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Neuroscience

Un análisis de contenido de alta para seguimiento AMPA del Receptor de tráfico

doi: 10.3791/59048 Published: January 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Puede modular la excitabilidad neuronal a través de un proceso dinámico de endo - y exocitosis de los receptores de glutamato ionotrópicos excitadores. Se describe aquí es un análisis accesible, de alto contenido para la cuantificación del receptor de superficie e interno población piscinas.

Abstract

Tráfico de receptores a y desde la superficie de la célula postsináptico es un mecanismo importante por el cual las neuronas modulan su respuesta a diversos estímulos. Los receptores (AMPA) ácidos α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico, que son responsables de la transmisión sináptica excitadora rápida en las neuronas, son traficados hacia y desde la superficie postsináptica para modificar dinámicamente la excitabilidad neuronal. AMPA del receptor es esencial para la plasticidad sináptica y puede interrumpirse en enfermedad neurológica. Sin embargo, prevalecen enfoques para la cuantificación del receptor de tráfico ignoran piscinas todo receptor, son demasiado tiempo - y mano de obra intensiva, o potencialmente interrumpir los mecanismos normales de tráfico y por lo tanto complicar la interpretación de los datos resultantes. Presentamos un análisis de alto contenido para la cuantificación de las poblaciones de receptores AMPA tanto superficiales como internas en las neuronas hipocampales primarias cultivadas usando doble inmunomarcación fluorescente y un analizador de infrarrojo cercano microplacas de 96 pocillos fluorescentes. Este enfoque facilita la rápida proyección de bulto internalizado y las densidades del receptor de la superficie y reducir al mínimo el material de la muestra. Sin embargo, nuestro método tiene limitaciones en la obtención de resolución unicelular o realizar proyección de imagen de células vivas. Por último, este protocolo puede ser susceptible a otros receptores y diferentes tipos de células, proporcionados optimización y ajustes correspondientes.

Introduction

La magnitud y la dinámica temporal de la excitabilidad neuronal depende en gran medida la disponibilidad y composición de las poblaciones de superficie receptores que transducen señales electroquímicas. Mientras que la síntesis de nuevos receptores (o subunidades del receptor) es generalmente un proceso enérgio costoso y relativamente prolongado, una serie de maquinaria celular dedicada a la endo - y exocitosis de los receptores existentes proporcionan un medio para su rápida inserción y a y desde la membrana1. Por lo tanto, además de la regulación transcripcional y traduccional de receptores, receptores posttranslational trata es un importante modulador de la excitabilidad neuronal.

La plasticidad sináptica, o la fuerza cambiante de las conexiones entre las neuronas con experiencia, se cree que forman la base del aprendizaje y la memoria2,3. El fortalecimiento y debilitamiento de las sinapsis con el tiempo, denominadas potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD), respectivamente, se pueden modular mediante el tráfico de receptores del ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA) 4 , 5. los receptores AMPA son heterotetramers compuesta de cuatro subunidades (GluA1-4) y median la mayoría de la transmisión sináptica excitadora rápida en el cerebro6. Así, la excitabilidad de la neurona es en gran parte una función de la cantidad de receptores AMPA en la superficie postsináptica disponible para ser activado por el glutamato. LTD es comúnmente asociado con un aumento en la endocitosis del receptor AMPA, mientras que LTP está predominantemente asociada con un aumento en la exocitosis del receptor AMPA. Expresión superficial postsináptica de los receptores AMPA requiere entrega endosomal exocitóticas proteínas, donde se produce la fusión con la membrana plasmática luego en una forma dependiente de calcio7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. también existen una serie de mecanismos que regulan la endocitosis de receptores AMPA dependiente de actividad. Un ejemplo de esto es a través del gene temprano inmediato del arco/Arg3.1 (Arc). Entre otras funciones15, arco se sabe para mediar receptores de glutamato metabotrópicos (mGluR)-LTD dependiente promoviendo la endocitosis del receptor AMPA a través de sus socios de la Unión, que incluyen proteínas endocíticas AP-2, endophilin 3 y Dinamina-2 16 , 17 , 18 , 19, en el revestimiento de clatrina pozos de20,21. Receptores AMPA internalizados pueden reciclados hacia la membrana plasmática o destinados a la degradación22,23.

Lo importante es la composición de la subunidad de los receptores AMPA contribuye a su tráfico dinámica24. De gran relevancia es el dominio c-terminal intracelular de las subunidades, donde ocurre la mayoría de modificaciones del posttranslational y las interacciones de la proteína relacionada con la trata de personas. GluA1 y GluA4 que contienen la subunidad los receptores AMPA son particularmente aptos para trata a la superficie de la célula durante la LTP, en parte debido a la presencia de los ligandos de la PDZ, ~ 90 secuencias de aminoácidos que promueven la membrana anclaje mediante interacciones con varios PDZ dominio-que contienen proteínas25,26. Por otro lado, los receptores de AMPA que contiene GluA2 y falta de GluA1 o GluA4 tienden a ser traficados constitutivamente pero acumulan intracelular con actividad sináptica27. Subunidades GluA2 someterse a RNA de edición que, además de favorecer la retención en el retículo endoplásmico28, hace que el poro del canal impermeable al calcio29, implicando más específicos de la subunidad se trata como un mediador clave de neuronal homeostasis y plasticidad. Curiosamente, la interrupción de la degradación de arco dependiente de ubiquitina se ha demostrado que GluA1 endocitosis e incrementar la expresión superficial de GluA2 subunidad que contiene los receptores AMPA después de inducción de mGluR LTD con el selectivo agonista mGluR del grupo I (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG), lo que indica que queda mucho por aprender sobre los mecanismos y el papel de la subunidad específica AMPA receptor tráfico30.

Métodos para la observación de cambios en la expresión de los receptores de la superficie son a menudo engorrosos, lentos, o introducir innecesarios confunde. Ensayos de biotina son un enfoque generalizado y disponible comercialmente. Purificación de la afinidad de receptores de superficie biotinilado representa un ejemplo de ello, sin embargo la necesidad de realizar electroforesis requiere una gran cantidad de material de la muestra y puede representar la proyección de múltiples tratamientos prohibitivamente largos proceso31. Extensiones de este ensayo, donde varios puntos de tiempo de etiquetado y immunoprecipitations se realizan para cuantificar la degradación gradual de una señal inicial, del mismo modo descuidan la adición de nuevo — o reciclado, receptores para la célula superficial y sólo exacerban el tiempo y requerimientos de materiales.

Otros enfoques de hacen uso de construcciones quiméricas o la adición de etiquetas fluorescentes para observar el tráfico del receptor32, usando a veces vivo celular imagen33,34. Mientras que potencialmente de gran alcance, estos diseños pueden afectar los patrones de tráfico normales de los receptores debido a las mutaciones o cambios dramáticos en peso molecular introducido en estas proteínas. El uso de tintes que compartimientos subcelulares etiqueta dirigiéndose a pH bajo34,35 son inespecíficos y distinguir entre diferentes compartimentos intracelulares importantes para el receptor trata de personas (por ejemplo. lisosomas y proteasomas) difícil. Por último, el uso de la microscopia confocal para visualizar la colocalización de receptores con marcadores relacionados con la trata de personas y la degradación, como clatrina, proteínas endosomal mientras que potencialmente proporciona una visión útil localización específica con resolución subcelular, tiempo, mano de obra intensiva y costosa debido a la necesidad de analizar individualmente cada celda y el requisito de confocal o microscopia de la estupendo-resolución.

Aquí, demostramos un análisis tráfico alto contenido del receptor que es compatible con las preparaciones de cultivo neuronal primario30. Este método etiquetas por separado de las piscinas de superficie e intracelular receptor de neuronas fijadas, lo que permite la presentación de datos como una proporción de superficie normalizada o densidad del receptor internalizada a la densidad general para que el receptor. La naturaleza de alto contenido de este método es ideal para la detección de múltiples tratamientos o genotipos en un corto plazo y requiere experiencia en incubación cultivo y anti-célula estándar.

Brevemente, las neuronas primarias son crecidas en microplacas de 96 pocillos estándar tratadas según diseño experimental, se incubaron con anticuerpos primarios, lavadas y fijo. Las células entonces se incuban con un anticuerpo secundario a receptores de la superficie, seguidos por otro paso de fijación de la etiqueta. Permeabilización entonces ocurre y un segundo anticuerpo secundario se utiliza para etiquetar piscinas del receptor interno. Finalmente, las células son imágenes usando un lector de microplacas fluorescente infrarrojo para cuantificar la densidad integrada de cada población del receptor. Figura 1 resume nuestro análisis de alto contenido en comparación con un ensayo de Biotinilación tradicional.

Mientras el protocolo ofrece aquí es específico para el receptor de AMPA trata de culturas primarias neuronas hippocampal y optimizado, este procedimiento podría, en teoría, es ampliado y adaptado para diversos receptores en una variedad de tipos celulares.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) en Georgia State University.

1. preparación de las neuronas Hippocampal primarias (en campana de Flujo Laminar)

  1. Aislar las neuronas hippocampal primarias de día postnatal de sexo mixto (P) 0-1 ratones como describieron anteriormente36.
  2. Las neuronas de la placa de 96 pocillos poly-D-lisina revestido microplacas con una densidad de 2 x 104 células por pocillo.
  3. Preparar los medios para alimentar a las neuronas mediante la adición de 10 mL de 50 x B-27, 5 mL de 100 x glutamina, 242 μl de 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-desoxiuridina (FUDR) y 10 μl de 10 mg/mL de gentamicina y 485 mL de medios de comunicación neuronal (véase Tabla de materiales).
  4. Alimentación de las neuronas como describieron anteriormente36 mediante la eliminación de la mitad (100 μL) de la preexistente (denominado media condicionada, la cual contiene componentes que soportan la supervivencia neuronal) los medios de comunicación de cada pozo y reemplazar con 100 μl de 37 ° C precalentado media preparado en el paso 1.3 cada 3-4 días. Almacenar los medios condicionados de cada alimentación en 4 paso 2.3.

2. medición del Receptor AMPA tráfico en respuesta a DHPG (en campana de Flujo Laminar)

  1. En día en Vitro (DIV) 14, preparar una solución stock de 500 μl de Tetrodotoxin (TTX) en una concentración de 2 mM utilizando cultivo de células agua grado.
    PRECAUCIÓN: TTX es una neurotoxina. Maneje con cuidado y evitar el contacto con la piel.
  2. Usando una pipeta multicanal, saque 100 μl de cada pocillo de la microplaca de 96 pozos de las neuronas y los medios de comunicación de la piscina.
  3. Añadir 2 μl de la solución madre de TTX a 1 mL del medio condicionado combinado del paso 2.2 para crear una solución 4 μm TTX. Si no es suficientemente los medios condicionados, utilice algunos de los medios acondicionados almacenados de paso 1.4.
  4. Tratar las neuronas con 100 μL/pocillo de la solución 4 μm TTX del paso 2.3. Colocar la microplaca en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C durante 4 horas.
  5. Coloque un vaso estéril Pasteur pipeta a una línea de succión y conecte un extremo de pipeta de 200 μL estériles hasta la punta de la pipeta. Retire los medios de comunicación de cada uno bien con cuidado. Evite tocar la parte inferior de la microplaca donde se encuentran las neuronas.
  6. Añadir 200 μL de temperatura medios neuronal a cada pocillo.
  7. Incubar la microplaca a temperatura ambiente por 15 minutos de incubación en el 5% de CO2 es recomendado: pero no es necesario.

3. Immunolabelling (en campana de Flujo Laminar)

  1. Preparar una dilución de 1: 150, del anticuerpo anti-GluA1 o anti-GluA2 en los medios de comunicación neuronal.
  2. Quitar los medios de comunicación neuronal que agregó en el paso 2.6. Añadir 50 μl de las soluciones de anticuerpos anti-GluA1 o anti-GluA2 a los pocillos correspondientes por 20 min a temperatura ambiente para permitir la Unión de anticuerpos. Añadir 50 μl de los medios de comunicación neuronal a los pocillos de control único anticuerpo secundario.
  3. Retirar las soluciones de anticuerpos agregadas en el paso 3.2. Lave la microplaca 3 veces con 100 μL/pocillo de temperatura neuronal los medios de comunicación para eliminar los anticuerpos no Unidos.
  4. Hacer una solución madre de 50 mM de DHPG en los medios de comunicación neuronal o agua de grado cultivo celular. Vórtice la solución brevemente para disolver completamente el DHPG. Preparar esta solución fresca el mismo día del experimento. Evitar el uso de soluciones viejas o descongeladas.
  5. Diluir la solución madre en 1: 500 para hacer una solución de μm 100 medios de comunicación neuronal.
  6. Retire los medios existentes de cada pozo. Añadir 100 μL/pocillo de la solución madre de 100 μm DHPG de paso 3.5. Incube las microplacas en la incubadora a 37 ° C en 5% CO2 durante 10 minutos.
  7. Retirar la solución DHPG agregada en el paso 3.6 y añadir 100 μL/pocillo neuronal media. Repita este paso una vez más. Colocar la microplaca en la incubadora a 37 ° C en 5% CO2 durante 5 minutos.
  8. Añadir la sacarosa para la solución de sacarosa de paraformaldehyde/4% de 4% en PBS en el mismo día del experimento. Evitar el uso de soluciones viejas o descongeladas. Quitar los medios de comunicación ha añadido en el paso 3.7. Añadir 100 μL/pocillo de solución de sacarosa al 4% paraformaldehyde/4%. Para cada punto adicional de tiempo Repita los pasos 3.6-3.8. Una vez finalizado, incubar la microplaca a 4 ° C por 20 min.
    PRECAUCIÓN: Manejar las poblaciones de paraformaldehido en una campana de humos.
  9. Quite el fijador de paso 3.8 y añadir 100 μL/pocillo de frío 1 x DPBS.
  10. Retire la DPBS. Añadir 150 μL/pocillo de bloqueo tampón (una formulación lista para usar en TBS, consulte la Tabla de materiales) e incubar a temperatura ambiente durante 90 min alternativamente, incubar durante una noche a 4 ° C.

4. receptores de superficie de etiquetado

  1. Preparar una dilución de 1:1500 de 680RD cabra anti-ratón IgG de anticuerpo secundario en solución amortiguadora de bloqueo.
  2. Retire el amortiguador de bloqueo de paso 3.10. Añadir 50 μL/pocillo de la solución de anticuerpo secundario e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos mantenga la microplaca protegida de la luz una vez que se añaden los anticuerpos secundarios. Asegúrese de seguir protegiendo la microplaca de la luz durante las incubaciones posteriores.
  3. Eliminar la solución en el paso 4.2. Añadir 100 μL/pocillo TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) e incubar a temperatura ambiente para 5 minutos repetir este paso 4 veces más.
  4. Quitar TBS de paso 4.3. Añadir 100 μL/pocillo de sacarosa paraformaldehyde/4% al 4% en PBS e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  5. Retire la solución de paso 4.4. Añadir 100 μL/pocillo TBS e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, repetir este paso 2 veces más.

5. etiquetado de la población de receptores internalizados

  1. Preparar TBS que contiene 0.2% de saponina. Vórtice la solución brevemente para disolver completamente el polvo de saponina. Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm para eliminar todas las partículas que podrían causar auto fluorescencia.
  2. Añadir 150 μL TBS conteniendo saponina 0.2% e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  3. Retire la solución de saponina de paso 5.2 y agregar 150 μL/pozo amortiguador de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 90 minutos.
  4. Preparar una dilución de 1:1500 de 800CW burro anti-ratón IgG secundaria anticuerpo en solución amortiguadora de bloqueo.
  5. Retire el amortiguador de bloqueo de paso 5.3 y añadir 50 μL/pocillo de la solución de anticuerpo secundario. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos.
  6. Añadir 100 μL/pocillo TBS e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, repetir este paso 4 veces adicionales.

6. la proyección de imagen y análisis

  1. Imagen de la microplaca de 96 pozos utilizando un láser infrarrojo sistema según las instrucciones del fabricante de imagen. Ajuste la resolución de escaneo 84 μm, la calidad de exploración del medio y el compensado según la altura de la base de la microplaca de 96 pocillos usada. Haga clic en el botón de menú de "Estudio de la imagen" → exportar → imagen para medios digitales → exportar imágenes a una resolución de 300 dpi, en formato TIFF.
  2. Descargar Image J "Fiji" en https://imagej.net/Fiji/Downloads
  3. Abre la imagen en Image J "Fiji". Dividir los canales de color haciendo clic en el menú "Imagen"
    Canales de color → Split.
  4. Abra el administrador de ROI de "Analizar" → "herramientas". Marque la casilla "etiquetas" en el administrador de ROI para etiquetar los círculos con números.
  5. En el rojo (los 680 nm receptor de superficie piscina) del canal, seleccione la región de interés (ROI) seleccionando la herramienta de círculo y dibujar un círculo que encaja con precisión el primer pozo. Presione Ctrl + T.
  6. Arrastre el círculo a otro bien y presione Ctrl + T. repetir hasta que todos los pozos están en un círculo.
  7. Desde el retorno de la inversión, haga clic en "Medida". Seleccione los valores que aparecen y copiarlas a una hoja de cálculo.
  8. Haga clic en el canal verde (la piscina y receptor interno nm 800) y luego transponer las ROIs seleccionadas de paso 6.6 a la imagen. Desde el retorno de la inversión, haga clic en "Medida". Seleccione los valores que aparecen y copiarlas a una hoja de cálculo.
  9. Calcular que los valores promedio de densidad integrada del secundario sólo controlan de pozos. Restar los valores de densidad integrada para cada pozo experimental de los secundaria sólo control integrado densidad valores promedio para el grupo receptor de la superficie. Repita este paso para la piscina del receptor interno.
  10. Calcular los cambios en la expresión del receptor de la superficie usando Rs/rt, donde Rs representa la densidad integrada de receptores de superficie y Rt representa la densidad integrada de receptores de superficie + densidad integrado de receptores internos.

Representative Results

Arco/Arg3.1 acelera la endocitosis del receptor AMPA a través de la interacción con AP-2, endophilin 3 y Dinamina 216,18 siguiendo mGluR activación37. En el arco knock-en ratón (ArcKR), lisinas 268 y 269 en la proteína de arco mutan a la arginina, que interfiere con la ubiquitinación de arco. Esto deteriora el volumen dependiente del proteosoma de arco y prolonga su vida media en las neuronas21,30. En este experimento, la persistencia del arco en la regulación del tráfico de receptores AMPA fue examinada usando el análisis de tráfico alto contenido AMPA del receptor. Las neuronas fueron tratadas con el bloqueador de canales de Na+ TTX, que inhibe los potenciales de acción y reducen el arco niveles38, seguido por DHPG, que induce a la traducción de arco y ubiquitinación37,39. Superficie y piscinas internalizados de GluA1 (figura 2A) y subunidades del receptor AMPA GluA2-que contiene (Figura 3A) se midieron a 5 y 15 min después de lavado DHPG. Este experimento particular utiliza tres técnicas repeticiones de 3 experimentos independientes. ArcKR neuronas mostraron mayor GluA1 endocitosis con DHPG en comparación con las neuronas de la WT, un efecto que no fue considerado cuando las neuronas fueron tratadas con TTX solamente (figura 2B). Superficial expresión de subunidades de GluA2 aumentó significativamente en poco tiempo puntos en comparación con las neuronas de la WT (figura 3B), que indica un potencial de recambio de subunidad30. Algunos pozos fueron tratados con anticuerpos secundarios solamente al control para fluorescencia de fondo causada por el atascamiento no específico.

Figure 1
Figura 1: comparación del AMPA receptor alto contenido tráfico ensayo para el ensayo de Biotinilación de receptores. El ensayo trata de alto contenido consume menos tiempo y recursos en comparación con el ensayo de Biotinilación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: poblaciones superficiales e internas de subunidades del receptor de AMPA GluA1 en neuronas hippocampal WT y ArcKR. (A) superficie (sGluA1) e internalizada (iGluA1) que contiene GluA1 AMPA receptor subunidades en neuronas hippocampal WT y ArcKR a los 5 y 15 min después de lavado DHPG. En comparación con WT, ArcKR las neuronas tienen una disminución adicional en la que contiene sGluA1 AMPA receptor piscina 5 y 15 min después de lavado DHPG. (B) gráfico representa normalizada a la intensidad de fluorescencia total de la fluorescencia superficial. Las comparaciones estadísticas fueron realizadas utilizando un ANOVA unidireccional, pruebas de t del estudiante apareados y no apareados. p ≤ 0.05; n = 3 réplicas técnicas de 3 experimentos independientes. Los valores representan la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada desde la pared, M. J. et al. 201830. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: las poblaciones internas y superficiales de subunidades del receptor de AMPA GluA2 en neuronas hippocampal WT y ArcKR. (A) la misma condición experimental como la figura 2. Comparado con el peso, las neuronas ArcKR tienen un aumento en piscina de receptor AMPA que contiene sGluA2 5 min después de lavado DHPG. (B) gráfico representa normalizada a la intensidad de fluorescencia total de la fluorescencia superficial. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional, pruebas de t del estudiante apareados y no apareados. p ≤ 0.05; n = 3 réplicas técnicas de 3 experimentos independientes. Los valores representan la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada desde la pared, M. J. et al. 201830. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los receptores AMPA son un subtipo de receptores de glutamato ionotrópicos que es esencial para las funciones neuronales que incluyen formación de sinapsis, la sinapsis estabilidad y plasticidad sináptica. Alteración del receptor AMPA está vinculado a múltiples trastornos neurológicos24 y se consideran drogas atractivos objetivos40. Por ejemplo, estudios han demostrado que una de las muestras más tempranas de la enfermedad de Alzheimer (EA) es la pérdida de sinapsis y reducido sináptica niveles del receptor AMPA de41,42. Curiosamente, además de los oligómeros de amiloide-ß deteriora la expresión del receptor AMPA que contiene GluA1 de superficie en sinapsis43. Además, del estado de abajo-regula la GluA2 mRNA y proteína en las neuronas hipocampales anterior a su muerte44. En la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), alquitrán de ADN proteína (TDP-43) patología, una anormalidad molecular específica de ALS, ha estado vinculado a ineficiente sitio de GluA2 Q/R-RNA editando45.

El ensayo trata de alto contenido AMPA receptor proporciona un medio eficaz para medir cambios a granel en perfiles tráfico del receptor dentro de una red neuronal en respuesta a diversos factores, consumiendo mucho menos tiempo y materiales que los métodos alternativos. Una sola microplaca de 96 pocillos proporciona numerosos pozos para ejecutar técnicas múltiples replica y controles para diferentes condiciones experimentales en el mismo plato. La densidad de baja placas de 2 x 104 células/pozo en relación con la densidad de 5 x 105 células/pozo reduce significativamente el número de animales y materiales necesarios para cada experimento (figura 1). El escáner de infrarrojos puede imagen microplacas de 96 pocillos hasta seis a la vez. El ensayo también puede modificarse para microplacas de 384 pozos46, que se convierte en especialmente valiosa si el ensayo se ejecuta en las muestras preciosas que son difíciles de conseguir o son caros a la cultura (muestras por ejemplo humano y células madre pluripotentes inducidas). El ensayo completo puede ser terminado y analizado el mismo día, lo que ahorra tiempo (figura 1).

Para la terminación exitosa y eficiente de la prueba, algunos puntos deben ser considerados. En primer lugar, es importante preparar la solución DHPG en el mismo día del tratamiento de la neurona. No reutilizar ni congelar existencias DHPG. El 4% paraformaldehyde/4% de sacarosa en solución de PBS debe también hacerse fresca el mismo día del experimento. En segundo lugar, pocillos de control trataron con TTX solo o vehículo están obligados a garantizar que los efectos observados son específicos de tratamiento. También es fundamental incluir pozos tratados con sólo los anticuerpos secundarios para control por fluorescencia del fondo producida por fijación no específica. Tenga en cuenta que el segundo paso de la fijación (siguiente lavado de anticuerpos secundarios) es clave para reducir efectos de fondo del anticuerpo secundario y lograr un etiquetado eficaz de subunidades del receptor.

Compromisos y limitaciones, como con cualquier método, existen. Este análisis no proveen resolución unicelular (o subcelular) y no permiten el seguimiento en tiempo real del receptor trata como otros métodos32,33,35. Además, adecuado debe tenerse cuidado durante el paso de permeabilización de las neuronas, como este método será sensible a la filtración de componentes intracelulares en el caso de exceso de permeabilización.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Zachary Allen para asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Whitehall (concesión 2017-05-35) y Cleon C. Arrington investigación beca programa de iniciación (RIG-93) a a.m.m. M.A.G. y D.W.Y. fueron apoyados por una beca de 2CI Neurogenomics de Universidad de estado de Georgia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un análisis de contenido de alta para seguimiento AMPA del Receptor de tráfico
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Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

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