Summary
Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.
Abstract
Postsynaptisch mensenhandel receptoren van en naar het celoppervlak is een belangrijk mechanisme waarmee neuronen hun reactievermogen op verschillende stimuli moduleren. De α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA)-receptoren, die verantwoordelijk voor snelle excitatory synaptische transmissie in neuronen zijn, worden verhandeld naar en van het postsynaptisch oppervlak dynamisch te wijzigen neuronale prikkelbaarheid. AMPA receptor mensenhandel is essentieel voor synaptische plasticiteit en bij neurologische ziekten kan worden onderbroken. Echter overwegend benaderingen voor het kwantificeren van de receptor mensenhandel negeren hele receptor zwembaden, zijn overdreven tijd - en arbeidsintensief zijn, of potentieel verstoren normale mensenhandel mechanismen en daarom bemoeilijken de interpretatie van de resulterende gegevens. We presenteren een hoge-inhoud assay voor de kwantificering van zowel de interne als de oppervlakte AMPA receptor populaties in gekweekte primaire hippocampal neuronen met dubbele fluorescerende immunolabeling en een nabij-infrarood fluorescerende 96-Wells microplate-scanner. Deze aanpak vergemakkelijkt de snelle screening van bulk geïnternaliseerd en oppervlaktewater receptor dichtheden terwijl het minimaliseren van monstermateriaal. Onze methode heeft echter beperkingen in het verkrijgen van eencellige resolutie of het uitvoeren van de levende cel imaging. Tot slot, dit protocol kan worden vatbaar voor andere receptoren en verschillende soorten cellen, voorzien van de juiste aanpassingen en optimalisatie.
Introduction
De omvang en de dynamiek van de temporele van neuronale prikkelbaarheid is grotendeels afhankelijk van de beschikbaarheid en de samenstelling van de bevolking van de oppervlakte receptor die transduce van elektrochemische signalen. Overwegende dat de synthese van nieuwe receptoren (of receptor subeenheden) is over het algemeen een energiek kostbare en relatief langdurige proces, een groot aantal mobiele machines gewijd aan de endo- en exocytose van bestaande receptoren vormen een oplossing voor hun snelle plaatsing en verwijdering van en naar de membraan-1. Daarom, naast de transcriptionele en translationele regulering van receptoren, posttranslationele receptor handel is een belangrijke modulator van neuronale prikkelbaarheid.
Synaptische plasticiteit, of de veranderende kracht van verbindingen tussen neuronen met ervaring, wordt beschouwd als de basis vormen van leren en geheugen2,3. De versterking en verzwakking van de synapsen na verloop van tijd genoemd op lange termijn potentiëring (LTP) en op lange termijn depressie (LTD), respectievelijk kunnen worden gedifferentieerd door middel van de handel in α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptoren 4 , 5. AMPA receptoren zijn heterotetramers samengesteld uit vier subeenheden (GluA1-4), en de meerderheid van de snel excitatory synaptische transmissie in de hersenen6bemiddelen. Dus is neuron prikkelbaarheid grotendeels een functie van de hoeveelheid AMPA receptoren aan de postsynaptisch oppervlakte beschikbaar door glutamaat worden geactiveerd. LTD wordt vaak geassocieerd met een toename van AMPA receptor endocytose, overwegende dat LTP hoofdzakelijk geassocieerd met een toename van AMPA receptor exocytose is. Postsynaptisch oppervlakte expressie van AMPA receptoren vereist endosomal levering aan exocytotic proteïnen, waar de fusie met het plasma-membraan dan in een calcium-afhankelijke manier7,8,9,, plaatsvindt 10 , 11 , 12 , 13 , 14. er bestaan ook tal van mechanismen die activiteit-afhankelijke AMPA receptor endocytose regelen. Een voorbeeld hiervan is via het directe begin gen Arc/Arg3.1 (Arc). Onder andere functies15, Arc is bekend om te bemiddelen metabotropic glutamaat-receptor (mGluR)-afhankelijke LTD door het bevorderen van AMPA receptor endocytose via haar bindende-partners, hetgeen de endocytotische eiwitten AP-2, endophilin-3 en dynamin-2 omvat 16 , 17 , 18 , 19, in clathrin-gecoate kuilen20,21. Verinnerlijkte AMPA-receptoren kunnen worden gerecycleerd terug naar het plasmamembraan of bestemd voor afbraak22,23.
Nog belangrijker is, de samenstelling van de subeenheid van AMPA receptoren draagt bij aan hun mensenhandel dynamics24. Van groot belang is het intracellulaire C-terminal van de subeenheden, waar de meerderheid van de posttranslationele modificaties en mensenhandel-gerelateerde eiwitinteractie voorkomen. GluA1 en GluA4 subeenheid-bevattende AMPA receptoren zijn vooral geneigd te worden verhandeld op het celoppervlak tijdens LTP, gedeeltelijk als gevolg van de aanwezigheid van hun PDZ-liganden, ~ 90 aminozuur sequenties die bevordering van membraan verankering via interacties met diverse PDZ domein-bevattende eiwitten25,26. Aan de andere kant, meestal AMPA receptoren die GluA2 bevatten en gebrek aan GluA1 of GluA4 constitutively worden verhandeld maar accumuleren intracellulair met synaptic activiteit27. GluA2 subeenheden ondergaan RNA bewerken, naast het bevorderen van behoud in het endoplasmatisch reticulum28, waardoor de porie kanaal ondoordringbaar zijn voor calcium29, verder we subeenheid-specifieke handel als een belangrijke bemiddelaar van neuronale homeostase en plasticiteit. Interessant, heeft verstoring van de aantasting van de boog van het ubiquitin-afhankelijke aangetoond dat GluA1 endocytose verhogen en verhogen de oppervlakte uitdrukking van GluA2 subeenheid-bevattende AMPA receptoren nadat inductie van mGluR-LTD met selectieve groep I mGluR agonist (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), die aangeeft dat er nog veel worden geleerd met betrekking tot de mechanismen en de rol van subeenheid-specifieke AMPA receptor mensenhandel30.
Methoden voor het waarnemen van wijzigingen in oppervlakte expressie van receptoren zijn vaak omslachtig, tijdrovend of introduceren geen onnodige kunstdiscours. Biotine gebaseerde testen zijn een alomtegenwoordige en verkrijgbare benadering. Affiniteit zuivering van biotinyleerd oppervlakte receptoren vertegenwoordigt een voorbeeld, maar de noodzaak van het uitvoeren van elektroforese een grote hoeveelheid monstermateriaal vereist en ertoe dat de screening van meerdere behandelingen een buitensporig lange leiden kan verwerken van31. Extensies van deze bepaling, waar meerdere tijdstippen van etikettering en immunoprecipitations worden uitgevoerd om te kwantificeren van de geleidelijke afbraak van een eerste signaal, ook voorbijgaan aan de toevoeging van nieuwe — of gerecycleerd — receptoren naar de cel oppervlakte en enige verergeren de tijd en de materiële vereisten.
Andere benaderingen maken gebruik van chimeer constructies of de toevoeging van fluorescerende labels te observeren receptor mensenhandel32, soms met behulp van live cell imaging33,34. Terwijl potentieel krachtige, kan deze ontwerpen kunnen invloed hebben op de normale handel patronen van receptoren als gevolg van de mutaties of dramatische veranderingen in moleculegewicht geïntroduceerd in deze proteïnen. Het gebruik van kleurstoffen die label subcellular compartimenten door lage pH34,35 zijn niet-specifieke en maak onderscheid te maken tussen verschillende intracellulaire compartimenten belangrijk voor receptor mensenhandel (bv. lysosomen en Proteasomen) moeilijk. Tot slot, het gebruik van de confocal microscopie te visualiseren van de colocalization van de receptoren met markeringen in verband met handel en afbraak, zoals endosomal eiwitten of clathrin, terwijl het verstrekken van potentieel nuttig inzicht in specifieke lokalisatie met subcellular resolutie, zijn tijd, arbeidsintensief en kostbaar als gevolg van de noodzaak van het afzonderlijk analyseren van elke cel en de eis van confocal of Super resolutie microscopie.
Hier tonen we een hoge-inhoud receptor mensenhandel assay die compatibel is met primaire neuronale cultuur preparaten30. Deze methode labels afzonderlijk de oppervlakte en intracellulaire receptor zwembaden van vaste neuronen, waardoor de presentatie van gegevens als een verhouding van genormaliseerde oppervlak of verinnerlijkte receptor dichtheid om de totale dichtheid voor die receptor. De aard van de hoge-inhoud van deze methode is ideaal voor het screenen van meerdere behandelingen en/of genotypen in een kort tijdsbestek, en vereist alleen standaard cel kweken en antilichaam-incubatie expertise.
Kort, primaire neuronen zijn gegroeid in standaard 96-Wells-microplates en vervolgens behandeld zoals gedicteerd door de experimentele design, geïncubeerd met primaire antilichamen, gewassen en vaste. Cellen worden vervolgens geïncubeerd met een secundair antilichaam te etiketteren oppervlakte receptoren, gevolgd door een ander fixatie stap. Permeabilization dan treedt op en een tweede secundair antilichaam wordt gebruikt voor het etiketteren van interne receptor zwembaden. Tot slot zijn de cellen beeld met behulp van een infrarood fluorescerende microplate-scanner te kwantificeren van elke receptor de geïntegreerde bevolkingsdichtheid. Figuur 1 geeft een overzicht van onze hoge-inhoud test in vergelijking met een traditionele biotinylation assay.
Hoewel het protocol hier is geoptimaliseerd en specifiek voor AMPA receptor handel in primaire hippocampal neuron culturen aangeboden, worden deze procedure kan, in theorie, uitgebreid en aangepast voor verschillende receptoren in een verscheidenheid van celtypes.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Georgia State University.
1. bereiding van primaire Hippocampal neuronen (in laminaire Flow Hood)
- Isoleren van primaire hippocampal neuronen van gemengde seks postnatale dag (P) 0-1 muizen36zoals hiervoor is beschreven.
- Plaat neuronen in 96-Wells poly-D-lysine gecoat microplates bij een dichtheid van 2 x 104 cellen per putje.
- Bereiden van media voor het voederen van de neuronen door het toevoegen van 10 mL 50 x B-27, 5 mL voor 100 x Glutamine, 242 µL van 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) en 10 µL van 10 mg/mL gentamycine tot 485 mL van neuronale media (Zie Tabel van materialen).
- Feed neuronen36 zoals hiervoor is beschreven door het verwijderen van de helft (100 µL) van de vooraf bestaande media (geconditioneerde media, waarin de kiezers die ondersteuning bieden voor neuronale overleving genoemd) van elk putje en vervangen door 100 µL van 37 ° C voorverwarmde media bereid in stap 1.3 elke 3-4 dagen. Bewaar de geconditioneerde media van elke voeding op 4˚C voor stap 2.3.
2. meten van AMPA Receptor handel in reactie op DHPG (in laminaire Flow Hood)
- Op dag In Vitro (DIV) 14, bereiden een 500 µL stamoplossing van tetrodotoxine (TTX) met een concentratie van 2 mM met behulp van celkweek rang water.
Let op: TTX is een neurotoxine. Voorzichtig en voorkom contact met de huid. - Met behulp van een pipet meerkanaals, 100 µL verwijderen uit elk putje van de 96-Wells-microplate van neuronen en bundelen van de media.
- 2 µL van de stockoplossing TTX 1 ml van de gebundelde geconditioneerde media uit stap 2.2 maken een 4 µM oplossing van TTX toevoegen. Als er niet genoeg gepoolde geconditioneerde media, vervolgens gebruiken een aantal van de opgeslagen geconditioneerde media van stap 1.4.
- Het behandelen van neuronen met 100 µL per putje van de 4 µM oplossing van TTX uit stap 2.3. Plaats de microplate in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 4 uur.
- Bevestig een steriele glas Pasteur Pipetteer een zuig lijn en sluit een steriele 200 µL pipette uiteinde naar het uiteinde van de pipet. Verwijder het medium van elk goed zorgvuldig. Raak de bodem van de microplate waar de neuronen bevinden.
- Voeg 200 µL van kamertemperatuur neuronale media toe aan elk putje.
- Incubeer de microplate bij kamertemperatuur voor 15 minuten incubatie in 5% CO2 aangewezen maar niet noodzakelijk is.
3. Immunolabelling (in laminaire Flow Hood)
- Maak een 1:150 verdunning van het antilichaam van het anti-GluA1 of anti-GluA2 in neuronale media.
- Verwijder de neuronale media toegevoegd in stap 2.6. Breng 50 µL van de anti-GluA1 of anti-GluA2 antistof oplossingen in overeenkomstige putjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur aan antilichaam binding toestaan. 50 µL van neuronale media toevoegen aan de enige secundair antilichaam-controleputjes.
- Verwijder de antilichaam-oplossingen in stap 3.2 toegevoegd. Wassen van de microplate 3 keer met 100 µL per putje kamertemperatuur neuronale media om te verwijderen van een niet-afhankelijke antistoffen.
- Maak een 50 mM-stockoplossing van DHPG in neuronale media of cel cultuur rang water. Vortex de oplossing kort voor het volledig los van de DHPG. Deze oplossing vers bereiden op dezelfde dag van het experiment. Vermijd het gebruik van oude of ontdooide oplossingen.
- Verdun de stockoplossing in neuronale media naar 1:500 om een 100 µM-oplossing te maken.
- Verwijder het bestaande medium van elk putje. Voeg 100 µL per putje van de stockoplossing van 100 µM DHPG uit stap 3.5. Incubeer de microplate in de incubator bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 10 minuten.
- Verwijder van de oplossing van de DHPG toegevoegd in stap 3.6 en voeg 100 µL per putje neuronale media. Herhaal deze stap één meer tijd. Plaats de microplate in de incubator bij 37 ° C in 5% CO2 voor 5 min.
- Voeg de sacharose te maken van de 4% paraformaldehyde/4% sacharoseoplossing in PBS op dezelfde dag van het experiment. Vermijd het gebruik van oude of ontdooide oplossingen. Verwijder het medium toegevoegd in stap 3.7. Voeg 100 µL per putje van 4% paraformaldehyde/4% sacharoseoplossing. Herhaal stap 3.6-3.8 voor elk extra tijd-punt. Eenmaal voltooid, Incubeer de microplate bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
Let op: Paraformaldehyde voorraden in een zuurkast te behandelen. - Verwijder fixeerspray uit stap 3.8 en voeg 100 µL per putje van koude 1 x DPBS.
- Verwijder DPBS. Voeg 150 µL per putje blokkeerbuffer (een kant-en-klare formulering in TBS, Zie Tabel van materialen) en broeden ook bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten, na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
4. etikettering oppervlakte receptoren
- Maak een verdunning van de 1:1500 van 680RD geit-antimuis IgG secundair antilichaam in blokkeerbuffer.
- Buffer met blokkerend uit stap 3.10 verwijderen. Voeg 50 µL per putje van de oplossing van secundair antilichaam en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten houden de microplate beschermd tegen licht, zodra de secundaire antilichamen worden toegevoegd. Zorg ervoor dat te blijven de microplate beschermen tegen licht tijdens de latere incubations.
- De oplossing van stap 4.2 verwijderen. Voeg 100 µL per putje TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Herhaal deze stap 4 extra keer.
- TBS uit stap 4.3 verwijderen. Voeg 100 µL per putje van 4% paraformaldehyde/4% sucrose in PBS en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Oplossing van stap 4.4 verwijderen. Voeg 100 µL per putje TBS en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Herhaal deze stap 2 extra keer.
5. etikettering van de verinnerlijkte Receptor-bevolking
- Bereiden van TBS met 0,2% saponine. Vortex de oplossing kort voor het volledig los van het Zeepkruid-poeder. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 µm filter te verwijderen van alle deeltjes die auto-fluorescentie kunnen veroorzaken.
- Voeg 150 µL TBS met 0,2% saponine en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Saponine oplossing verwijderen uit stap 5.2 en 150 µL per putje blokkeerbuffer toe te voegen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten.
- Maak een verdunning van de 1:1500 van de 800CW Donkey-antimuis IgG secundair antilichaam in blokkeerbuffer.
- Verwijder buffer met blokkerend uit stap 5.3 en voeg 50 µL per putje van de secundair antilichaam-oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
- Voeg 100 µL per putje TBS en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Herhaal deze stap 4 extra keer.
6. imaging en analyse
- Het imago van de 96-Wells-microplate met behulp van een infrarood laser imaging systeem volgens de instructies van de fabrikant. De scanresolutie instellen op 84 µm, de scankwaliteit naar medium en de focus verschoven volgens de basis hoogte van de 96-Wells-microplate gebruikt. Klik op de "Image Studio" menu knop → exporteren → afbeelding voor digitalemedia → Export beelden met een resolutie van 300 dpi, in TIFF-indeling.
- Download Image J "Fiji" bij https://imagej.net/Fiji/Downloads
- Open afbeelding in afbeelding J "Fiji". Kleurkanalen splitsen door te klikken op het menu "Afbeelding"
→ Split kleurkanalen. - Open de manager van de ROI van "Analyseren" → "Tools". Vink het selectievakje 'labels' in de ROI-manager om de cirkels van een label met getallen.
- In de rode kanaal (het 680 nm oppervlakte receptor zwembad), de regio van belang (ROI) Selecteer door te selecteren het gereedschap cirkel en een cirkel die nauwkeurig de eerste goed past tekenen. Druk op Ctrl + T.
- Sleep de cirkel naar de volgende goed en druk op Ctrl + T. herhalen totdat alle putjes zijn omcirkeld.
- De ROI-manager, klik op "Maatregel". Selecteer de waarden die worden weergegeven en hen naar een werkblad kopiëren.
- Klik op het groene kanaal (het 800 nm interne receptor zwembad) en vervolgens de geselecteerde ROIs uit stap 6.6 naar de afbeelding omzetten. De ROI-manager, klik op "Maatregel". Selecteer de waarden die worden weergegeven en hen naar een werkblad kopiëren.
- Bereken de gemiddelde dichtheid van de geïntegreerde waarden uit de secundaire controle alleen wells. Aftrekken van de geïntegreerde dichtheid waarden voor elk experimenteel putje van de gemiddelde secundaire enige controle geïntegreerd dichtheid waarden voor de oppervlakte receptor-groep. Herhaal deze stap voor de groep van interne receptor.
- Wijzigingen in oppervlakte receptor expressie met Rs/rt, waar Rs vertegenwoordigt de geïntegreerde dichtheid van oppervlakte receptoren en Rt de geïntegreerde dichtheid van oppervlakte receptoren + geïntegreerde dichtheid van berekenen interne receptoren.
Representative Results
Boog/Arg3.1 versnelt AMPA receptor endocytose door interactie met de AP-2, endophilin-3 en dynamin-216,18 mGluR activering37na. In de boog knock-in muis (ArcKR), zijn lysines 268 en 269 in het Arc-eiwit gemuteerd naar arginine, die zich boog ubiquitination mengt. Dit belemmert de proteasoom-afhankelijke omzet van Arc en verlengt de halfwaardetijd in neuronen21,30. In dit experiment, werd de persistentie van Arc bij het reguleren van AMPA receptor handel onderzocht met behulp van de hoge-inhoud AMPA receptor mensenhandel assay. Neuronen werden behandeld met de nb+ kanaal blocker TTX, die remt actie potentials en vermindert Arc niveaus38, gevolgd door DHPG, die Arc vertaling en ubiquitination37,39 induceert. Zowel oppervlak en verinnerlijkte zwembaden van GluA1 - (figuur 2A) en GluA2-bevattende (figuur 3A) AMPA receptor subeenheden werden gemeten op 5 en 15 min na DHPG wassen. Dit bijzonder experiment gebruikt drie technische replicatieonderzoeken uit 3 onafhankelijke experimenten. ArcKR neuronen toonde verhoogde GluA1 endocytose wanneer behandeld met DHPG in vergelijking met WT neuronen, een effect dat niet gezien werd als neuronen werden behandeld met TTX alleen (figuur 2B). Oppervlakte expressie van GluA2 subeenheden steeg aanzienlijk op korte tijd punten in vergelijking met WT neuronen (figuur 3B), die een potentiële subeenheid vervanging30aangeeft. Sommige wells werden behandeld met secundaire antilichamen alleen aan besturingselement voor achtergrond fluorescentie veroorzaakt door niet-specifieke binding.
Figuur 1: vergelijking van de AMPA receptor high-inhoud mensenhandel test voor de bepaling van de biotinylation receptor. De mensenhandel bepaling van hoge-inhoud verbruikt minder tijd en middelen in vergelijking met de standaard biotinylation assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: oppervlakte en interne populaties van GluA1 AMPA receptor subeenheden in WT en ArcKR hippocampal neuronen. (A) oppervlak (sGluA1) en verinnerlijkte (iGluA1) GluA1-bevattende AMPA receptor subeenheden in WT en ArcKR hippocampal neuronen op 5 en 15 min na DHPG wassen. Vergeleken met WT, hebben ArcKR neuronen een verdere daling van de sGluA1-bevattende AMPA receptor zwembad 5 en 15 min na DHPG wassen. (B) de grafiek hieronder geeft oppervlakte fluorescentie genormaliseerd naar de totale fluorescentie-intensiteit. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van een one-way ANOVA, gepaarde en ongepaarde Student t testen. p ≤ 0,05; n = 3 technische replicatieonderzoeken uit 3 onafhankelijke experimenten. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd van muur, M. J. et al. 201830. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: oppervlakte en interne populaties van GluA2 AMPA receptor subeenheden in WT en ArcKR hippocampal neuronen. (A) de voorwaarde dezelfde experimentele als Figuur 2. Vergeleken met WT, hebben ArcKR neuronen een stijging in de sGluA2-bevattende AMPA receptor pool 5 min na DHPG wassen. (B) de grafiek hieronder geeft oppervlakte fluorescentie genormaliseerd naar de totale fluorescentie-intensiteit. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA, gepaarde en ongepaarde Student t testen. p ≤ 0,05; n = 3 technische replicatieonderzoeken uit 3 onafhankelijke experimenten. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd van muur, M. J. et al. 201830. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
AMPA receptoren zijn een ionotropic glutamaat-receptor subtype die integraal deel uitmaakt voor neuronale functies waaronder synaps formatie, synaps stabiliteit en synaptische plasticiteit. AMPA receptor verstoring is gekoppeld aan meerdere neurologische aandoeningen24 en worden beschouwd als aantrekkelijk drug targets40. Bijvoorbeeld, hebben studies aangetoond dat een van de vroegste tekenen van de ziekte van Alzheimer (AD) SYNAPS verlies is en verminderd synaptic AMPA receptor niveaus41,42. Intrigerend, schaadt toevoeging van Amyloid-ß oligomeren oppervlakte GluA1-bevattende AMPA receptor expressie synapsen43. Verder, status epilepticus down-reguleert GluA2 mRNA en eiwit in de hippocampal neuronen voorafgaand aan hun dood44. Amyotrofische laterale sclerose (ALS), TAR DNA-bindende eiwit (TDP-43) pathologie, een ALS-specifieke moleculaire abnormaliteit, heeft zijn gekoppeld aan inefficiënte GluA2 Q/R site-RNA bewerken45.
De hoge-inhoud AMPA receptor mensenhandel assay biedt een doeltreffend middel voor het meten van bulk veranderingen in de mensenhandel profielen receptor binnen een neuronale netwerk in reactie op diverse factoren, verbruiken veel minder tijd en materialen dan alternatieve methoden. Een enkele 96-Wells-microplate biedt talrijke putten voor het uitvoeren van meerdere technische gerepliceerd en controls voor verschillende experimentele omstandigheden in de dezelfde plaat. De dichtheid van de lage beplating van 2 x 10,4 cellen per putje ten opzichte van de dichtheid van 5 x 10,5 cellen/well aanzienlijk vermindert het aantal dieren en materialen die nodig zijn voor elk experiment (Figuur 1). De infrarood scanner kan maximaal zes 96-Wells microplates image op een moment. De bepaling kan ook aan een 384-well microplate46, die bijzonder waardevol zijn wordt als de bepaling wordt uitgevoerd op kostbare monsters die zijn moeilijk te verkrijgen zijn of duur om cultuur (bv. menselijke monsters en geïnduceerde pluripotente stamcellen) worden gewijzigd. De gehele bepaling kan worden voltooid en geanalyseerd op dezelfde dag, dat kostbare tijd (Figuur 1 bespaart).
Voor succesvol en efficiënt voltooiing van de test, enkele punten moeten worden overwogen. Ten eerste is het belangrijk om voor te bereiden van de oplossing van de DHPG op dezelfde dag van neuron behandeling. Niet hergebruiken of bevriezen DHPG voorraden. De 4% paraformaldehyde/4% sacharose in PBS oplossing moet ook plaatsvinden vers op dezelfde dag van het experiment. Ten tweede, controleputjes TTX alleen behandeld of voertuig zijn vereist om ervoor te zorgen dat de waargenomen effecten specifiek voor behandeling zijn. Het is ook cruciaal voor het opnemen van putten behandeld met alleen de secundaire antilichamen aan besturingselement voor achtergrond fluorescentie geproduceerd door niet-specifieke binding. Merk op dat de tweede stap van de fixatie (volgende wegspoeling van secundaire antilichamen) is de sleutel tot vermindering van de effecten van secundair antilichaam achtergrond en het bereiken van effectieve etikettering van receptor subeenheden.
Compromissen en beperkingen, bestaan zoals bij elke methode. Deze bepaling voorziet niet in één cel (of subcellular) resolutie en kan geen voor real-time tracking van receptor handel zoals andere methoden32,33,35. Bovendien is dat de juiste zorg moet worden genomen tijdens de stap van de permeabilization van neuronen, zoals deze methode gevoelig zijn zal voor het uitlekken van intracellulaire componenten in het geval van overmatige permeabilization.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Zachary Allen voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Stichting Whitehall (Grant 2017-05-35) en Cleon C. Arrington Research initiatie Grant Program (RIG-93) A.M.M. M.A.G. en D.W.Y. waren beide ondersteund door een Georgia State University Neurogenomics 2CI Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
| Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
| (RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
| Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
| Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
| Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
| Gentamycin (10 mg/mL) | Gibco | Cat#15710064 | |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
| Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
| Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
| 28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
| 96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
| Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |
References
- Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
- Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. , Wiley. (1949).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369 (1633), 20130288 (2014).
- Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5 (12), 952-962 (2004).
- Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58 (4), 472-497 (2008).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
- Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11 (4), 457-466 (2008).
- Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135 (3), 535-548 (2008).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141 (3), 524-535 (2010).
- Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10 (10), 0140868 (2015).
- Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544 (7650), 316-321 (2017).
- Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77 (3), 542-558 (2013).
- Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), E5744-E5752 (2015).
- Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
- Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28 (46), 11760-11767 (2008).
- Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52 (3), 445-459 (2006).
- Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19 (3), 319-326 (2009).
- Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
- DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2 (3), (2016).
- Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (24), 14112-14117 (1999).
- Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82 (6), 1299-1316 (2014).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28 (2), 511-525 (2000).
- Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63 (1), 92-105 (2009).
- Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17 (6), 337-350 (2016).
- Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287 (5461), 2262-2267 (2000).
- Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), 3948-3953 (2018).
- Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43 (2), 221-236 (2004).
- Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40 (4), 763-774 (2003).
- Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67 (1), 11-19 (1991).
- Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98 (6), 1124-1132 (2018).
- Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7351-7358 (1997).
- Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284 (5421), 1811-1816 (1999).
- Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18 (3), 402-407 (2015).
- Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
- Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27 (5), 257-261 (2004).
- Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
- Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59 (1), 84-97 (2008).
- Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52 (3), 475-484 (2006).
- Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. , (2015).
- Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35 (12), 1908-1916 (2012).
- Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52 (5), 831-843 (2006).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27 (5), 457-464 (1990).
- Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10639-10649 (2009).
- Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (7), 3631-3636 (2000).
- Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
- Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481 (7380), 185-189 (2011).
