Summary
יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו - אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.
Abstract
Postsynaptic סחר של רצפטורים על פני התא ואליה הוא מנגנון חשוב שבו נוירונים לווסת את התגובה לגירויים שונים. קולטני α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא) חומצה, אשר אחראים מהר סינאפסות הסינאפסית בנוירונים, בילנאומיים מן השטח postsynaptic כדי לשנות באופן דינמי עצביים דעתנית. אמפא קולטן סחר הוא חיוני פלסטיות סינפטית, עלולות להפגע, מחלה נוירולוגית. עם זאת, גישות נפוצות עבור לכימות קולטן סחר להתעלם בריכות קולטן כולו, הם יותר מדי זמן -, עתירי עבודה, או העלול לשבש את מנגנוני לסחר בבני אדם רגיל, ולכן לסבך את הפרשנות של הנתונים המתקבלים. אנו מציגים וזמינותו גבוהים-תוכן עבור כימות של פני השטח והן פנימיים אמפא קולטן אוכלוסיות בתרבית נוירונים בהיפוקמפוס הראשי באמצעות immunolabeling פלורסנט כפול וסורק microplate 96-ובכן פלורסנט-סגול. גישה זו מקלה על הקרנת בצובר הפנימו מהירה, על פני השטח קולטן צפיפויות תוך מזעור חומר מדגם. עם זאת, השיטה שלנו יש מגבלות קבלת רזולוציה תא בודד או תא חי דימות ניצוח. לבסוף, פרוטוקול זה עשוי להיות נוטה רצפטורים אחרים, לסוגי תאים שונים, הניתנים התאמות נאות ואופטימיזציה.
Introduction
גודל ואת הדינמיקה הטמפורלי של דעתנית העצבית היא תלויה במידה רבה על זמינות, הרכב האוכלוסיות קולטן משטח מגלי אותות אלקטרוכימי. ואילו הסינתזה של קולטנים חדשים (או קולטן subunits) הוא בדרך כלל תהליך אנרגטית יקר וממושך יחסית, שורה של מכונות הסלולר מוקדש אנדו - ואת אקסוציטוזה של רצפטורים הקיימים מספקים אמצעי להכנסה מהירה שלהם והסרה של קרום1ואליה. לכן, בנוסף גנים ברמת השעתוק והתרגום ויסות רצפטורים, קולטן posttranslational סחר הוא אפנן חשוב של דעתנית עצביים.
פלסטיות סינפטית, או שינוי עוצמת קשרים בין נוירונים עם ניסיון, הוא חשב יוצרות את הבסיס של לימוד, זיכרון2,3. חיזוק והתערערות של הסינפסות לאורך זמן, כינה הויסעגט (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ), בהתאמה, יכול להיות מאופנן דרך הסחר של רצפטורים חומצה α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (אמפא) 4 , 5. אמפא רצפטורים הן heterotetramers המורכב מארבע subunits (GluA1-4), לתווך הרוב המכריע של סינאפסות מהר הסינאפסית ב המוח6. לכן, נוירון דעתנית הוא במידה רבה פונקציה של הכמות של אמפא רצפטורים על פני postsynaptic זמין תופעל על-ידי גלוטמט. בע מ מזוהה בדרך כלל עם עלייה אמפא קולטן אנדוציטוזה, ואילו LTP מזוהה בעיקר עם עלייה אמפא קולטן אקסוציטוזה. ביטוי משטח postsynaptic של אמפא רצפטורים דורש endosomal משלוח חלבונים exocytotic, איפה פיוז'ן עם קרום פלזמה אז מתרחשת באופן תלוי סידן-7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. קיימים גם שורה של מנגנונים המסדירים את פעילות תלויי אמפא קולטן אנדוציטוזה. דוגמא אחת היא דרך הגן מוקדם מיידי Arc/Arg3.1 (Arc). בין פונקציות אחרות15, Arc ידוע לתווך גלוטמט מטבוטרופי (mGluR)-תלוי בע מ באמצעות קידום אמפא אנדוציטוזה קולטן דרך שותפיה איגוד, אשר כוללים את החלבונים endocytic AP-2, endophilin-3 dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19-מצופים clathrin בורות20,21. למביטה אמפא רצפטורים יכולים להיות ממוחזרים בחזרה אל קרום פלזמה או לייעד את השטח השפלה22,23.
חשוב לציין, ההרכב יחידת משנה של אמפא רצפטורים תורמת שלהם דינמיקה סחר24. מידת הרלוונטיות העיקריים הוא תאיים C-מסוף תחום של subunits, שבו רוב השינויים posttranslational אינטראקציות חלבון סחר הקשורות להתרחש. GluA1, GluA4 המכילים יחידת משנה אמפא רצפטורים נוטים במיוחד להיות הנסחר השטח תא במהלך LTP, בין השאר בשל נוכחותם של ליגנדים PDZ שלהם, רצפים של חומצות אמיניות ~ 90 המקדמים ממברנה עיגון באמצעות אינטראקציות עם PDZ שונים תחום המכיל חלבונים25,26. מצד שני, אמפא רצפטורים המכיל GluA2, GluA1 או GluA4 נוטים להיות הנסחר צורונים אבל להצטבר intracellularly עם פעילות סינפטית27. GluA2 subunits עוברים RNA עריכה אשר, בנוסף קידום השמירה רשתית תוך-פלזמית28, רינדור הנקבובית ערוץ אטום סידן29, בהמשך שמערבות יחידת משנה ספציפי סחר כמתווך מפתח של עצביים הומאוסטזיס, פלסטיות. מעניין, שיבוש אוביקוויטין תלוית Arc השפלה הוכח להגביר אנדוציטוזה GluA1 ולהגביר את הביטוי משטח של אמפא רצפטורים של יחידת משנה המכילות GluA2 לאחר אינדוקציה של mGluR-בע מ עם סלקטיבי לקבץ אני אגוניסט mGluR (S) - 3.5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), המציין כי הרבה נשאר מה ללמוד לגבי מנגנוני ו תפקיד של יחידת משנה ספציפי אמפא קולטן סחר30.
שיטות התבוננות שינויים בביטוי משטח של קולטני לעיתים מסורבל, זמן רב, או להציג מיותרים מבלבל. מבחני מבוסס-ביוטין הן בגישה נרחבת, זמינים מסחרית. זיקה טיהור של קולטני משטח biotinylated מייצג דוגמה אחת כזו, אולם נחיצות ביצוע אלקטרופורזה דורש כמות גדולה של חומר מדגם לרנדר ההקרנה של ריבוי טיפולים ארוך מדי תהליך31. הרחבות של זה וזמינותו, איפה נקודות זמן מרובות של תיוג, immunoprecipitations מתבצעים לכמת את הידרדרות הדרגתית של אות הראשונית, בדומה להזניח את התוספת של חדש — או ממוחזרים – רצפטורים לתא השטח ורק להחריף הזמן ואת דרישות החומרים.
גישות אחרות לעשות שימוש בונה chimeric או התוספת של תגיות פלואורסצנט לצפות קולטן סחר32, לעתים תוך שימוש חי תא33,הדמיה34. בזמן פוטנציאל רב-עוצמה, עיצובים אלו יכולים להשפיע על הדפוסים לסחר בבני אדם נורמלי של קולטני עקב מוטציות או שינויים דרמטיים משקל מולקולרי הציג חלבונים אלה. השימוש של צבעי כי תאים subcellular תווית על ידי מיקוד pH נמוך34,35 הם בלתי ספציפיים ולעשות הבחנה בין תאים תאיים שונים חשוב קולטן סחר בבני אדם (למשל. lysosomes ו proteasomes) קשה. לבסוף, השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית להמחיש את colocalization של קולטני עם סמנים המשויך סחר והשפלה, כגון חלבונים endosomal או clathrin, תוך מתן שעשוי להיות שימושי תובנה לוקליזציה ספציפי עם רזולוציה subcellular, האם הזמן עתירי עבודה, יקר בשל הצורך ניתוח בנפרד בכל תא לבין הדרישה קונאפוקלית או מיקרוסקופ ברזולוציה-העל.
. הנה, נדגים assay סחר קולטן גבוהה-תוכן התואם ראשי תרבות עצביים ההכנות30. שיטה זו תוויות בנפרד בבריכות קולטן משטח, תאיים של הנוירונים קבוע, המאפשר הצגת נתונים כיחס של משטח מנורמל או צפיפות קולטן למביטה לצפיפות הכוללת עבור כי קולטן. הטבע גבוהה-תוכן של שיטה זו הוא אידיאלי עבור הקרנת מספר טיפולים ו/או אחרים בתוך מסגרת זמן קצר, ודורש תא רגיל רק culturing נוגדן הדגירה ומומחיות.
בקצרה, נוירונים העיקרי גדל סטנדרטי microplates 96-ובכן, ואז שטופלו כפי שמכתיבה תכנון ניסויים, מודגרות עם נוגדנים הראשי, שטופים קבוע. תאים מודגרת אז עם נוגדן משני לתייג רצפטורים משטח, ואחריו שלב קיבוע נוסף. מתרחשת permeabilization ואז ומשמש נוגדן המשני השני לתייג בריכות קולטן פנימי. לבסוף, התאים הם צילמו באמצעות סורק microplate פלורסנט אינפרא-אדום כדי לכמת את הצפיפות משולבת של כל האוכלוסייה קולטן. איור 1 מסכמת שלנו וזמינותו גבוהים-תוכן לעומת assay biotinylation המסורתי.
בעוד הפרוטוקול הציע הנה ממוטבת וספציפי על קולטן אמפא סחר בתרבויות העיקרי נוירון בהיפוקמפוס, הליך זה, תיאורטית, להיות מורחב, מותאם קולטנים שונים במגוון סוגי תאים.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת ג'ורג'יה.
1. הכנת ראשי נוירונים בהיפוקמפוס (ב למינארי)
- לבודד נוירונים בהיפוקמפוס הראשי מיום כמחנכת סקס מעורב (P) 0-1 עכברים כאמור תיאר36.
- צלחת נוירונים ב- 96-ובכן פולי-D-ליזין מצופה microplates-צפיפות של תאים4 עונה 2 פרק 10 לכל טוב.
- להתכונן מדיה האכלה הנוירונים על-ידי הוספת 10 מ"ל של 50 x B-27, 5 מ של 100 x גלוטמין, µL 242 של 10 מ"ג/מ"ל 5-פטור-2 ′-deoxyuridine (FUDR) ו-10 µL של 10 מ"ג/מ"ל Gentamycin 485 מ של התקשורת העצבית (ראה טבלה של חומרים).
- נוירונים הזנה כאמור תיאר36 על-ידי הסרת חצי (100 µL) קיימים מדיה (המכונה מדיה ממוזגים, אשר מכיל את המרכיבים התומכים הישרדות עצביים) מכל קידוח, החלפת µL 100 של 37 ° C prewarmed מדיה מוכן בשלב 1.3 כל 3-4 ימים. חנות המדיה ממוזגים מן כל הנקה-4˚C עבור שלב 2.3.
2. מדידת קולטן אמפא סחר בתגובה DHPG (ב למינארי)
- בהיום בחוץ גופית (DIV) 14, להכין 500 µL מניות פתרון של טטרודוקסין (TTX)-ריכוז של 2 מ מ באמצעות תרבית תאים כיתה מים.
התראה: טטרודוטוקסין הוא רעלן עצבי. לטפל בזהירות ולהימנע מגע עם העור. - באמצעות פיפטה של רב ערוצית, הסר 100 µL מכל קידוח של microplate 96-ובכן של נוירונים, מאגר המדיה.
- להוסיף 2 µL של הפתרון מניות TTX 1 מ"ל של המדיה ממוזגים במאגר מהשלב 2.2 כדי ליצור פתרון 4 מיקרומטר של טטרודוטוקסין. אם אין מספיק במאגר מדיה ממוזגים, ואז להשתמש בחלק המדיה ממוזגים מאוחסנות מן 1.4 שלב.
- פנקו נוירונים עם µL 100/טוב של הפתרון 4 מיקרומטר של TTX מהשלב 2.3. מקם את microplate CO 5%2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
- צרף זכוכית סטריליים פסטר פיפטה לקו יניקה, לצרף קצה פיפטה 200 µL סטרילי קצה פיפטה. להסיר את המדיה מכל טוב בקפידה. להימנע מלגעת בתחתית microplate שבו ממוקמים הנוירונים.
- להוסיף 200 µL של התקשורת העצבית בטמפרטורת החדר מכל קידוח.
- דגירה של microplate בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות הדגירה 5% CO2 הוא מועדף אבל לא הכרחי.
3. Immunolabelling (ב למינארי)
- להכין 1:150 לדילול נוגדן anti-GluA1 או אנטי-GluA2 בתקשורת העצבית.
- הסר את כלי התקשורת העצבית שנוספו ב- 2.6 שלב. להוסיף 50 µL של פתרונות נוגדן anti-GluA1 או אנטי-GluA2 בארות המתאים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר הנוגדן מחייב. להוסיף 50 µL של התקשורת העצבית הבארות שליטה נוגדנים משניים בלבד.
- הסר את הפתרונות נוגדן נוסף בשלב 3.2. לשטוף את microplate 3 פעמים עם 100 התקשורת העצבית בטמפרטורת החדר µL/טוב כדי להסיר את כל הנוגדנים לא מאוגד.
- להפוך את פתרון מניות 50 מ מ של DHPG בתקשורת העצבית או תא תרבות כיתה מים. מערבולת הפתרון בקצרה כדי לפזר באופן מלא את DHPG. להכין טרי הפתרון הזה באותו יום של הניסוי. הימנע משימוש ישנים או המופשרים פתרונות.
- לדלל את הפתרון מניות בתקשורת העצבית עד שבערך לעשות פתרון 100 מיקרומטר.
- הסר את המדיה הקיימים מכל קידוח. להוסיף 100 µL טוב של הפתרון מניות של DHPG 100 מיקרומטר שלב 3.5. דגירה של microplate בחממה ב 37 ° C 5% CO2 למשך 10 דקות.
- להסיר את הפתרון DHPG הוסיף בשלב 3.6 ולהוסיף 100 התקשורת העצבית µL/טוב. חזור על שלב זה עוד פעם אחת. מניחים את microplate בחממה ב 37 ° C 5% CO2 במשך 5 דקות.
- הוסף את סוכרוז כדי להפוך את הפתרון סוכרוז paraformaldehyde/4% 4% ב- PBS באותו יום של הניסוי. הימנע משימוש ישנים או המופשרים פתרונות. הסר את המדיה הוסיף בשלב 3.7. להוסיף 100 µL טוב בפתרון סוכרוז paraformaldehyde/4% 4%. חזור על הצעדים 3.6 – 3.8 בכל נקודת זמן נוספים. פעם אחת להשלים, דגירה של microplate ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
התראה: לטפל paraformaldehyde מניות ברדס fume. - הסרת מקבע שלב 3.8 ולהוסיף µL 100/טוב של x DPBS 1 קר.
- להסיר את DPBS. להוסיף 150 µL/טוב חסימת מאגר (ניסוח מוכן לשימוש ב- TBS, עיין בטבלה של חומרים), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות לחלופין, דגירה בין לילה ב 4 º C.
4. רצפטורים משטח labelling
- להכין לדילול 1:1500 680RD עז העכבר אנטי איג משני נוגדן במאגר חסימה.
- הסר חסימה מאגר שלב 3.10. הוסף µL 50/טוב של הפתרון נוגדנים משניים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דק. שמור microplate מוגן מפני אור ברגע נוגדנים משניים נוספים. הקפד להמשיך להגן על microplate את האור במהלך incubations הבאים.
- הסר את הפתרון משלב 4.2. הוסף µL 100/TBS (50 מ מ טריס-HCl, 150 מ מ NaCl, pH 7.6) ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. חזור על שלב זה 4 פעמים נוספות.
- הסר TBS שלב 4.3. מוסיפים µL 100/טוב של 4% סוכרוז paraformaldehyde/4% PBS, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- הסר את פתרון של שלב 4.4. הוסף µL 100/TBS טוב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. חזור על השלב 2 פעמים נוספות.
5. האוכלוסייה קולטן למביטה labelling
- להכין TBS המכיל סאפונין 0.2%. מערבולת הפתרון בקצרה מלא להמיס את האבקה סאפונין. לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 µm כדי להסיר את כל החלקיקים שעלולה לגרום אוטומטי-זריחה.
- להוסיף 150 µL TBS המכיל סאפונין 0.2% ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- הסר סאפונין פתרון של שלב 5.2 ולהוסיף 150 מאגר חסימה µL/טוב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.
- להכין לדילול 1:1500 800CW חמור העכבר אנטי איג נוגדן משני במאגר חסימה.
- הסר חסימה מאגר שלב 5.3 ולהוסיף 50 µL טוב של הפתרון נוגדנים משניים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות.
- הוסף µL 100/TBS טוב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. חזור על שלב זה 4 פעמים נוספות.
6. הדמיה וניתוח
- תמונה של microplate 96-ובכן באמצעות לייזר אינפרא-אדום של הדמיה מערכת על פי הוראות היצרן. הגדר את רזולוציית הסריקה מיקרומטר 84, את איכות הסריקה בינונית מבטיחות את קיזוז על פי גובה הבסיס microplate 96-ובכן בשימוש. לחץ על ה "תמונת סטודיו" תפריט לחצן ← לייצא ← תמונה עבור מדיה דיגיטלית ← ייצוא תמונות ברזולוציה של 300 dpi, בתבנית TIFF.
- הורד תמונה J "פיג'י"-https://imagej.net/Fiji/Downloads
- תמונה פתוחה ב- J תמונה "פיג'י". פצל ערוצים צבע על ידי לחיצה על תפריט 'תמונה'
צבע ← פצל ערוצים. - פתח את מנהל רועי מ "לנתח" ← "כלים". סמן את התיבה "תוויות" במנהל רועי לתייג את העיגולים עם מספרים.
- באדום ערוץ (680 nm קולטן משטח הבריכה), בחר את האזור של הריבית (ROI) על-ידי בחירת הכלי מעגל ציור מעגל שמתאים באופן מדויק את הבאר הראשונה. הקש Ctrl + T.
- גררו את העיגול הבא טוב והקש Ctrl + טי חוזר עד כל בארות מוקפים בעיגול.
- מהמנהל רועי, לחץ על "מידה". בחר את הערכים מופיעים ולהעתיק אותם אל גיליון אלקטרוני.
- לחץ על ערוץ הצבע הירוק (800 nm קולטן פנימית הבריכה) ולאחר מכן לשקף את ROIs שנבחרה מ שלב 6.6 על התמונה. מהמנהל רועי, לחץ על "מידה". בחר את הערכים מופיעים ולהעתיק אותם אל גיליון אלקטרוני.
- לחשב שערכי צפיפות משולב ממוצע המשני רק לשלוט בארות. להחסיר את ערכי דחיסות משולב במשך כל ניסיוני מתוך ממוצע משני היחידה בקרה משולבת צפיפות הערכים עבור מאגר קולטן משטח. חזור על שלב זה עבור הבריכה קולטן פנימי.
- לחשב שינויים בביטוי קולטן השטח באמצעות Rs/Rt, כאשר Rs מייצג הצפיפות משולב של קולטנים משטח ומייצג Rt הצפיפות משולב של קולטנים משטח + צפיפות משולב קולטנים פנימי.
Representative Results
Arc/Arg3.1 מאיצה אמפא אנדוציטוזה קולטן תוך אינטראקציה עם AP-2, endophilin-3 ו- dynamin-216,18 בעקבות הפעלת mGluR37. קשת בטוק העכבר (ArcKR), lysines 268, 269 בתוך החלבון קשת הם מוטציה ל ארגינין, אשר משבשת קשת ubiquitination. זה פוגע פרוטאוזום תלוית מחזור של קשת, מאריך את זמן מחצית החיים שלה בתוך הנוירונים21,30. בניסוי זה, התמדתו של קשת בוויסות אמפא קולטן סחר נבדקה באמצעות אמפא גבוהה-תוכן קולטן וזמינותו לסחר בבני אדם. נוירונים טופלו את החוסם ערוץ Na+ TTX, אשר מעכב את פוטנציאל פעולה ומקטין Arc רמות38, ואחריו DHPG, אשר מעניקה קשת ותרגום37,ubiquitination39. השטח והן למביטה בריכות של GluA1 - (איור 2 א) המכילים GluA2 (איור 3 א) אמפא קולטן subunits היו נמדד ב 5 ו-15 דקות לאחר כשלון DHPG. בניסוי מסוים משמש משכפל טכני 3 מ- 3 ניסויים עצמאית. הנוירונים ArcKR הראה אנדוציטוזה GluA1 מוגברת כאשר מטופלים עם DHPG בהשוואה WT הנוירונים, אפקט שלא נראתה כאשר נוירונים שטופלו TTX בלבד (איור 2B). ביטוי משטח GluA2 subunits היה משמעותי מוגברת בנקודות זמן קצר בהשוואה WT נוירונים (איור 3B), המציינת את החלפת יחידת משנה פוטנציאליים30. מספר בארות טופלו נוגדנים משניים בלבד כדי לשלוט על רקע זריחה הנגרמת על-ידי איגוד לא ספציפית.
איור 1: השוואה של אמפא קולטן גבוהה-תוכן סחר וזמינותו כדי וזמינותו biotinylation הקולטן. וזמינותו סחר גבוהה-תוכן צורכת פחות זמן ומשאבים לעומת וזמינותו biotinylation רגיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אוכלוסיות משטח ופנימיים של אמפא GluA1 subunits קולטן של נוירונים בהיפוקמפוס WT ו- ArcKR. (א) השטח (sGluA1), subunits קולטן אמפא המכילות GluA1 למביטה (iGluA1) של נוירונים בהיפוקמפוס WT ו- ArcKR-5 ו-15 דקות לאחר כשלון DHPG. בהשוואה ל- WT, הנוירונים ArcKR יש ירידה נוספת מין בריכה 5 ו-15 המכילות sGluA1 ' של קולטן אמפא לאחר כשלון DHPG. (B) גרף מייצג משטח פלורסצנטיות מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל. השוואות סטטיסטי בוצעו באמצעות ANOVA בכיוון אחד, בדיקות t מזווג, אינטראקצית הסטודנט. p ≤ 0.05; n = משכפל טכני 3 מ- 3 ניסויים עצמאית. ערכים מייצגים זאת אומרת ± ב- SEM... איור זה השתנה, מ' ג' ואח 201830מהחומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אוכלוסיות משטח ופנימיים של אמפא GluA2 subunits קולטן של נוירונים בהיפוקמפוס WT ו- ArcKR. (א) ניסיוני באותו המצב כמו באיור 2. בהשוואה ל- WT, הנוירונים ArcKR יש גידול המכילים sGluA2 אמפא קולטן לבריכה 5 דקות לאחר כשלון DHPG. (B) גרף מייצג משטח פלורסצנטיות מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל. השוואות סטטיסטי בוצעו באמצעות חד-כיווני אנובה, בדיקות t מזווג, אינטראקצית הסטודנט. p ≤ 0.05; n = משכפל טכני 3 מ- 3 ניסויים עצמאית. ערכים מייצגים זאת אומרת ± ב- SEM... איור זה השתנה, מ' ג' ואח 201830מהחומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
אמפא רצפטורים הן סוג של קולטן גלוטמט ionotropic זה הוא חלק בלתי נפרד עבור פונקציות עצביים הכוללים סינפסה היווצרות סינפסה ויציבות פלסטיות סינפטית. אמפא קולטן הפרעה מקושר הפרעות נוירולוגיות מספר24 , והם נחשבים אטרקטיביים סמים מטרות40. לדוגמה, מחקרים הראו כי אחד הסימנים המוקדמים של מחלת אלצהיימר (AD) אובדן סינפסה, מופחתת סינפטית אמפא קולטן רמות41,42. מסקרן, תוספת של עמילואיד-ß oligomers פוגע ביטוי הקולטן אמפא המכילות GluA1 משטח הסינפסות43. יתר על כן, סטטוס אפילפטיקוס למטה-מסדיר GluA2 mRNA וחלבון בנוירונים בהיפוקמפוס שלפני המוות שלהם44. נוירודגנרטיביות (ALS), TAR DNA כריכת חלבון (TDP-43) פתולוגיה, חריגות מולקולרי ספציפי ALS, יש כבר אתר GluA2 Q/R מקושר לא יעיל-RNA עריכת45.
אמפא גבוהה-תוכן קולטן וזמינותו סחר מספק אמצעי יעיל למדידת שינויים בכמות גדולה בפרופילי סחר קולטן בתוך רשת עצביים בתגובה לגורמים שונים, לצרוך הרבה פחות זמן וחומרים מאשר שיטות אלטרנטיביות. Microplate 96-ובכן יחיד מספק בארות רבות כדי להפעיל טכנית מרובים משכפל ופקדים עבור תנאים שונים ניסיוני באותה הצלחת. צפיפות נמוכה ציפוי של 2 x 104 תאים/טוב יחסית צפיפות התאים/טוב 5 x 105 מפחית באופן משמעותי את מספר חיות וחומרים הדרושים עבור ניסוי (איור 1). דאגה אפשר תמונה עד שישה 96-ובכן microplates בכל פעם. גם יכול להיות שונה וזמינותו 384-ובכן microplate46, אשר הופך להיות יקר במיוחד אם וזמינותו מופעל על דגימות היקרה, קשה להשיג או יקרים לתרבות (למשל אדם ודוגמאות גזע pluripotent המושרה). וזמינותו כולו יכול להיות הושלמה וניתח באותו יום, אשר חוסך זמן יקר (איור 1).
עבור סיום מוצלח ויעיל וזמינותו, כמה נקודות צריך להיחשב. ראשית, חשוב להכין את הפתרון DHPG באותו יום של נוירון טיפול. אין לעשות שימוש חוזר או להקפיא DHPG מניות. סוכרוז paraformaldehyde/4% 4% ב- PBS פתרון צריך להתבצע גם טריים באותו יום של הניסוי. שנית, שליטה בארות שטופלו TTX בלבד או הרכב נדרשים כדי להבטיח כי ההשפעות נצפתה ספציפי לטיפול. חשוב גם כדי לכלול בארות שטופלו רק נוגדנים משניים כדי לשלוט על רקע זריחה המיוצר על-ידי איגוד שאינם ספציפיים. שימו לב כי הצעד השני קיבעון (הבאים כשלון של נוגדנים משניים) מפתח כדי להפחית את תופעות רקע נוגדנים משניים ולהשיג labelling יעיל של הקולטן subunits.
פשרות ומגבלות, כמו עם כל שיטה, קיים. Assay הזה אינו מספק רזולוציה תא בודד (או subcellular), אינו מאפשר מעקב בזמן אמת של קולטן סחר כמו שאר שיטות32,33,35. בנוסף, טיפול נאות יש לנקוט במהלך השלב permeabilization של הנוירונים, כמו בשיטה זו יהיה רגיש הדליפות מרכיבים תאיים במקרה של permeabilization יתר.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים זכריה אלן לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי קרן וייטהול (גרנט 2017-05-35), קליאון ג ארינגטון חניכה גרנט תכנית המחקר (מעטה-93) A.M.M. M.A.G., D.W.Y. היו שניהם נתמך על ידי מלגת 2CI Neurogenomics אוניברסיטת מדינת ג'ורג'יה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
| Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
| (RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
| Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
| Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
| B-27 Supplement (50x), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
| Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
| Gentamycin (10 mg/mL) | Gibco | Cat#15710064 | |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
| Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
| Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
| 28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
| 96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
| Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |
References
- Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
- Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. , Wiley. (1949).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369 (1633), 20130288 (2014).
- Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5 (12), 952-962 (2004).
- Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58 (4), 472-497 (2008).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
- Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11 (4), 457-466 (2008).
- Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135 (3), 535-548 (2008).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141 (3), 524-535 (2010).
- Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10 (10), 0140868 (2015).
- Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544 (7650), 316-321 (2017).
- Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77 (3), 542-558 (2013).
- Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), E5744-E5752 (2015).
- Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
- Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28 (46), 11760-11767 (2008).
- Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52 (3), 445-459 (2006).
- Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19 (3), 319-326 (2009).
- Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
- DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2 (3), (2016).
- Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (24), 14112-14117 (1999).
- Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82 (6), 1299-1316 (2014).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28 (2), 511-525 (2000).
- Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63 (1), 92-105 (2009).
- Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17 (6), 337-350 (2016).
- Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287 (5461), 2262-2267 (2000).
- Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), 3948-3953 (2018).
- Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43 (2), 221-236 (2004).
- Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40 (4), 763-774 (2003).
- Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67 (1), 11-19 (1991).
- Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98 (6), 1124-1132 (2018).
- Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7351-7358 (1997).
- Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284 (5421), 1811-1816 (1999).
- Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18 (3), 402-407 (2015).
- Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
- Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27 (5), 257-261 (2004).
- Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
- Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59 (1), 84-97 (2008).
- Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52 (3), 475-484 (2006).
- Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. , (2015).
- Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35 (12), 1908-1916 (2012).
- Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52 (5), 831-843 (2006).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27 (5), 457-464 (1990).
- Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10639-10649 (2009).
- Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (7), 3631-3636 (2000).
- Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
- Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481 (7380), 185-189 (2011).
