Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Высоким содержанием пробирного контроля АМПА рецептор людьми

doi: 10.3791/59048 Published: January 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Возбудимость нейронов можно модулировать через динамический процесс эндо - и Экзоцитоз глутамата рецепторов возбуждающих ИОНОТРОПНЫХ. Описанные здесь является доступной, высоким содержанием assay для количественной оценки поверхностных и внутренних рецепторов населения бассейнов.

Abstract

Постсинаптических оборотом рецепторов от поверхности клетки и важный механизм, по которому нейроны модулировать их реагирования на различные стимулы. Α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА) рецепторы, которые отвечают за быстро возбуждающим синаптической передачи в нейронах, продают и от поверхности постсинаптических динамически изменять возбудимости нейронов. АМПА рецептор людьми необходим для синаптической пластичности и может быть нарушена в неврологических заболеваний. Однако, распространенных подходов для количественной оценки рецептор людьми игнорировать весь рецептор бассейны, являются чрезмерно время - и трудоемких, или потенциально нарушать обычные механизмы торговли и таким образом осложнить интерпретации полученных данных. Мы представляем высоким содержанием assay для количественной оценки населения, как поверхностных, так и внутренних рецепторов АМПА культивировали первичной гиппокампа нейронов, используя двойной флуоресцентный immunolabeling и ближней ИК люминесцентных 96-луночных микропланшетов сканера. Этот подход облегчает быстрое скрининг основную внутреннюю и поверхности рецептор плотности при сведении к минимуму образца материала. Однако наш метод имеет ограничения в получении одной ячейки резолюции или проведения живых клеток. Наконец этот протокол может поддаваться других рецепторов и различных типов клеток, условии надлежащей корректировки и оптимизации.

Introduction

Масштабы и временная динамика возбудимости нейронов в значительной степени зависит от доступности и состав поверхности рецептор популяций, которые передают электрохимических сигналов. Тогда как синтез новых рецепторов (или субъединиц рецептор) вообще энергетически дорогостоящих и сравнительно длительный процесс, множество клеточными посвященный эндо - и экзоцитоз существующих рецепторов предоставляют средства для их быстрой вставки и удаления и из мембраны1. Таким образом помимо транскрипционный анализ и трансляционная регуляции рецепторов, Посттрансляционная рецептор торговля является важным модулятор возбудимости нейронов.

Считается, что синаптической пластичности, или изменение прочности соединений между нейронами с опытом, основой обучения и памяти2,3. Усиление и ослабление синапсы с течением времени, называют долгосрочный потенцирование (LTP) и долгосрочные депрессии (LTD), соответственно, можно модулировать через торговлю α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА) рецепторы 4 , 5. АМПА рецепторы являются heterotetramers, состоящий из четырех подразделений (GluA1-4) и посредником большинство быстро возбуждающим синаптической передачи в мозг6. Таким образом в значительной степени возбудимости нейрона является функцией количество АМПА рецепторов на поверхности постсинаптических доступных активироваться глутамата. LTD является обычно ассоциируется с увеличением АМПА рецептор эндоцитоза, тогда как LTP преимущественно связана с увеличением АМПА рецептор экзоцитоз. Проявление АМПА рецепторов постсинаптической поверхности требует от англ доставки exocytotic белков, где слияние с плазматической мембраны затем происходит в манере кальций зависимых7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Существует также целый ряд механизмов, которые регулируют деятельность зависимых АМПА рецептор эндоцитоза. Одним из примеров этого является через немедленное раннего Джин дуги/Arg3.1 (Arc). Среди других функций15, дуги, как известно, быть посредником Метаботропные рецептор глутамата (mGluR)-зависимых LTD путем поощрения АМПА рецептор эндоцитоза через своих партнеров привязки, которые включают в себя endocytic белки AP-2, endophilin-3 и Динамин-2 16 , 17 , 18 , 19, на Клатрин покрытием ямы20,21. Интернализированных АМПА рецепторов можно либо рециркулированных обратно к плазматической мембраны или предназначенных для деградации22,23.

Важно отметить, что состав Субблок АМПА рецепторов способствует их людьми динамика24. Большое значение — Внутриклеточный домен C-терминал подразделений, где большинство Посттрансляционная модификаций и торговлей белковых взаимодействий происходит. GluA1 и GluA4 Субблок содержащих АМПА рецепторов особенно склонны вывозятся в клеточной поверхности во время LTP, отчасти из-за присутствия их PDZ лигандов, ~ 90 аминокислотных последовательностей, способствующих мембраны, якорь через взаимодействие с различными PDZ домен содержащих белков25,26. С другой стороны АМПА рецепторов, содержащие GluA2 и не GluA1 или GluA4, как правило, продают конститутивно но внутриклеточно накапливаются с синаптической активности27. GluA2 подразделений проходят РНК, редактирования, который, помимо поощрения удержания в эндоплазматический ретикулум28, оказывает поровых каналов непроницаемы для кальция29, далее о причастности Субблок конкретных людьми как ключевым посредником нейронов гомеостаза и пластичности. Интересно, что нарушение убиквитин зависимой деградации дуги было показано увеличение GluA1 эндоцитоза и увеличения поверхности выражение GluA2 Субблок содержащих АМПА рецепторов после индукции mGluR-LTD с выборочной группы я mGluR агонист (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (ДХПГ), указав, что многое еще предстоит выяснить относительно механизмов и роль субъединицы конкретных АМПА рецептор людьми30.

Методы для наблюдения изменений в поверхности экспрессии рецепторов часто громоздки, много времени, или ввести ненужные путает. Биотин основе анализов являются широко распространенной и коммерчески доступных подход. Очищение сродства биотинилированным поверхности рецепторы представляет собой один из таких примеров, однако необходимость проведения электрофореза требуется большое количество образцов материала и может оказать чрезмерно длительный показ нескольких лечения процесс31. Расширения этого анализа, где несколько точек время маркировки и immunoprecipitations выполняются для количественного определения постепенное ухудшение состояния исходного сигнала, аналогично пренебрегать добавлением новых — или рециркулированных — рецепторов клеток поверхности и только усугубляют время и материальные требования.

Другие подходы использовать химерных конструкции или добавлением флуоресцентные метки соблюдать рецептор людьми32, иногда с использованием живой клетки изображений33,34. Хотя потенциально мощный, эти проекты могут повлиять на нормальной торговли людьми структуры рецепторов из-за мутаций или драматические изменения в молекулярном весе в этих белков. Использование красителей, что лейбл субцеллюлярные отсеков по ориентации низкого pH34,35 неспецифической и разграничения различных внутриклеточных отсеков, важные для рецепторов торговли людьми (например,. лизосомы и протеосомы) трудно. Наконец использование confocal микроскопии для визуализации colocalization рецепторов с маркерами, связанных с торговлей людьми и деградации, например от англ белки или Клатрин, обеспечивая потенциально полезную информацию о конкретных локализации с субцеллюлярные резолюция, время, трудоемким и дорогостоящим из-за необходимости индивидуально анализа каждой ячейки и требование конфокальный или суперразрешением микроскопии.

Здесь мы демонстрируем высоким содержанием рецепторов людьми assay, который совместим с основной культуры нейрональных подготовка30. Этот метод отдельно метки поверхности и внутриклеточные рецепторы бассейны фиксированной нейронов, позволяя представления данных как отношение нормализованных поверхности или плотности интернализированных рецепторов к общей плотности для этого рецептора. Высоким содержанием характер этого метода является идеальным для отбора нескольких процедур и/или генотипов в короткие сроки и требует только стандартная ячейка культивирования и Антитело инкубации опыта.

Кратко первичной нейронов выращенных в стандартных 96-луночных планшетов и затем рассматривается как продиктовано экспериментальный дизайн, инкубировали с первичных антител, промывают и фиксированной. Клетки затем инкубируют с вторичное антитело для обозначения поверхности рецепторы, последовал еще один шаг фиксации. Permeabilization затем возникает и второй вторичное антитело используется для обозначения внутренних рецепторов бассейнов. Наконец клетки отражаются с помощью инфракрасного флуоресцентные Гонав сканер для количественного определения комплексной плотность населения каждого рецептора. Рисунок 1 суммирует нашим высоким содержанием пробирного по сравнению с традиционной biotinylation assay.

Хотя протокол вот оптимизированный и специфических для АМПА рецептор оборота первичной гиппокампа нейрон культур, эта процедура может в теории, быть расширен и адаптированные для различных рецепторов в различных типах клеток.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университета штата Джорджия.

1. Подготовка первичных Нейроны гиппокампа (в Ламинарный шкаф)

  1. Изолировать первичной гиппокампа нейронов из смешанного пола послеродовой день (P) 0-1 мышей как описано36.
  2. Пластина нейронов в 96-луночных поли D-лизин покрытием планшет на плотности 2 х 104 клетки на хорошо.
  3. Подготовить СМИ для кормления нейронов, добавив 10 мл 50 x B-27, 5 мл 100 x глутамина, 242 мкл 10 мг/мл 5-фтор 2′ дезоксиуридина (FUDR) и 10 мкл 10 мг/мл гентамицина 485 мл нейрональных СМИ (см. Таблицу материалы).
  4. Корма нейроны как описано36 , удалив половина (100 мкл) уже существующих СМИ (именуемый кондиционером СМИ, который содержит компоненты, которые поддерживают выживаемость нейронов) от каждой скважины и замены 100 мкл 37 ° C подогретую СМИ подготовлено в шаге 1.3 каждые 3-4 дня. Храните кондиционером от каждого кормления на 4˚C на шаге 2.3.

2. Измерение АМПА рецептор людьми в ответ ДХПГ (в Ламинарный шкаф)

  1. В день в пробирке (DIV) 14, подготовьте 500 мкл Стоковый раствор Тетродотоксин (TTX) в концентрации 2 мм с помощью клеточной культуры качества воды.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: TTX это нейротоксин. Бережно и избегать контакта с кожей.
  2. С помощью многоканальных дозаторов, удалить 100 µL из каждой скважины 96-луночных микропланшетов нейронов и пул средств массовой информации.
  3. Мкл 2 TTX Стоковый раствор 1 мл пуле кондиционером СМИ из шага 2.2 для создания раствором 4 мкм TTX. Если не достаточно пуле кондиционером СМИ, затем используйте некоторые из хранимой кондиционером СМИ от 1.4 шаг.
  4. Лечить нейронов с 100 мкл/хорошо 4 мкм решения TTX из шага 2.3. Место в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C 4 h микроплиты.
  5. Прикрепите стерильных стеклянных Пастер Пипетка на линии всасывания и прикрепить стерильные пипетки конец 200 мкл до кончика пипетки. Также тщательно удалите средства массовой информации от каждого. Не прикасайтесь к нижней части микроплиты, где расположены нейронов.
  6. Добавьте 200 мкл комнатной температуре нейрональных СМИ для каждой скважины.
  7. Инкубируйте микроплиты при комнатной температуре 15 минут инкубации в 5% CO2 является предпочтительным, но не обязательно.

3. Immunolabelling (в Ламинарный шкаф)

  1. Подготовьте 1: 150 разбавления антитела анти GluA1 или анти GluA2 в нейрональных СМИ.
  2. Удаление нейронов СМИ, добавленных в шаге 2.6. Добавьте 50 мкл решений антитела анти GluA1 или анти GluA2 соответствующие скважин для 20 мин при комнатной температуре, чтобы позволить антитела связывая. 50 мкл нейрональных СМИ, вторичное антитело только контроля скважин.
  3. Удаление решения антитела, добавленной на шаге 3.2. Вымойте микроплиты 3 раза с 100 мкл/хорошо комнатной температуре нейрональных СМИ для удаления любых несвязанные антитела.
  4. Сделайте раствор 50 мм запасов ДХПГ в нейрональных СМИ или клеток культуры качества воды. Вихрь решение кратко, чтобы полностью растворить ДХПГ. Подготовьте этот свежие решения в тот же день эксперимента. Избегайте использования старых или талой решения.
  5. Разбавьте раствор в нейрональных СМИ до 1: 500, чтобы сделать раствор 100 мкм.
  6. Удалите существующий носитель из каждой скважины. Добавьте 100 мкл/колодец ДХПГ Стоковый раствор 100 мкм с шагом 3.5. Инкубируйте микроплиты в инкубаторе при 37 ° C в 5% CO2 за 10 мин.
  7. Удалите решение ДХПГ, добавленной на шаге 3.6 и добавьте 100 мкл/хорошо нейрональных средств массовой информации. Повторите этот шаг еще раз. Место микроплиты в инкубаторе при 37 ° C в 5% CO2 на 5 мин.
  8. Добавьте сахарозы сделать 4% paraformaldehyde/4% раствор сахарозы в ФБР в тот же день эксперимента. Избегайте использования старых или талой решения. Удалите средства массовой информации, добавленной на шаге 3.7. Добавьте 100 мкл/хорошо 4% раствора сахарозы в paraformaldehyde/4%. Повторите шаги 3,6-3,8 для каждого дополнительного времени точки. После завершения, Инкубируйте микроплиты на 4 ° C в течение 20 мин.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Обработайте параформальдегида запасов в зонта.
  9. Снимите фиксатор из шаг 3,8 и добавьте 100 мкл/скважина 1 x DPBS холодную.
  10. Удалите DPBS. Добавить 150 мкл/также блокирует буфер (готовые к использованию формулировки в TBS, обратитесь к Таблице материалы) и инкубации при комнатной температуре для 90 мин в качестве альтернативы, инкубировать на ночь при 4 ° C.

4. Маркировка поверхности рецепторы

  1. Подготовьте разбавления 1: 1500 680RD коза анти мыши IgG вторичные антитела в блокирующем буфере.
  2. Удалите блокирующий буфер из шага 3.10. Добавьте 50 мкл/хорошо решения вторичного антитела и инкубации при комнатной температуре на 60 мин держать микроплиты, защищенном от света, когда добавляются вторичные антитела. Убедитесь в том продолжать защищать микроплиты от света во время последующих инкубаций.
  3. Удаление решения из шага 4.2. Добавьте 100 мкл/хорошо TBS (50 мм трис-HCl, 150 мм NaCl, рН 7,6) и инкубации при комнатной температуре за 5 мин повторить этот шаг 4 еще раз.
  4. Удалите из шаг 4.3 TBS. Добавить 100 мкл/хорошо 4% paraformaldehyde/4% сахарозы в ФБР и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
  5. Удаление решения из шага 4.4. Добавьте 100 мкл/хорошо TBS и инкубации при комнатной температуре на 5 мин повторить этот шаг 2 дополнительных раз.

5. Маркировка интернализированных рецептор населения

  1. Подготовьте TBS, содержащие 0,2% сапонинов. Вихрь решение кратко, чтобы полностью растворить порошок сапонины. Фильтр решения с помощью 0,2 мкм фильтр для удаления частиц, которые могут привести к авто флуоресценции.
  2. Добавить 150 мкл TBS содержащие 0,2% сапонинов и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
  3. Удалять сапонин решение из шага 5.2 и добавьте 150 мкл/хорошо блокирующий буфер. Инкубации при комнатной температуре 90 мин.
  4. Подготовьте разбавления 1: 1500 800CW осла анти мыши IgG вторичные антитела в блокирующем буфере.
  5. Удалить блокирующий буфер из шага 5.3 и добавьте 50 мкл/хорошо решения вторичного антитела. Инкубации при комнатной температуре в течение 60 мин.
  6. Добавьте 100 мкл/хорошо TBS и инкубации при комнатной температуре на 5 мин повторить этот шаг 4 еще раз.

6. обработка изображений и анализ

  1. Изображения 96-луночных микропланшетов с помощью инфракрасной лазерной системы согласно инструкциям производителя. Установите разрешение сканирования до 84 мкм, качество сканирования для средних и смещение согласно базовая высота 96-луночных микропланшетов используется фокус. Нажмите на «Имидж студия» меню кнопку → Экспорт → изображения для цифровых медиа → экспорт изображений с разрешением 300 dpi, в формате TIFF.
  2. Скачать Image J «Фиджи» на https://imagej.net/Fiji/Downloads
  3. Открыть изображение в изображении J «Фиджи». Сплит цветовые каналы, нажав на меню «Изображение»
    Цвет → разделить каналы.
  4. Откройте диспетчер ROI от «Анализировать» → «инструменты». Установите флажок «ярлыки» в менеджере ROI на этикетке круги с числами.
  5. В красном канале (680 нм поверхности рецептор бассейн), выберите регион интерес (ROI), выбрав инструмент «круг» и рисование круга, который точно соответствует первой скважины. Нажмите Ctrl + T.
  6. Перетащите кружок на следующий хорошо и нажмите Ctrl + T. повторять до тех пор, пока в непосредственной от всех скважин.
  7. От менеджера ROI нажмите кнопку «Мера». Выберите значения, которые появляются и скопировать их в электронную таблицу.
  8. Нажмите на зеленый канал (800 Нм внутренних рецепторов бассейн) и затем Транспонировать выбранные трансформирования из шага 6.6 к изображению. От менеджера ROI нажмите кнопку «Мера». Выберите значения, которые появляются и скопировать их в электронную таблицу.
  9. Расчет средней плотности комплексных значений из вторичного только контроль скважины. Вычитание комплексного плотности значений для каждой экспериментальной хорошо от средняя вторичных только значений элемента управления интегрированы плотность поверхности рецептор пула. Повторите этот шаг для внутренних рецепторов пула.
  10. Рассчитать изменения в экспрессии рецепторов поверхности, используя R/rst, где Rs представляет собой интегрированный плотность поверхности рецепторы и Rt представляет интегрированный плотность поверхности рецепторы + интегрированный плотность внутренних рецепторов.

Representative Results

Дуги/Arg3.1 ускоряет АМПА рецептор эндоцитоза путем взаимодействия с AP-2, endophilin-3 и Динамин-216,18 после активации mGluR37. В дуговой стучать в мышь (ArcKR) lysines, 268 и 269 в протеине дуги мутируют аргинин, который вмешивается ubiquitination дуги. Это ухудшает протеасом зависимых оборот дуги и удлиняет период его полураспада в нейроны21,30. В этом эксперименте сохранение дуги в регулировании АМПА рецептор людьми рассматривался с высоким содержанием АМПА рецептор людьми assay. Нейроны относились с Na+ канала блокатор TTX, который препятствует потенциалы действия и уменьшает дуги уровни38, следуют ДХПГ, который индуцирует дуги перевод и ubiquitination37,39. Поверхность и интернализированных бассейны GluA1-(рисунок 2A) и GluA2-содержащих (Рисунок 3А) АМПА рецептор подразделения были измерены в 5 и 15 мин после ДХПГ размыва. Этот особый эксперимент используется три технических реплицирует из 3 независимых экспериментов. ArcKR нейроны показал увеличение GluA1 эндоцитоза при обработке ДХПГ по сравнению с WT нейронов, эффект, который не был замечен, когда нейроны лечили TTX только (рис. 2B). Поверхности выражение GluA2 подразделений был значительно увеличен на короткое время пунктов по сравнению с WT нейронов (рис. 3B), указанием потенциальных Субблок замена30. Некоторые скважины лечили вторичные антитела только для управления для фона флуоресценции, вызванные неспецифического связывания.

Figure 1
Рисунок 1: сравнение АМПА рецептор высоким содержанием людьми assay для assay biotinylation рецептор. Высоким содержанием людьми assay потребляет меньше времени и ресурсов, по сравнению с стандартным biotinylation assay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: поверхностные и внутренние населения АМПА GluA1 рецептор подразделений в WT и ArcKR Нейроны гиппокампа. (A) поверхность (sGluA1) и внутреннюю (iGluA1) GluA1-содержащих АМПА рецептор субблоки в WT и ArcKR Нейроны гиппокампа в 5-15 мин после ДХПГ размыва. По сравнению с WT, ArcKR нейронов после вымывания ДХПГ дальнейшее снижение sGluA1-содержащих АМПА рецептор бассейн 5 и 15 мин. (B) граф представляет поверхности флуоресценции, нормированный интенсивности флуоресценции всего. Статистические сопоставления были проведены с использованием односторонней ANOVA, парные и непарные студент t тесты. p ≤ 0,05; n = 3 технические реплицирует из 3 независимых экспериментов. Значения представляют собой среднее ± SEM. Эта цифра была изменена от стены, M. J. et al. 201830. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: поверхностные и внутренние населения АМПА GluA2 рецептор подразделений в WT и ArcKR Нейроны гиппокампа. (A) же экспериментальные условия как на рисунке 2. По сравнению с WT, ArcKR нейроны имеют увеличение в бассейне рецептора sGluA2-содержащих АМПА 5 мин после ДХПГ размыва. (B) граф представляет поверхности флуоресценции, нормированный интенсивности флуоресценции всего. Статистические сопоставления были проведены с использованием односторонней ANOVA, парные и непарные студент t тесты. p ≤ 0,05; n = 3 технические реплицирует из 3 независимых экспериментов. Значения представляют собой среднее ± SEM. Эта цифра была изменена от стены, M. J. et al. 201830. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

АМПА рецепторы являются подтип рецепторов глутамата ИОНОТРОПНЫХ, которая является неотъемлемой частью для нейронов функций, которые включают в себя формирование синапсов, синапса стабильность и синаптической пластичности. АМПА рецептор нарушение связано с несколько неврологических расстройств24 и считаются привлекательными наркотиков цели40. Например исследования показали, что один из первых признаков болезни Альцгеймера (AD) Нейронные потерю и снижение синаптических АМПА рецепторов уровень41,42. Интригующе Добавление амилоид ß олигомеров повреждает поверхности экспрессии рецепторов GluA1-содержащих АМПА синапсы43. Кроме того эпилептический статус вниз регулирует GluA2 мРНК и белка в нейронах гиппокампа, предшествующих их смерти44. В боковой амиотрофический склероз (ALS), TAR ДНК-связывающих белков (TDP-43) патологии, ненормальность молекулярных ALS-конкретных были связаны с неэффективным GluA2 Q/R сайт-редактирования РНК45.

Высоким содержанием АМПА рецептор людьми assay является эффективным средством для измерения массовых изменений в рецептор людьми профили в нейронной сети в ответ на различные факторы, потребляя значительно меньше времени и материалов, чем альтернативные методы. Один 96-луночных микропланшетов предоставляет многочисленные скважины для запуска нескольких технических реплицирует и управления для различных экспериментальных условий в том же пластины. Плотность низкая покрытие 2 х 104 клетки/хорошо по отношению к плотности клеток/хорошо 5 x 105 значительно уменьшает количество животных и материалы, необходимые для каждого эксперимента (рис. 1). Инфракрасного сканера можно изображения до шести 96-луночных планшетов одновременно. Assay также могут быть изменены до 384-ну Гонав46, которая становится особенно ценной, если assay выполняется на ценные образцы, которые трудно получить или дорогой к культуре (например человеческих образцов и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток). Весь assay могут быть завершены и проанализированы в тот же день, что экономит ценное время (рис. 1).

Для успешного и эффективного завершения анализа некоторые моменты необходимо учитывать. Во-первых важно подготовить ДХПГ решение в тот же день лечения нейрона. Не использовать повторно или заморозить ДХПГ запасов. 4% paraformaldehyde/4% сахарозы в PBS решения следует также свежие в тот же день эксперимента. Во-вторых лечить контроля скважин с TTX только или транспортного средства требуются для обеспечения что эффект являются специфическими для лечения. Важно также, чтобы включить скважин, получавших только вторичные антитела к элементу управления для фона флуоресценции, производимые неспецифической привязки. Обратите внимание, что на втором этапе фиксации (следующие размыва вторичных антител) ключ для сокращения вторичное антитело фоновые эффекты и достижения эффективного маркировки рецептор субъединиц.

Компромиссы и ограничения, как и в случае с любым методом, существуют. Этот assay не предоставляет одну ячейку (или субцеллюлярные) резолюции и не позволяет в реальном времени отслеживать рецептора людьми как другие методы по32,,3335. Кроме того надлежащего ухода должны приниматься на этапе permeabilization нейронов, как этот метод будет чувствительны к утечка внутриклеточных компонентов в случае чрезмерной permeabilization.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Zachary Allen для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана Фондом Уайтхолл (Грант 2017-05-35) и Клеон C. Arrington инициации Грант программы исследований (RIG-93) A.M.M. M.A.G. и D.W.Y. были оба поддерживается стипендий 2CI Грузии государственного университета Neurogenomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
  2. Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. Wiley. (1949).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369, (1633), 20130288 (2014).
  4. Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5, (12), 952-962 (2004).
  5. Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58, (4), 472-497 (2008).
  6. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22, (3), 461-469 (2012).
  7. Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11, (4), 457-466 (2008).
  8. Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, (3), 535-548 (2008).
  9. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141, (3), 524-535 (2010).
  10. Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10, (10), 0140868 (2015).
  11. Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544, (7650), 316-321 (2017).
  12. Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77, (3), 542-558 (2013).
  13. Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (42), E5744-E5752 (2015).
  14. Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73, (2), 260-267 (2012).
  15. Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28, (46), 11760-11767 (2008).
  16. Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52, (3), 445-459 (2006).
  17. Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19, (3), 319-326 (2009).
  18. Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
  19. DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2, (3), (2016).
  20. Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (24), 14112-14117 (1999).
  21. Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82, (6), 1299-1316 (2014).
  22. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, (2), 511-525 (2000).
  23. Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63, (1), 92-105 (2009).
  24. Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17, (6), 337-350 (2016).
  25. Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287, (5461), 2262-2267 (2000).
  26. Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (15), 3948-3953 (2018).
  27. Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43, (2), 221-236 (2004).
  28. Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40, (4), 763-774 (2003).
  29. Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67, (1), 11-19 (1991).
  30. Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98, (6), 1124-1132 (2018).
  31. Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17, (19), 7351-7358 (1997).
  32. Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284, (5421), 1811-1816 (1999).
  33. Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18, (3), 402-407 (2015).
  34. Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
  35. Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27, (5), 257-261 (2004).
  36. Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
  37. Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59, (1), 84-97 (2008).
  38. Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52, (3), 475-484 (2006).
  39. Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. (2015).
  40. Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35, (12), 1908-1916 (2012).
  41. Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52, (5), 831-843 (2006).
  42. DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27, (5), 457-464 (1990).
  43. Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284, (16), 10639-10649 (2009).
  44. Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (7), 3631-3636 (2000).
  45. Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
  46. Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481, (7380), 185-189 (2011).
Высоким содержанием пробирного контроля АМПА рецептор людьми
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter