Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En høyt innhold analysen for overvåking AMPA reseptor menneskehandel

Published: January 28, 2019 doi: 10.3791/59048
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Neuroscience Institute, Georgia State University
* These authors contributed equally

Summary

Neuronal excitability kan være modulert gjennom en dynamisk prosess endo- og exocytosis av eksitatoriske ionotropic glutamat reseptorer. Beskrevet her er tilgjengelig, høyt innhold analysen for kvantifisering overflate og interne reseptor befolkningen bassenger.

Abstract

Postsynaptic smugling av reseptorer til og fra celleoverflaten er en viktig mekanisme som neurons modulerer deres respons på ulike stimuli. De α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA)-reseptorene, som er ansvarlig for rask eksitatoriske synaptic overføring i nerveceller, smugles til og fra postsynaptic overflaten til å dynamisk endre neuronal excitability. AMPA reseptor handel er avgjørende for synaptiske plastisitet og kan bli forstyrret i nevrologisk sykdom. Imidlertid utbredt metoder for kvantifisering reseptor menneskehandel ignorere hele reseptor bassenger, er altfor tid - og arbeidskrevende, eller potensielt forstyrre normal menneskehandel mekanismer og derfor komplisere tolkningen av resultatdataene. Vi presenterer en høyt innhold analysen for kvantifisering av både overflate og interne AMPA reseptor bestander i kulturperler primære hippocampus neurons bruker dobbel fluorescerende immunolabeling og en nær-infrarøde fluorescerende 96-brønnen microplate skanner. Denne tilnærmingen muliggjør rask screening av bulk internalisert og overflaten reseptor tettheter samtidig minimere utvalget materialet. Vår metode har imidlertid begrensninger i å skaffe encellede oppløsning eller gjennomføre levende celle bildebehandling. Til slutt kan denne protokollen være mottakelig for andre reseptorer og ulike celletyper, forutsatt riktig justeringer og optimalisering.

Introduction

Størrelsen og tidsmessige dynamikken i neuronal excitability er i stor grad avhengig av tilgjengelighet og sammensetningen av overflaten reseptor populasjoner som transduce elektrokjemiske signal. Mens syntese av ny reseptorer (eller reseptor underenheter) er vanligvis en relativt langvarige og energisk dyrt prosess, en rekke cellulære maskiner dedikert til endo- og exocytosis av eksisterende reseptorer sørge for sine raskt innsetting og flytting til og fra membranen1. Derfor, i tillegg til transcriptional og translasjonsforskning regulering av reseptorer, posttranslational reseptor menneskehandel er en viktig modulator av neuronal excitability.

Synaptiske plastisitet, eller endre styrken av forbindelser mellom neurons med erfaring, antas å danne grunnlaget for læring og hukommelse2,3. Styrke og svekkelse av synapser over tid, kalles langsiktige potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD), henholdsvis kan være modulert via smugling av α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) reseptorer 4 , 5. AMPA reseptorer er heterotetramers består av fire underenheter (GluA1-4), og formidle fleste fort eksitatoriske synaptic overføring i hjernen6. Dermed er Nevron excitability i stor grad en funksjon av antallet AMPA reseptorer på postsynaptic overflaten tilgjengelig aktiveres av glutamat. LTD er vanligvis forbundet med en økning i AMPA reseptor endocytose, mens LTP er hovedsakelig knyttet til en økning i AMPA reseptor exocytosis. Postsynaptic overflate uttrykk for AMPA reseptorer krever endosomal levering til exocytotic proteiner, der sammensmelting med plasma membranen deretter oppstår i en kalsium-avhengig måte7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. det finnes også en rekke mekanismer som regulerer aktiviteten avhengig AMPA reseptor endocytose. Et eksempel på dette er via umiddelbar tidlig genet Arc/Arg3.1 (Arc). Blant andre funksjoner15, Arc er kjent for å megle metabotropic glutamat reseptor (mGluR)-avhengige LTD ved å fremme AMPA reseptor endocytose gjennom sin binding partnere, som inkluderer endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 og dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, på clathrin-belagt groper20,21. Internalisert AMPA reseptorer kan enten resirkulert tilbake til plasma membranen eller øremerket fornedrelse22,23.

Viktigere, bidrar delenhet sammensetningen av AMPA reseptorer til deres menneskehandel dynamics24. Av stor relevans er intracellulær C-terminalen domenet til underenheter, hvor fleste posttranslational modifikasjoner og handel-relaterte protein interaksjoner skje. GluA1 og GluA4 delenhet inneholder AMPA reseptorer er spesielt passende til som smugles til celleoverflaten under LTP, delvis på grunn av deres PDZ ligander, ~ 90 amino acid sekvenser som fremmer membran forankring via interaksjon med ulike PDZ domenet inneholder proteiner25,26. På den annen side, pleier AMPA reseptorer som inneholder GluA2 og mangler GluA1 eller GluA4 å være trafikkerte constitutively men samle intracellulært med synaptic aktivitet27. GluA2 underenheter gjennomgå RNA redigering, i tillegg til fremme oppbevaring i det endoplasmatiske retikulum28, gjengir kanal pore ugjennomtrengelig kalsium29, ytterligere implicating delenhet-spesifikke smugling som en viktig formidler av neuronal homeostasis og plastisitet. Interessant, har avbrudd i ubiquitin-avhengige Arc fornedrelse vist seg å øke GluA1 endocytose og øke overflaten uttrykk for GluA2 delenhet inneholder AMPA reseptorer etter induksjon av mGluR-LTD med selektiv gruppe I mGluR Agonistiske (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), som angir at mye er fortsatt for å lære om mekanismer og rollen som delenhet-spesifikke AMPA reseptor menneskehandel30.

Metoder for å observere endringer i overflaten uttrykk av reseptorer er ofte tungvint, tidkrevende, eller introdusere unødvendige forundrer. Biotin-baserte analyser er en gjennomgripende og kommersielt tilgjengelig tilnærming. Affinitet rensing biotinylated overflate reseptorer representerer et slikt eksempel, men nødvendigheten av å utføre geleelektroforese krever en stor mengde utvalget materialet og kan gjengi screening av flere behandlinger en uoverkommelig lengre behandle31. Utvidelser av denne analysen, der flere tidspunkt med merking og immunoprecipitations utføres for å kvantifisere gradvis nedbrytning av et innledende signal, tilsvarende forsømmelse tillegg av ny- eller resirkulert-reseptorer til cellen overflaten og bare forverre tid og materielle krav.

Andre tilnærminger gjør bruk av chimeric konstruksjoner eller tillegg av fluorescerende koder å observere reseptor menneskehandel32, noen ganger bruke live celle tenkelig33,34. Mens potensielt mektig, kan designene påvirke normale menneskehandel mønstre av reseptorer på grunn av mutasjoner eller dramatiske endringer i molekylvekt introdusert i disse proteinene. Bruk av fargestoffer at etiketten subcellular avdelinger av målretting lav pH34,35 er uspesifikke og skille mellom forskjellige intracellulær rom viktig for reseptor menneskehandel (f.eks. lysosomer og proteasomes) vanskelig. Til slutt, bruk av AC confocal mikroskopi å visualisere colocalization av reseptorer med markører knyttet til handel og fornedrelse, for eksempel endosomal proteiner eller clathrin, mens å gi nyttig innsikt i bestemte lokalisering med subcellular oppløsning, er tid, arbeidskrevende og dyrt på grunn av nødvendigheten av individuelt analysere hver celle og kravet til AC confocal eller super-oppløsning mikroskopi.

Her viser vi en høyt innhold reseptor menneskehandel analysen som er kompatibel med primære neuronal kultur forberedelser30. Denne metoden merker separat overflate og intracellulær reseptor bassengene fast neurons, slik at presentasjonen av data som et forhold mellom normalisert overflaten eller internalisert reseptor tetthet til den samlede tettheten for at reseptor. Høyt innhold natur denne metoden er ideell for screening flere behandlinger og/eller genotyper i et kort tidsrom, og krever kun celle dyrking og antistoff inkubasjon kompetanse.

Kort, primære neurons er dyrket i standard 96-brønnen microplates og deretter behandlet som diktert av eksperimentell design, inkubert med primære antistoffer, vasket og fast. Celler er deretter inkubert med en sekundær antistoff merke overflate reseptorer, etterfulgt av en annen fiksering trinn. Permeabilization deretter oppstår og en andre sekundære antistoff brukes til å navngi interne reseptor bassenger. Endelig er celler fotografert ved hjelp av en infrarød fluorescerende microplate skanner for å kvantifisere integrert tettheten av hver reseptor befolkningen. Figur 1 oppsummerer analysen vår høyt innhold i forhold til en tradisjonell biotinylation analysen.

Mens protokollen tilbys her er optimalisert og spesifikke for AMPA reseptor menneskehandel primære hippocampus Nevron kulturer, bli denne prosedyren kan, i teorien, utvidet og tilpasset ulike reseptorer i forskjellige celletyper.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Georgia State University.

1. forberedelse av primære hippocampus nerveceller (i laminær strømning Hood)

  1. Isolere primære hippocampus neurons fra blandet sex postnatal dag (P) 0-1 mus som tidligere beskrevet36.
  2. Plate nerveceller i 96-brønnen poly-D-lysine belagt microplates på en tetthet av 2 x 104 celler per brønn.
  3. Forberede medier fôring neurons ved å legge 10 mL av 50 x B-27, 5 mL av 100 x glutamin, 242 µL av 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) og 10 µL av 10 mg/mL Gentamycin til 485 mL neuronal media (se Tabell for materiale).
  4. Feed nerveceller som tidligere beskrevet36 ved å fjerne halvparten (100 µL) av eksisterende media (referert til som betinget media, som inneholder bestanddeler som støtter neuronal overlevelse) fra hver brønn og erstatte med 100 µL av 37 ° C prewarmed media utarbeidet i trinn 1.3 hver 3-4 dager. Lagre betinget media fra hver fôring på 4 ˚c høyere trinn 2.3.

2. måle AMPA reseptor menneskehandel som svar på DHPG (i laminær strømning Hood)

  1. På dagen i Vitro (DIV) 14, forberede en 500 µL lagerløsning av Tetrodotoxin (TTX) i en konsentrasjon av 2 mM bruker cellekultur klasse vann.
    Forsiktig: TTX er en neurotoxin. Håndtaket forsiktig og unngå hudkontakt.
  2. Bruke en flerkanals pipette, fjerne 100 µL fra hver brønn i 96-brønnen microplate av neurons og basseng media.
  3. Legge til 2 µL av TTX lager løsning 1 mL av grupperte betinget media fra trinn 2.2 å lage en 4 µM løsning av TTX. Hvis det ikke er nok gruppert betinget media, deretter bruke noen av de lagrede betinget mediene fra trinn 1.4.
  4. Behandle neurons med 100 µL/vel av 4 µM løsningen av TTX fra trinn 2.3. Sett microplate i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C 4 h.
  5. Knytte et sterilt glass Pasteur Pipetter til sugekraft linje og legge en steril 200 µL pipette slutt til spissen av pipette. Fjern utskriftsmaterialet fra hver også nøye. Unngå å berøre bunnen av microplate hvor neurons er plassert.
  6. Legge til 200 µL romtemperatur neuronal medier i hver brønn.
  7. Inkuber microplate ved romtemperatur for 15 min. inkubasjon 5% CO2 er foretrukket, men ikke nødvendig.

3. Immunolabelling (i laminær strømning Hood)

  1. Klargjør en 1:150 fortynning av anti-GluA1 eller anti-GluA2 antistoffer i neuronal medier.
  2. Fjerne neuronal media lagt til i trinn 2.6. Legge til 50 µL av anti-GluA1 eller anti-GluA2 antistoff løsninger tilsvarende brønner for 20 min ved romtemperatur å tillate antistoff binding. Legge til 50 µL av neuronal media sekundære antistoff bare kontroll brønnene.
  3. Fjerne antistoff løsningene la til i trinn 3.2. Vask microplate 3 ganger med 100 µL/vel romtemperatur neuronal media å fjerne en ubundet antistoffer.
  4. Foreta en 50 mM lager løsning av DHPG i neuronal media eller celle kultur klasse vann. Vortex løsningen kort for å fullstendig løse opp DHPG. Klargjør denne løsning frisk på samme dag av eksperimentet. Unngå å bruke gamle eller tinte løsninger.
  5. Fortynne lager løsningen i neuronal medier til 1:500 å lage en 100 µM løsning.
  6. Fjern eksisterende media fra hver brønn. Legge til 100 µL/vel 100 µM DHPG lager løsningen fra trinn 3.5. Inkuber microplate i kuvøse på 37 ° C i 5% CO2 i 10 min.
  7. Fjern DHPG løsningen la til i trinn 3.6 og legge 100 µL/vel neuronal media. Gjenta dette trinnet en gang. Plasser microplate i kuvøse på 37 ° C i 5% CO2 i 5 min.
  8. Legg sukrose å gjøre 4% paraformaldehyde/4% sucrose løsning i PBS på samme dag av eksperimentet. Unngå å bruke gamle eller tinte løsninger. Fjern mediene la til i trinn 3.7. Legg 100 µL/godt av 4% paraformaldehyde/4% sucrose løsning. Gjenta trinn 3.6-3.8 for hver ekstra tidspunkt. Når fullført, ruge microplate på 4 ° C for 20 min.
    Forsiktig: Håndtere paraformaldehyde aksjer i avtrekksvifte.
  9. Fjern bindemiddel fra trinn 3.8 og tilsett 100 µL/godt av kaldt 1 x DPBS.
  10. Fjern DPBS. Legge til 150 µL/vel blokkerer buffer (klar til bruk formulering i SS, se Tabellen for materiale) og ruge ved romtemperatur for 90 min. Alternativt, ruge over natten på 4 ° C.

4. merking overflate reseptorer

  1. Klargjør en 1:1500 fortynning av 680RD geit anti-musen IgG sekundære antistoffer blokkere buffer.
  2. Fjerne blokkering buffer fra trinn 3.10. Legg til 50 µL/vel av sekundær antistoff løsningen og ruge ved romtemperatur for 60 min. holde microplate beskyttet fra lys når sekundær antistoffer er lagt. Sørg for å beskytte microplate fra lys under påfølgende incubations.
  3. Fjerne løsningen fra trinn 4.2. Legg 100 µL/vel TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6) og ruge ved romtemperatur for 5 min. Gjenta dette trinnet 4 ganger.
  4. Fjerne TBS fra trinn 4.3. Legg 100 µL/vel av 4% paraformaldehyde/4% sukrose i PBS og ruge ved romtemperatur i 15 min.
  5. Fjerne løsningen fra trinn 4.4. Legg 100 µL/vel TBS og ruge ved romtemperatur for 5 min. Gjenta dette trinnet 2 ganger.

5. merking befolkningen internalisert reseptor

  1. Forberede TBS inneholder 0,2% saponin. Vortex løsningen kort for å fullstendig løse opp pulveret saponin. Filtrere løsningen ved å benytte et 0,2 µm filter fjerner partikler som kan auto-fluorescens.
  2. Legge til 150 µL TBS inneholder 0,2% saponin og ruge ved romtemperatur i 15 min.
  3. Fjern saponin løsning fra trinn 5.2 og legge 150 µL/vel blokkerer buffer. Inkuber ved romtemperatur for 90 min.
  4. Klargjør en 1:1500 fortynning av 800CW esel anti-musen IgG sekundære antistoffer blokkere buffer.
  5. Fjern blokkering buffer fra trinn 5.3 og legge 50 µL/vel av sekundær antistoff løsningen. Inkuber ved romtemperatur for 60 min.
  6. Legg 100 µL/vel TBS og ruge ved romtemperatur for 5 min. Gjenta dette trinnet 4 ganger.

6. bildebehandling og analyse

  1. Bildet i 96-brønnen microplate ved hjelp av en infrarød laser imaging i henhold til produsentens instruksjoner. Angi skanneoppløsningen 84 µm, skannekvaliteten medium og fokus motposteres i samsvar med base høyden på 96-brønnen microplate brukes. Klikk på "Bilde Studio" meny-knappen → eksportere → bilde for digitale medier → eksport bilder med en oppløsning på 300 dpi, i TIFF-format.
  2. Last ned bilde J "Fiji" på https://imagej.net/Fiji/Downloads
  3. Åpne bilde i bilde J "Fiji". Dele fargekanaler ved å klikke på "Bilde"-menyen
    → Split fargekanaler.
  4. Åpne ROI manager fra "Analysere" → "verktøy". Merk av for "Merkelapper" i Avkastningen manager Merk sirkler med tall.
  5. I rødt kanal (680 nm overflaten reseptor bassenget), Velg Region av interesse (ROI) ved å velge sirkelverktøyet og tegne en sirkel som passer nøyaktig den første brønnen. Trykk Ctrl + T.
  6. Dra sirkelen til neste godt og trykk Ctrl + T. Gjenta til alle brønnene er sirklet.
  7. ROI manager, klikk "Tiltak". Velg verdiene som vises, og kopiere dem til et regneark.
  8. Klikk på den grønne kanalen (800 nm interne reseptor bassenget) og deretter transponere de valgte ROIs fra trinn 6.6 til bildet. ROI manager, klikk "Tiltak". Velg verdiene som vises, og kopiere dem til et regneark.
  9. Beregne gjennomsnittlig integrert tetthet verdiene fra sekundære bare kontrollere brønner. Trekke integrert tetthet verdiene for hver eksperimentelle godt fra sekundær bare kontroll integrert tetthet gjennomsnittsverdiene for overflate reseptor bassenget. Gjenta dette trinnet for interne reseptor bassenget.
  10. Beregne endringer i overflaten reseptor uttrykk bruker Rs/rt, der Rs representerer integrert tetthet overflate reseptorer og Rt representerer integrert tetthet overflate reseptorer + integrert tetthet intern reseptorer.

Representative Results

Arc/Arg3.1 akselererer AMPA reseptor endocytose gjennom samspill med AP-2, endophilin-3 og dynamin-216,18 etter mGluR aktivisering37. I Arc banke i musen (ArcKR), er lysines 268 og 269 i Arc protein mutert til arginin, som forstyrrer Arc ubiquitination. Dette svekker proteasome-avhengige omsetning på Arc forlenger halveringstiden i neurons21,30. I dette eksperimentet, ble utholdenhet bue i å regulere AMPA reseptor handel undersøkt med høyt innhold AMPA reseptor menneskehandel analysen. Neurons ble behandlet med Na+ kanal blokker TTX, som hemmer handling potensialer og reduserer Arc nivå38, etterfulgt av DHPG, som induserer Arc oversettelse og ubiquitination37,39. Både overflaten og internalisert bassenger av GluA1 - (figur 2A) og inneholder (figur 3A) GluA2 AMPA reseptor underenheter ble målt 5 og 15 minutter etter DHPG bleke. Dette bestemte eksperimentet brukt tre tekniske gjentak fra 3 uavhengige eksperimenter. ArcKR neurons viste økt GluA1 endocytose når behandlet med DHPG forhold til WT neurons, en effekt som ikke ble sett når neurons ble behandlet med TTX bare (figur 2B). Overflaten uttrykk for GluA2 tenkes betydelig økt på kort tid poeng sammenlignet WT neurons (figur 3B), som indikerer en potensiell delenhet erstatning30. Noen brønner ble behandlet med sekundær antistoffer bare å kontrollere til bakgrunnen fluorescens skyldes uspesifikke bindende.

Figure 1
Figur 1: sammenligning av AMPA reseptor høyt innhold menneskehandel analysen til reseptoren biotinylation analysen. Høyt innhold menneskehandel analysen forbruker mindre tid og ressurser i forhold til standard biotinylation analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: overflate og interne bestander av GluA1 AMPA reseptor underenheter i WT og ArcKR hippocampus neurons. (A) overflate (sGluA1) og internalisert (iGluA1) GluA1 inneholder AMPA reseptor underenheter i WT og ArcKR hippocampus neurons 5 og 15 minutter etter DHPG bleke. Sammenlignet med WT, har ArcKR neurons en ytterligere nedgang i sGluA1 inneholder AMPA reseptor bassenget 5 og 15 min etter DHPG bleke. (B) grafen representerer overflaten fluorescens normalisert til totalt fluorescens intensitet. Statistiske sammenligninger ble utført med en enveis ANOVA, sammenkoblet og kort Student t tester. p ≤ 0,05; n = 3 teknisk gjentak fra 3 uavhengige eksperimenter. Verdiene representerer gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet er endret fra veggen, M. J. et al. 201830. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: overflate og interne bestander av GluA2 AMPA reseptor underenheter i WT og ArcKR hippocampus neurons. (A) den samme eksperimentelle tilstanden som figur 2. Sammenlignet med WT, har ArcKR neurons en økning i sGluA2 inneholder AMPA reseptor bassenget 5 min etter DHPG bleke. (B) grafen representerer overflaten fluorescens normalisert til totalt fluorescens intensitet. Statistiske sammenligninger ble utført med enveis ANOVA, sammenkoblet og kort Student t tester. p ≤ 0,05; n = 3 teknisk gjentak fra 3 uavhengige eksperimenter. Verdiene representerer gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet er endret fra veggen, M. J. et al. 201830. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

AMPA reseptorer er en ionotropic glutamat reseptor undertype som er integrert for neuronal funksjoner inkluderer synapse formasjon, synapse stabilitet og synaptiske plastisitet. AMPA reseptor avbrudd er koblet til flere nevrologiske lidelser24 og betraktes attraktive narkotika mål40. For eksempel har studier vist at en av de tidligste tegnene på Alzheimers sykdom (AD) synapse tap og redusert synaptic AMPA reseptor nivåer41,42. Intriguingly, svekker tillegg av Amyloid-ß oligomers overflate GluA1 inneholder AMPA reseptor uttrykk synapser43. Videre regulerer status epilepticus ned-GluA2 mRNA og protein i hippocampus neurons før deres død44. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), TAR DNA-bindende protein (TDP-43) patologi, en ALS-spesifikke molekylær abnormitet, har vært knyttet til ineffektiv GluA2 Q/R området-RNA redigering45.

Høyt innhold AMPA reseptor menneskehandel analysen gir et effektivt middel for å måle masseendringer i reseptor menneskehandel profiler innenfor et nevrale nettverk svar på ulike faktorer, forbruker mye mindre tid og materialer enn alternative metoder. En enkelt 96-brønnen microplate gir mange brønner for å kjøre flere tekniske replikerer og kontrollerer for ulike eksperimentelle forhold i samme plate. Lav plating tetthet 2 x 104 celler/godt i forhold til 5 x 105 celler/vel tetthet reduserer antall dyr og materialer kreves for hvert eksperiment (figur 1). Infrarød skanneren kan bildet opptil seks 96-brønnen microplates samtidig. Analysen kan også endres til en 384-vel microplate46, som blir spesielt verdifull hvis analysen kjøres på dyrebare prøver som er vanskelig å få eller er dyrt å kultur (f.eks menneskelige prøver og indusert pluripotent stamceller). Hele analysen kan fullført og analyseres på samme dag, som sparer verdifull tid (figur 1).

For vellykket og effektiv gjennomføring av analysen må noen punkter vurderes. Først er det viktig å forberede DHPG løsningen på samme dag av Nevron. Ikke gjenbruk eller fryse DHPG aksjer. 4% paraformaldehyde/4% sukrose i PBS løsning bør også gjøres frisk på samme dag av eksperimentet. Andre kontroll brønner behandlet med TTX bare eller kjøretøy er nødvendig å sikre at effektene observert er spesifikke for behandling. Det er også viktig med brønner behandlet med bare de sekundære Antistoffene mot kontroll for bakgrunnen fluorescens produsert av ikke-spesifikk bindende. Merk at andre fiksering trinn (følgende bleke av sekundær antistoffer) er nøkkelen til å redusere sekundære antistoff bakgrunn effekter og oppnå effektiv merking av reseptor underenheter.

Kompromisser og begrensninger, eksisterer som med enhver metode. Denne analysen gir ikke encellede (eller subcellular) og tillater ikke sanntidssporing reseptoren menneskehandel som andre metoder32,33,35. I tillegg må riktig omsorg tas under permeabilization trinnet av neurons, som denne metoden vil være følsomme for lekkasje av intracellular komponentene i over permeabilization.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Zachary Allen for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Whitehall Foundation (Grant 2017-05-35) og Cleon C. Arrington forskning innvielsen Grant Program (RIGG-93) å A.M.M. M.A.G. og D.W.Y. ble begge støttet av en Georgia State University Neurogenomics 2CI fellesskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
  2. Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. , Wiley. (1949).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369 (1633), 20130288 (2014).
  4. Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5 (12), 952-962 (2004).
  5. Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58 (4), 472-497 (2008).
  6. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  7. Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11 (4), 457-466 (2008).
  8. Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135 (3), 535-548 (2008).
  9. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141 (3), 524-535 (2010).
  10. Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10 (10), 0140868 (2015).
  11. Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544 (7650), 316-321 (2017).
  12. Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77 (3), 542-558 (2013).
  13. Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), E5744-E5752 (2015).
  14. Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  15. Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28 (46), 11760-11767 (2008).
  16. Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52 (3), 445-459 (2006).
  17. Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19 (3), 319-326 (2009).
  18. Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
  19. DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2 (3), (2016).
  20. Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (24), 14112-14117 (1999).
  21. Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82 (6), 1299-1316 (2014).
  22. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28 (2), 511-525 (2000).
  23. Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63 (1), 92-105 (2009).
  24. Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17 (6), 337-350 (2016).
  25. Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287 (5461), 2262-2267 (2000).
  26. Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), 3948-3953 (2018).
  27. Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43 (2), 221-236 (2004).
  28. Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40 (4), 763-774 (2003).
  29. Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67 (1), 11-19 (1991).
  30. Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98 (6), 1124-1132 (2018).
  31. Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7351-7358 (1997).
  32. Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284 (5421), 1811-1816 (1999).
  33. Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18 (3), 402-407 (2015).
  34. Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
  35. Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27 (5), 257-261 (2004).
  36. Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
  37. Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59 (1), 84-97 (2008).
  38. Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52 (3), 475-484 (2006).
  39. Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. , (2015).
  40. Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35 (12), 1908-1916 (2012).
  41. Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52 (5), 831-843 (2006).
  42. DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27 (5), 457-464 (1990).
  43. Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10639-10649 (2009).
  44. Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (7), 3631-3636 (2000).
  45. Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
  46. Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481 (7380), 185-189 (2011).

Tags

Nevrovitenskap problemet 143 menneskehandel AMPA reseptor synapse plastisitet internalisering endocytose exocytosis Arc glutamat
En høyt innhold analysen for overvåking AMPA reseptor menneskehandel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb,… More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter