate doku organizasyon yönünü, ışık sayfalık Floresans mikroskobu kimyasal olarak temizlenen dokusunun çözünürlük, büyük kaybı olmadan bir artan penetrasyon derinliği sağlar ve böylece oldukça büyük organ bölümleri 3D yeniden sağlar (en fazla 1,5 cm x 1,5 cm)24,28,44. Kesin, kalite ve Edinsel 3D rekonstrüksiyonlar geçerliliğini eleştirel doku Temizleme performansına bağlıdır. Burada açıklanan ayar, biz biraz kabul edilen sürüm ECI tabanlı doku44temizlenmesi için kısa bir süre önce Protokolü dahil. Solvent bazlı doku26,temizlenmesi için iyi kurulmuş diğer stratejileri göre45,46, ECI tabanlı iletişim kuralı birleştirir avantajları mükemmel Temizleme özellikleri, kullanılan düşük toksisitesi reaktifler ve orta zaman gereksinim44. Alveoler kılcal damarlar gibi hala sınırlı bile altında en iyi doku yapıları gidermek için standart ışık sayfalık Floresans mikroskobu kapasitesi en uygun koşullar28, takas bir şekilde güvenilir bir şekilde ayırt etmek zor olabilir intravasküler ve zaten extravasated bağışıklık hücreleri arasında. Bir ek standart floresan tabanlı burada açıklanan protokol boyama damar eklenmesi tamamen bu sınırlamayı aşmak mümkün olmaz en büyük olasılıkla. Böylece, çalışmalar pulmoner mikro veya onların diapedesis bağışıklık hücreleri davranışını özel bir odaklanma ile tercihen 2-Foton üzerinde dayalı intravital akciğer görüntüleme için kısa bir süre önce ve çok zarif Protokolü dikkate alabilir mikroskopi47. Bu deneysel ortamda göğüs bir pencere hangi aracılığıyla stabilize akciğer izlenen bir rezonans-tarayarak imzalat ve havalandırılmış fareler içine implante boyunca Imaging yüksek çözünürlüklü izin 2-Foton mikroskobu modülü Solunum döngüsü üzerine korunmuş havalandırma ve perfüzyon47,48. Bu teknik çeşitli çalışmalarda başarıyla uygulandı ve örneğin intrapulmonary trombosit Biyogenez ve tümör hücreleri49,50dolaşan akciğer girişinde görselleştirmek başardı. Ancak, yanı sıra sofistike enstrümantal ekipman (örneğin, fare havalandırma sistemi) şartı ve geniş invaziv manipülasyonlar yaşayan hayvanlarda (torasik pencere ve intravital mikroskobu implantasyonu), gerek ana sınırlama Bu canlı akciğer mikroskobu sınırlı z ekseni penetrasyon sistemidir. Gerçekleştirilen akciğer yüzey görüntüleme sadece dış 100 µm subpleural Akciğer doku47,48analiz sağlar. Bilimsel içerik bağımlı, 2-Foton mikroskopi explanted akciğer yukarıda açıklanan Protokolü ek bir yordam uygulamak için değerli bir seçenek olabilir. Aynı akciğer ilk 2-Foton mikroskobu ve daha sonra ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından analiz nicel bir genel dağıtım ve yerelleştirme içindeki fare akciğer (insan bağışıklık hücreleri elde etmek için bir strateji temsil edebilir ışık sayfalık Floresans mikroskobu) ve aynı zamanda, hücresel veya mikrovasküler işlemler (2-Foton mikroskobu) daha ayrıntılı bilgiler kazanın. Gerçekten de, fare trakeal explants 2-Foton mikroskobu bağışıklık hücre davranış deneysel İndüklenmiş akciğer iltihabı51,52bağlamında analiz etmek için kurulan bir görüntüleme aracı temsil eder. Küçük pulmoner kapiller görüntülenmesi yerine, başarılı ekstravazasyonu ve akciğer doku infiltrasyonu deneysel modelimiz transfer edilen insan T hücrelerinde de alıcı BAL içinde fluorescently etiketli insan hücreleri tespit ederek kanıtlanmış olabilir Şekil 2'Ekadar exemplarily tasvir Akış Sitometresi ile hayvanlar. Genel olarak, hücresel BAL yuvası analizlerini pulmoner bağışıklık hücre akını inflamatuar solunum yolu hastalıkları31bağlamında karakterize etmek için köklü bir yöntemi temsil eder. Son olarak, akciğer dokusu içinde adoptively transfer edilen bağışıklık hücreleri ekstravazasyonu miktarının başka bir akış sitometrik strateji Galkina vd (2005)53 tarafından tanımlanmıştır ve potansiyel olarak burada açıklanan kuralıyla birlikte. Çalışma tarafından Galkina ve ark., önce kısa bir süre sonra bir özel ve tam önce etiketlerine göre içinde akciğer rezeksiyon sonuçlanan bir floresan Birleşik anti-CD8 antikor tek bir intravenöz enjeksiyon transfer CD8+ T hücreleri içinde akciğer zaten extravasated CD8 ise damar yuvası+ T hücreleri günahı kaldı akciğer interstitium içinde. İçinde vivo etiketli pulmoner bağışıklık hücreleri sonraki analizleri gerçekleştirilen akışı cytometrically sonra sindirim ex vivo Akciğer doku53vardı. Tabii, doku sindirim sürecinin Intra - ve extravascular akciğer yuvası arasında anatomik bir ayrım kaldırıldı ve böylece, interstisyel bağışıklık hücrelerinin antikor sızıntı nedeniyle yanlış etiketleme genel riski yoktur, demektir Her iki bölmeleri arasında. Bu riski yalnızca etiketlenmemiş antikor53 miktarda doyurarak huzurunda doku sindirim yaparak veya potansiyel olarak, akış sitometrik çözümlemesi değiştirerek mümkün kılan ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından en aza indirilebilir tamamen doku yapısı imha önlemek için.

Özetle, burada da piyasaya fluorescently etiketli birincil bağışıklık hücrelerinin içinde vivo yolu bulabilen kombinasyonu ve sonraki ışık sayfalık Floresans mikroskobu güvenilir bir şekilde belirlemek ölçmek ve akciğer biriken insan bağışıklık hücreleri yerelleştirmek mümkün bir akciğer iltihabı deneysel fare modeli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.F. Neurath Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda ve Boehringer için bir danışman olarak hizmet vermiştir. Kalan yazarların herhangi bir çatışma açıklanmaz.

Acknowledgments

Yazarlar DFG işbirlikçi araştırma merkezleri SFB 1181 ve TRR 241 tarafından finansman minnetle kabul etmiş oluyorsunuz. Optik görüntüleme Merkezi Erlangen (anlatım) ve belirli Ralf Palmisano, Philipp Tripal ve Tina Fraaß (proje Z2, DFG CRC 1181) ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme için uzman teknik destek için kabul vardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) anprotec AC-AF-0018
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 mL B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 mL, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

Tags

Tıp sayı: 146 akciğer posta periferik kan mononükleer hücreler ışık sayfalık Floresans mikroskobu Alerjik akciğer iltihabı üç boyutlu görüntüleme
Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S.,… More

Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter