Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En høj-indhold analysen til overvågning af AMPA Receptor handel

doi: 10.3791/59048 Published: January 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Neuronal ophidselse kan moduleres gennem en dynamisk proces af endo- og exocytose excitatoriske ionotropic glutamat receptorer. Beskrevet her er en tilgængelig, high-indhold analyse til kvantificering overflade og indre receptor deltagergrupper.

Abstract

Postsynaptiske handel med receptorer til og fra cellens overflade er en vigtig mekanisme som neuroner modulere deres reaktionsevne på forskellige stimuli. Α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) receptorer, som er ansvarlig for hurtigt excitatoriske synaptisk transmission i neuroner, der handles til og fra den postsynaptiske overflade til at ændre dynamisk neuronal ophidselse. AMPA receptor handel er essentiel for synaptisk plasticitet og kan afbrydes i neurologisk sygdom. Dog udbredt tilgange til kvantificering af receptor handel ignorere hele receptor puljer, er alt for tid - og arbejdskrævende, eller potentielt forstyrre normale handel mekanismer og således komplicere fortolkningen af resulterende data. Vi præsenterer en høj-indhold analyse til kvantificering af både overflade og indre AMPA-receptoren populationer i kulturperler primære hippocampus neuroner ved hjælp af dobbelt fluorescerende immunolabeling og en nær-infrarødt fluorescerende 96-brønd mikrotiterplade scanner. Denne tilgang fremmer hurtig screening af bulk internaliseret og overflade receptor tætheder samtidig minimere prøvemateriale. Vores metode har imidlertid begrænsninger i at opnå én celle opløsning eller gennemføre levende celle billeddannelse. Endelig, denne protokol kan være modtagelig til andre receptorer og forskellige celletyper, forudsat at passende justeringer og optimering.

Introduction

Omfang og tidsmæssige dynamics af neuronal ophidselse er stort set afhængig af tilgængelighed og sammensætningen af overflade receptor populationer, som transduce elektrokemiske signaler. Syntese af nye receptorer (eller receptor underenheder) er generelt en energisk dyre og forholdsvis langvarige proces, et væld af cellulære maskiner dedikeret til endo- og exocytose af eksisterende receptorer giver mulighed for deres hurtig indsættelse og fjernelse til og fra membran1. Derfor, ud over det transkriptionel og translationel regulering af receptorer, posttranslationelle receptor handel er et vigtigt modulator af neuronal ophidselse.

Synaptisk plasticitet, eller den ændrede styrke forbindelser mellem neuroner med erfaring, menes at danne grundlag for læring og hukommelse2,3. Styrkelse og svækkelse af synapser over tid, betegnes langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD), henholdsvis, kan moduleres gennem handel med α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) receptorer 4 , 5. AMPA-receptorer er heterotetramers bestående af fire underenheder (GluA1-4), og mægle størstedelen af hurtigt excitatoriske synaptisk transmission i hjernen6. Neuron ophidselse er således i vid udstrækning en funktion af mængden af AMPA-receptorer på den postsynaptiske overflade kan aktiveres af glutamat. LTD er ofte forbundet med en forhøjelse af AMPA-receptoren endocytose, hvorimod LTP er overvejende knyttet til en forøgelse af AMPA-receptoren exocytose. Postsynaptiske overflade udtryk af AMPA-receptorer kræver endosomal levering til exocytotic proteiner, hvor fusion med plasmamembran derefter forekommer i en calcium-afhængige måde7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. der findes også et væld af mekanismer, der regulerer aktivitet afhængig af AMPA-receptoren endocytose. Et eksempel herpå er via den umiddelbare tidlig gen Arc/Arg3.1 (Arc). Blandt andre funktioner15, Arc er kendt at mægle metabotropic glutamat receptor (mGluR)-afhængige LTD ved at fremme AMPA-receptoren endocytose gennem dets bindende partnere, som omfatter endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 og dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, på clathrin-belagt Gruber20,21. Internaliseret AMPA-receptorer kan enten genbruges tilbage til plasma membran eller øremærket til nedbrydning22,23.

Vigtigere, bidrager subunit sammensætningen af AMPA-receptorer til deres menneskehandel dynamics24. Af stor betydning er de intracellulære C-terminal domæne underenheder, hvor fleste af posttranslationelle modifikationer og handel-relaterede protein interaktioner forekomme. GluA1 og GluA4 subunit-holdige AMPA-receptorer er særligt egnet til at være smugles til cellens overflade under LTP, delvis på grund af tilstedeværelsen af deres PDZ ligander, ~ 90 aminosyre-sekvenser, der fremmer membran forankring via interaktion med forskellige PDZ domæne-holdige proteiner25,26. På den anden side AMPA-receptorer indeholdende GluA2 og mangler GluA1 eller GluA4 har tendens til at være smugles constitutively men ophobes intracellulært med synaptic aktivitet27. GluA2 subunits gennemgå RNA redigering, som, ud over at fremme fastholdelse i det endoplasmatiske reticulum28, gengiver kanal pore uigennemtrængelige for calcium29, yderligere implicere subunit-specifikke menneskehandel som en vigtig mediator af neuronal homøostase og plasticitet. Interessant, har afbrydelse af ubiquitin-afhængige Arc nedbrydning vist sig at øge GluA1 endocytose og øge den overflade udtryk af GluA2 subunit-holdige AMPA-receptorer efter induktion af mGluR-LTD med den selektive gruppe I mGluR agonist (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), der angiver, at stadig meget læres med hensyn til mekanismer og rolle subunit-specifikke AMPA-receptoren menneskehandel30.

Metoder til at observere ændringer i overflade udtryk af receptorer er ofte besværligt, tidskrævende, eller indføre unødvendige tilintetgør. Biotin-baserede assays er en pervasive og kommercielt tilgængelige tilgang. Affinitet rensning af biotinylated overflade receptorer repræsenterer et eksempel, men nødvendigheden af at udføre elektroforese kræver en stor mængde af prøvemateriale og kan gengive screening af flere behandlinger et uoverkommeligt lang processen31. Udvidelser af denne analyse, hvor flere tidspunkter af mærkning og immunoprecipitations udføres for at kvantificere den gradvise nedbrydning af et indledende signal, ligeledes forsømme tilføjelsen af nye — eller genanvendt-receptorer på cellen overflade og kun forværre tid og materielle krav.

Andre tilgange gøre brug af kimære konstruktioner eller tilsætning af fluorescerende tags at observere receptor menneskehandel32, sommetider ved hjælp af live cell imaging33,34. Mens potentielt magtfulde, kan disse designs påvirke de normale handel med mønstre af receptorer på grund af mutationer eller dramatiske ændringer i Molekylær vægt indført i disse proteiner. Brugen af farvestoffer at etiketten subcellulært rum ved at målrette lave pH34,35 er uspecifikke og skelne mellem forskellige intracellulære rum vigtig for receptor menneskehandel (e.g. lysosomer og proteasomes) vanskeligt. Endelig brugen af Konfokal mikroskopi til at visualisere colocalization receptorer med datamærker forbundet med handel og nedbrydning, såsom endosomal proteiner eller clathrin, samtidig potentielt nyttig indsigt i specifikke lokalisering med subcellulært opløsning, er tid, arbejdskrævende og dyrt på grund af nødvendigheden af individuelt analysere hver celle og kravet om Konfokal eller Super-resolution mikroskopi.

Her viser vi en høj-indhold receptor menneskehandel assay, der er kompatible med primære neuronal kultur præparater30. Denne metode etiketter separat overflade og intracellulære receptor puljer af faste neuroner, gør det muligt præsentation af data som et forhold af normaliserede overflade eller internaliseret receptor tæthed til den samlede massefylde for at receptor. High-indhold karakteren af denne metode er ideel til screening flere behandlinger og/eller genotyper i en kort tidsramme, og kræver kun standard celle dyrkning og antistof inkubation ekspertise.

Kort, primære neuroner er vokset i standard 96-brønd mikroplader og derefter behandlet da dikteres af eksperimentelle design, inkuberes med primære antistoffer, vasket og fast. Cellerne inkuberes derefter med en sekundær antistof at mærke overflade receptorer, efterfulgt af en anden fiksering trin. Permeabilization derefter opstår og en anden sekundær antistof bruges til at mærke interne receptor swimmingpools. Endelig er celler afbildet ved hjælp af en infrarød fluorescerende mikrotiterplade scanner til at kvantificere den integrerede befolkningstæthed hver receptor. Figur 1 opsummerer vores high-indhold analyse i forhold til en traditionel biotinylation assay.

Mens protokollen, der tilbydes her er optimeret og specifikke for AMPA-receptoren handel med primære hippocampus neuron kulturer, blive denne procedure kunne i teorien, udvidet og tilpasset forskellige receptorer i en lang række celletyper.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Georgia State University.

1. forberedelse af primære hippocampus neuroner (i Laminar Flow Hood)

  1. Isolere primære hippocampus neuroner fra blandet sex postnatal dag (P) 0-1 mus som tidligere beskrevet36.
  2. Plade neuroner i 96-brønd poly-D-lysin belagt mikroplader med en tæthed på 2 x 104 celler pr. brønd.
  3. Forberede medier for fodring af neuroner ved tilsætning af 10 mL af 50 x B-27, 5 mL 100 x glutamin, 242 µL af 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) og 10 µL af 10 mg/mL phosphatbufferet til 485 mL af neuronal media (Se Tabel af materialer).
  4. Feed neuroner som tidligere beskrevet36 ved at fjerne halvdelen (100 µL) af de eksisterende media (benævnt konditioneret medier, som indeholder bestanddele, der understøtter neuronal overlevelse) fra hver brønd og erstatte med 100 µL af 37 ° C forvarmet medier rede i trin 1.3 hver 3-4 dage. Gemme konditioneret medierne fra hver fodring på 4˚C for trin 2.3.

2. måling af AMPA-receptoren menneskehandel som svar på DHPG (i Laminar Flow Hood)

  1. På dagen i Vitro (DIV) 14, forberede en 500 µL stamopløsning af Tetrodotoxin (TTX) ved en koncentration på 2 mM ved hjælp af cellekultur grade vand.
    Forsigtighed: TTX er en nervegift. Håndtere omhyggeligt og undgå kontakt med huden.
  2. Brug af en multikanal-pipette, ophæve 100 µL af hvert hul i 96-brønd mikrotiterplade af neuroner og pool i medierne.
  3. Tilføj 2 µL af stamopløsningen TTX til 1 mL af poolede konditioneret medierne fra trin 2.2 opretter en 4 µM løsning af TTX. Hvis der ikke er nok poolede konditioneret medier, derefter bruge nogle af de lagrede konditioneret medier fra trin 1.4.
  4. Behandle neuroner med 100 µL/brønd af 4 µM løsningen af TTX fra trin 2.3. Sted mikrotiterplade i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 4 timer.
  5. Fastgør et sterilt glas Pasteur afpipetteres til en Sugeledningen og fastgør et sterilt 200 µL pipette ende på spidsen af en pipette. Fjerne medier fra hver godt omhyggeligt. Undgå at røre bunden af mikrotiterplade hvor neuroner er placeret.
  6. Tilføje 200 µL af stuetemperatur neuronal medier til hver brønd.
  7. Inkuber mikrotiterplade ved stuetemperatur, 15 min. inkubation i 5% CO2 er foretrukne, men ikke nødvendigt.

3. Immunolabelling (i Laminar Flow Hood)

  1. Forberede en 1:150 fortynding af anti-GluA1 eller anti-GluA2-antistof i neuronal medier.
  2. Fjerne neuronal medierne tilføjede i trin 2.6. Tilføje 50 µL af anti-GluA1 eller anti-GluA2 antistof løsningerne til tilsvarende brønde i 20 min. ved stuetemperatur til at tillade antistof bindende. Tilføje 50 µL af neuronal medier til sekundær antistof eneste kontrolhullerne.
  3. Fjerne antistof løsninger tilføjede taktfast 3.2. Vask mikrotiterplade 3 gange med 100 µL/brønd stuetemperatur neuronal medier til at fjerne enhver ubundne antistoffer.
  4. Gøre en 50 mM stamopløsning af DHPG i neuronal medier eller celle kultur grade vand. Vortex løsning kort til fuldt opløses i DHPG. Forberede denne løsning frisk på den samme dag i eksperimentet. Undgå at bruge gamle eller optøede løsninger.
  5. Fortynd stamopløsning i neuronal medier til 1: 500 til at gøre en 100 µM løsning.
  6. Fjern den eksisterende medier fra hver brønd. Tilføj 100 µL/brønd af 100 µM DHPG stamopløsningen fra trin 3.5. Inkuber mikrotiterplade i varmeskab ved 37 ° C i 5% CO2 til 10 min.
  7. Fjern den DHPG løsning tilføjede taktfast 3.6 og tilsæt 100 µL/brønd neuronal medier. Gentag dette trin en gang mere. Sted mikrotiterplade i varmeskab ved 37 ° C i 5% CO2 i 5 min.
  8. Tilføje saccharose for at gøre 4% paraformaldehyde/4% rørsukkeropløsning i PBS på den samme dag i eksperimentet. Undgå at bruge gamle eller optøede løsninger. Fjerne medierne tilføjede taktfast 3.7. Tilsæt 100 µL/brønd af 4% paraformaldehyde/4% rørsukkeropløsning. Gentag trin 3.6-3,8 for hvert yderligere tidspunkt. Når du er færdig, Ruger mikrotiterplade ved 4 ° C i 20 min.
    Forsigtighed: Håndtere PARAFORMALDEHYD bestande i et stinkskab.
  9. Fjern fiksativ fra trin 3.8 og tilsæt 100 µL/brønd af kolde 1 x DPBS.
  10. Fjern DPBS. Tilføj 150 µL/brønd blokerende buffer (en klar-til-brug formulering i TBS, henvises til Tabel af materialer) og der inkuberes ved stuetemperatur i 90 min. Alternativt, inkuberes natten over ved 4 ° C.

4. mærkning overflade receptorer

  1. Forberede en 1:1500 fortynding af 680RD gede anti-mus IgG sekundær antistof i blokerende buffer.
  2. Fjern blokerende buffer fra trin 3.10. Tilsæt 50 µL/brønd af sekundær antistof løsning og inkuberes ved stuetemperatur for 60 min. hold mikrotiterplade beskyttet mod lys, når de sekundære antistoffer er tilføjet. Sørg for at fortsætte med at beskytte mikrotiterplade fra lys under efterfølgende inkubationer.
  3. Fjerne løsningen fra trin 4.2. Tilsæt 100 µL/brønd TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) og inkuberes ved stuetemperatur for 5 min. Gentag dette trin 4 flere gange.
  4. Fjern TBS fra trin 4.3. Tilsæt 100 µL/brønd af 4% paraformaldehyde/4% saccharose i PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
  5. Fjerne løsningen fra trin 4.4. Tilsæt 100 µL/brønd TBS og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Gentag dette trin 2 flere gange.

5. mærkning befolkningens internaliseret Receptor

  1. Forberede TBS indeholdende 0,2% saponin. Vortex løsning kort til fuldt saponin pulveret opløses. Filtrer løsning ved hjælp af en 0,2 µm filter til at fjerne eventuelle partikler, der kan forårsage auto-fluorescens.
  2. Tilsæt 150 µL TBS indeholdende 0,2% saponin og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
  3. Fjern saponin løsning fra trin 5.2 og tilsæt 150 µL/brønd blokerende buffer. Inkuber ved stuetemperatur i 90 min.
  4. Forberede en 1:1500 fortynding af 800CW Donkey anti-mus IgG sekundær antistof i blokerende buffer.
  5. Fjern blokerende buffer fra trin 5.3 og tilsæt 50 µL/brønd af sekundær antistof løsning. Inkuber ved stuetemperatur i 60 min.
  6. Tilsæt 100 µL/brønd TBS og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Gentag dette trin 4 flere gange.

6. billedbehandling og analyse

  1. Billede 96-brønd mikrotiterplade ved hjælp af en infrarød laser imaging system ifølge producentens anvisninger. Angiv scanningsopløsning til 84 µm, scanningskvaliteten til medium og fokus offset ifølge base højden på den 96-brønd mikrotiterplade anvendes. Klik på "Billede Studio" menu knappen → Eksporter → billede for digitale medier → Eksporter billeder med en opløsning på 300 dpi, i TIFF-format.
  2. Download billede Jørgensen "Fiji" på https://imagej.net/Fiji/Downloads
  3. Åbn billede i billede J "Fiji". Split farvekanaler ved at klikke på menuen "Billede"
    → Split farvekanaler.
  4. Åbn ROI manager fra "Analysere" → "værktøjer". Afkrydsningsfeltet "etiketter" i ROI manager til at mærke cirklerne med tallene.
  5. I røde kanal (den 680 nm overflade receptor pool), Vælg Region af interesse (ROI) ved at vælge værktøjet cirkel og tegne en cirkel, der præcist passer til den første brønd. Tryk på Ctrl + T.
  6. Trække cirklen til næste godt og tryk på Ctrl + T. Repeat, indtil alle brønde er kredsede.
  7. Fra ROI manager, skal du klikke på "Foranstaltning". Vælg de værdier, der vises og kopiere dem til et regneark.
  8. Klik på den grønne kanal (den 800 nm interne receptor pool) og derefter omsætte de valgte ROIs fra trin 6.6 til billedet. Fra ROI manager, skal du klikke på "Foranstaltning". Vælg de værdier, der vises og kopiere dem til et regneark.
  9. Beregning af de gennemsnitlige integreret tæthedsværdier fra sekundært kun styre brønde. Fratræk de integrerede tæthedsværdier for hver eksperimentelle brønd fra gennemsnitlige sekundær kun integreret tæthed kontrolværdierne for overflade receptor pool. Gentag dette trin for interne receptor pool.
  10. Beregne ændringerne i overfladen receptor udtryk ved hjælp af Rs/rt, hvor Rs repræsenterer den integrerede tæthed af overflade receptorer og Rt repræsenterer den integrerede tæthed af overflade receptorer + integreret tætheden af interne receptorer.

Representative Results

ARC/Arg3.1 accelererer AMPA-receptoren endocytose gennem interaktion med AP-2, endophilin-3 og dynamin-216,18 efter mGluR aktivering37. I Arc knock-i mus (ArcKR), er lysines 268 og 269 i Arc protein muteret til arginin, som forstyrrer Arc ubiquitination. Dette forringer proteasom-afhængige omsætning af Arc og forlænger dens halveringstid i neuroner21,30. I dette eksperiment, blev persistens af Arc i reguleringen af AMPA receptor handel undersøgt ved hjælp af high-indhold AMPA-receptoren menneskehandel assay. Neuroner blev behandlet med Na+ kanal blokker TTX, som hæmmer handling potentialer og reducerer Arc niveauer38, efterfulgt af DHPG, som inducerer Arc oversættelse og ubiquitination37,39. Både overflade og internaliseret puljer af GluA1 - (figur 2A) og GluA2-holdige (figur 3A) AMPA-receptoren underenheder blev målt ved 5 og 15 min. efter DHPG nedtonet. Denne særlige eksperiment anvendes tre tekniske replikater af 3 uafhængige forsøg. ArcKR neuroner viste øget GluA1 endocytose når behandlet med DHPG i forhold til WT neuroner, en effekt, der ikke blev set når neuroner blev behandlet med TTX kun (figur 2B). Overflade udtryk af GluA2 subunits øgedes betydeligt på kort tid point i forhold til WT neuroner (figur 3B), der angiver en potentiel subunit udskiftning30. Nogle brønde blev behandlet med sekundære antistoffer kun til kontrol for baggrunden fluorescens forårsaget af uspecifik bindende.

Figure 1
Figur 1: sammenligning af AMPA-receptoren high-indhold menneskehandel analysen til receptor biotinylation assay. High-indhold menneskehandel assay forbruger mindre tid og ressourcer i forhold til standard biotinylation assayet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: overflade og indre populationer af GluA1 AMPA-receptoren underenheder i WT og ArcKR hippocampus neuroner. (A) overflade (sGluA1) og internaliseret (iGluA1) GluA1-holdige AMPA-receptoren underenheder i WT og ArcKR hippocampus neuroner ved 5 og 15 min. efter DHPG nedtonet. I forhold til WT, har ArcKR neuroner et yderligere fald i sGluA1-holdige AMPA-receptoren pool 5 og 15 min. efter DHPG nedtonet. (B) graf repræsenterer overflade fluorescens normaliseret samlede fluorescens-intensiteten. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af en en-vejs ANOVA, parrede og uparrede Student's t tests. p ≤ 0,05; n = 3 tekniske replikater af 3 uafhængige forsøg. Værdierne repræsenterer gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra mur, M. J. et al. 201830. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: overflade og indre populationer af GluA2 AMPA-receptoren underenheder i WT og ArcKR hippocampus neuroner. (A) den samme eksperimentelle tilstand som figur 2. I forhold til WT, har ArcKR neuroner en stigning i sGluA2-holdige AMPA-receptoren pool 5 min efter DHPG nedtonet. (B) graf repræsenterer overflade fluorescens normaliseret samlede fluorescens-intensiteten. Statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA, parrede og uparrede Student's t tests. p ≤ 0,05; n = 3 tekniske replikater af 3 uafhængige forsøg. Værdierne repræsenterer gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra mur, M. J. et al. 201830. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

AMPA-receptorer er en ionotropic glutamat receptor subtype, som er en integreret del af neuronal funktioner, som omfatter synapse dannelse, synapse stabilitet og synaptisk plasticitet. AMPA-receptoren forstyrrelser er knyttet til flere neurologiske24 og anses for attraktive drug mål40. For eksempel, har undersøgelser vist, at en af de tidligste tegn på Alzheimers sygdom (AD) er synapse tab og reduceret synaptic AMPA-receptoren niveauer41,42. Intriguingly, svækker tilsætning af Amyloid-ß oligomerer overfladen GluA1-holdige AMPA receptor udtryk på synapser43. Yderligere, status epilepticus ned-regulerer GluA2 mRNA og protein i hippocampus neuroner forud for deres død44. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), TAR DNA-bindende protein (TDP-43) patologi, en ALS-specifikke molekylære abnormitet, har været knyttet til ineffektive GluA2 Q/R site-RNA redigering45.

High-indhold AMPA-receptoren menneskehandel analysen giver et effektivt middel til at måle bulk ændringer i receptor menneskehandel profiler inden for et neuronal netværk som svar på forskellige faktorer, indtager meget mindre tid og materialer end alternative metoder. En enkelt 96-brønd mikrotiterplade giver mange brønde til at køre flere tekniske replikater og styrer for forskellige eksperimentelle betingelser i den samme plade. Lav plating tætheden af 2 x 104 celler/brønd i forhold til 5 x 105 celler/brønd tæthed reducerer antallet af dyr og materialeudgiften til hvert eksperiment (figur 1). Den infrarøde scanner kan billedet op til seks 96-brønd mikroplader ad gangen. Analysen kan også ændres til en 384-godt mikrotiterplade46, som bliver specielt værdifulde, hvis analysen er kørt på dyrebare prøver, der er vanskelige at opnå eller er dyre at kultur (fx menneskelige prøver og inducerede pluripotente stamceller). Hele analysen kan udfyldes og analyseret på samme dag, som sparer værdifuld tid (figur 1).

Nogle punkter skal anses for vellykket og effektiv gennemførelse af analysen. For det første er det vigtigt at forberede DHPG løsningen på den samme dag af neuron behandling. Undlad at genbruge eller fryse DHPG bestande. 4% paraformaldehyde/4% saccharose i PBS løsning bør også gøres frisk på den samme dag i eksperimentet. For det andet kontrolhullerne behandlet med TTX kun eller køretøjet er forpligtet til at sikre, at de observerede virkninger er bestemt til behandling. Det er også afgørende at omfatte wells behandlet med kun de sekundære antistoffer til kontrol for baggrunden fluorescens produceret af ikke-specifik binding. Bemærk, at det andet fiksering trin (følgende udvaskning af sekundære antistoffer) er nøglen til at reducere sekundær antistof baggrundseffekter og opnå effektiv mærkning af receptor underenheder.

Kompromiser og begrænsninger, som med enhver metode, der findes. Denne analyse giver ikke én celle (eller subcellulært) opløsning og giver ikke mulighed for real-time tracking af receptor handel ligesom andre metoder32,33,35. Derudover skal ordentlig pleje tages under trinnet permeabilization af neuroner, som denne metode vil være følsomme over for udsivning af intracellulære komponenter for overdreven permeabilization.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Zachary Allen for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Whitehall Foundation (Grant 2017-05-35) og Joes C. Arrington forskning indledning Grant Program (RIG-93) A.M.M. M.A.G. og D.W.Y. blev begge støttet af en Georgia State University Neurogenomics 2CI Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
  2. Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. Wiley. (1949).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369, (1633), 20130288 (2014).
  4. Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5, (12), 952-962 (2004).
  5. Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58, (4), 472-497 (2008).
  6. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22, (3), 461-469 (2012).
  7. Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11, (4), 457-466 (2008).
  8. Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, (3), 535-548 (2008).
  9. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141, (3), 524-535 (2010).
  10. Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10, (10), 0140868 (2015).
  11. Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544, (7650), 316-321 (2017).
  12. Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77, (3), 542-558 (2013).
  13. Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (42), E5744-E5752 (2015).
  14. Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73, (2), 260-267 (2012).
  15. Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28, (46), 11760-11767 (2008).
  16. Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52, (3), 445-459 (2006).
  17. Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19, (3), 319-326 (2009).
  18. Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
  19. DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2, (3), (2016).
  20. Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (24), 14112-14117 (1999).
  21. Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82, (6), 1299-1316 (2014).
  22. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, (2), 511-525 (2000).
  23. Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63, (1), 92-105 (2009).
  24. Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17, (6), 337-350 (2016).
  25. Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287, (5461), 2262-2267 (2000).
  26. Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (15), 3948-3953 (2018).
  27. Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43, (2), 221-236 (2004).
  28. Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40, (4), 763-774 (2003).
  29. Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67, (1), 11-19 (1991).
  30. Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98, (6), 1124-1132 (2018).
  31. Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17, (19), 7351-7358 (1997).
  32. Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284, (5421), 1811-1816 (1999).
  33. Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18, (3), 402-407 (2015).
  34. Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
  35. Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27, (5), 257-261 (2004).
  36. Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
  37. Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59, (1), 84-97 (2008).
  38. Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52, (3), 475-484 (2006).
  39. Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. (2015).
  40. Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35, (12), 1908-1916 (2012).
  41. Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52, (5), 831-843 (2006).
  42. DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27, (5), 457-464 (1990).
  43. Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284, (16), 10639-10649 (2009).
  44. Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (7), 3631-3636 (2000).
  45. Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
  46. Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481, (7380), 185-189 (2011).
En høj-indhold analysen til overvågning af AMPA Receptor handel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter