Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

doi: 10.3791/59048 Published: January 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Nöronal uyarılabilirlik endo-dinamik bir süreçtir ve ekzositozu eksitatör ionotropic glutamat reseptörlerinin modülasyonlu. Burada açıklanan yüzey ve iç reseptör nüfus havuzları miktarının için erişilebilir, yüksek içerikli bir tahlil olduğunu.

Abstract

Önemli bir mekanizma tarafından onların yanıt farklı uyaranlara karşı nöronların modüle postsinaptik hücre yüzeyine gelen ve reseptörlerinin kaçakçılığı. Sinaptik iletimde hızlı eksitatör nöronlar için sorumlu olan α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) reseptörleri, nöronal uyarılabilirlik dinamik olarak değiştirmek için postsinaptik yüzeye gelen ve insan ticareti. AMPA reseptör kaçakçılığı için sinaptik plastisite esastır ve nörolojik hastalığı bozdu. Ancak, tüm reseptör havuzları, reseptör kaçakçılığı miktarının için yaygın olarak karşılaşılan bazı yaklaşımlar göz ardı vardır aşırı zaman - ve emek yoğun, ya da potansiyel olarak normal ticareti mekanizmaları bozulur ve bu nedenle elde edilen verilerin yorumlanması karmaşık. Biz çift floresan immunolabeling ve yakın kızılötesi floresan 96-şey Mikroplaka tarayıcı kullanarak kültürlü birincil hipokampal nöronlarda bir yüksek-içerik tahlil yüzey ve iç AMPA reseptör nüfus miktar için mevcut. Bu yaklaşım sağlar internalized toplu hızlı tarama ve örnek malzeme en aza indirerek reseptör yoğunluğunu yüzey. Ancak, bizim yöntem tek hücreli çözünürlük elde etmek veya canlı hücre görüntüleme iletken sınırlamaları vardır. Son olarak, bu iletişim kuralı diğer reseptörleri ve farklı hücre tipleri, uygun ayarlamalar ve optimizasyon sağlanan mükellef olabilir.

Introduction

Sorunun büyüklüğü ve nöronal uyarılabilirlik zamansal dinamiği bağlıdır büyük ölçüde kullanılabilirlik ve elektrokimyasal sinyalleri transduce yüzey reseptör nüfus bileşimi. Oysa yeni reseptörler (veya reseptör alt birimleri) sentezi genellikle bir enerjik pahalı ve nispeten uzun süren bir süreçtir, hücresel makine endo - ve varolan reseptörlerinin ekzositozu adanmış bir dizi sağlamak anlamına gelir onların hızlı ekleme için ve kaldırma için ve membran1. Bu nedenle, transkripsiyon ve çevirim reseptörlerinin yanı sıra, ardından reseptör kaçakçılığı nöronal uyarılabilirlik önemli bir modülatör düzenlemedir.

Sinaptik plastisite veya deneyim, nöronlar arasındaki bağlantılar değişen gücünü öğrenme ve bellek2,3temelini düşünülmektedir. Güçlendirilmesi ve uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen (LTP) ve uzun süreli depresyon (LTD) olarak adlandırdığı sinapslarda zaman içinde zayıflaması sırasıyla, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) reseptörleri kaçakçılığı yoluyla modülasyonlu 4 , 5. AMPA reseptör vardır dört alt birimleri (GluA1-4) oluşan heterotetramers ve beyin6hızlı eksitatör sinaptik iletimi çoğunluğu aracılık. Böylece, nöron uyarılabilirlik büyük ölçüde AMPA reseptör postsinaptik yüzeyi glutamat tarafından etkinleştirilmesi için kullanılabilir miktarı bir işlevdir. LTP ağırlıklı olarak AMPA reseptör ekzositozu bir artış ile ilişkilidir, ancak LTD sık AMPA reseptör endositoz, bir artış ile ilişkilidir. Endosomal teslim exocytotic proteinler, Füzyon plazma zarı ile o zaman bir kalsiyum-bağımlı bir şekilde7,8,9', oluştuğu için AMPA reseptörlerinin postsinaptik yüzey ifadesi gerektirir 10 , 11 , 12 , 13 , 14. bir dizi etkinlik bağımlı AMPA reseptör endositoz düzenleyen mekanizmalar da bulunmaktadır. Bunun bir örneği hemen erken gen yay/Arg3.1 (Arc) olduğunu. Diğer işlevleri15arasında Arc metabotropic glutamat reseptör (mGluR) arabuluculuk bilinmektedir-AMPA reseptör endositoz endositik proteinler AP-2, endophilin-3 ve dynamin-2 içerir bağlama ortakları aracılığıyla teşvik tarafından bağımlı LTD 16 , 17 , 18 , 19, clathrin kaplı,20,21çukurlar. İçselleştirilmiş AMPA reseptör plazma membran için geri dönüşümlü veya bozulma22,23için ayrılmış.

Önemlisi, AMPA reseptör alt birim bileşimi için ticareti kendi dinamikleri24katkıda bulunur. Büyük alaka ardından değişiklikler ve ticareti ile ilgili protein etkileşimleri çoğunluğu gerçekleştiği alanının alt birimleri, hücre içi C-terminal etki alanıdır. GluA1 ve GluA4 alt birimi içeren AMPA reseptör hücre yüzeyine LTP sırasında kısmen kendi PDZ ligandlar, çeşitli PDZ ile etkileşimleri ile ankraj membran teşvik ~ 90 amino asit dizileri varlığı nedeniyle insan ticareti için özellikle apt vardır etki alanını içeren protein25,26. Öte yandan, GluA2 içeren ve GluA1 veya GluA4 eksik AMPA reseptör yapısal insan ticareti ama intracellularly sinirsel aktivite27ile birikir eğilimindedir. GluA2 alt birimleri, endoplazmik retikulum28, saklama teşvik ek olarak kanal gözenek kalsiyum29, geçirimsiz işler düzenleme RNA daha fazla göstermek için alt birim özel anahtar bir arabulucu, nöronal kaçakçılığı geçmesi homeostasis ve plastisite. İlginçtir, Ubikuitin-bağımlı Arc bozulması bozulma GluA1 endositoz artırmak ve sonra ben mGluR agonist mGluR-LTD ile seçici indüksiyon grup GluA2 alt birimi içeren AMPA reseptör yüzey ifade artırmak için gösterilen (S) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (çok mekanizmaları ve alt birim özel AMPA reseptör kaçakçılığı30rolü ile ilgili olarak öğrenilmesi gereken kalır gösteren DHPG).

Reseptörlerinin yüzey ifade değişimler gözlemleyerek yöntemleri çoğu kez hantal, zaman alıcı veya gereksiz tanıtmak zihnimi karıştıran. Biotin tabanlı deneyleri yaygın ve piyasada bulunan bir yaklaşım vardır. Ancak Elektroforez performans gerekliliği örnek malzeme büyük miktarda gerektirir ve birden fazla tedavi ile taranması aşırı derecede uzun işleyebilir benzeşme arıtma biotinylated yüzey reseptörlerinin böyle bir örnek temsil eder işlem31. Uzantıları nerede birden fazla zaman puan etiketleme ve immunoprecipitations ilk bir sinyal kademeli bozulması ölçmek için yapılmaktadır, bu testin benzer şekilde ihmal yanı sıra yeni — veya geri dönüşümlü — reseptörleri yüzey ve tek hücreye alevlenmesine zaman ve malzeme gereksinimleri.

Diğer yaklaşımlar chimeric yapıları kullanımı veya reseptör kaçakçılığı32gözlemlemek için floresan etiketler ekleme yapmak, bazen canlı kullanarak hücre görüntüleme33,34. Potansiyel olarak güçlü iken, bu tasarımlardan reseptörleri mutasyonlar veya molekül ağırlığı bu proteinler tanıttı dramatik değişiklikler nedeniyle normal kaçakçılığı şekillerinin etkileyebilir. Düşük pH34,35 hedefleyerek etiket hücre altı bölmeleri belirsiz ve farklı hücre içi bölmeleri reseptör ticareti (e.g. organellerin için önemli arasında ayrım yapmak boya kullanımı ve proteasomes) zor. Son olarak, trafiği ve potansiyel olarak yararlı ile belirli yerelleştirme içgörü sağlarken bozulması, endosomal proteinler veya clathrin, gibi ilişkili işaretçileri olan colocalization reseptörlerinin görselleştirmek için confocal mikroskobu kullanımı hücre altı çözünürlük, zaman, emek yoğun ve tek tek her hücre ve confocal şartı analiz gerekliliği nedeniyle pahalı veya Süper çözünürlük mikroskobu.

Burada, biz birincil nöronal kültür ürünleri30ile uyumlu olan bir yüksek-içerik reseptör kaçakçılığı tahlil göstermektedir. Bu yöntem sabit nöronların verilerin sunumunu normalleştirilmiş yüzey veya bu reseptör için genel yoğunluğu içselleştirilmiş reseptör yoğunluğu oranında olarak etkinleştirme, yüzey ve hücre içi reseptör havuzları ayrı olarak Etiketler. Bu yöntem yüksek içerik doğası birden fazla tedavi ve/veya genotip bir kısa süre içinde eleme için idealdir ve sadece standart hücre kültürü çalışmalarının ve antikor kuluçka uzmanlık gerektirir.

Kısaca, birincil nöronlar içinde standart 96-şey Mikroplaka yetiştirilen sonra deneysel tasarım tarafından dikte edildiği gibi tedavi, birincil antikorlar ile inkübe, yıkanmış ve sabit. Hücreler daha sonra başka bir fiksasyon adım gelir yüzey reseptörlerinin etiketlemek için ikincil bir antikor ile inkübe. O zaman permeabilization oluşur ve ikinci ikincil antikor iç reseptör havuzları etiketlemek için kullanılır. Son olarak, hücreleri entegre her reseptör nüfus yoğunluğunu ölçmek için bir kızılötesi Floresan Mikroplaka tarayıcı kullanarak yansıma. Şekil 1 bizim yüksek-içerik tahlil ile karşılaştırıldığında geleneksel biotinylation tahlil özetler.

İşte en iyi duruma getirilmiş ve birincil hipokampal nöron kültürlerde kaçakçılığı AMPA reseptör için belirli iletişim kuralı teklif ederken, bu yordamı, teorik olarak, olabilir genişletilmiş ve hücre tipleri çeşitli farklı reseptörleri için uyarlanmış.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Georgia State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. birincil hipokampal nöronların (laminer akış Hood) hazırlama

  1. Karma seks postnatal günden (P) birincil hipokampal nöronların izole 0-1 fareler daha önce açıklandığı gibi36.
  2. 96-şey poli-D-lizin nöronlarda plaka Mikroplaka iyi başına 2 x 104 hücre yoğunluğu, kaplı.
  3. 10 mL 50 ekleyerek nöronlar beslenmesi için ortam hazırlamak B-27, 5 mL 100 x glutamin de, 10 mg/mL 5-Fluoro-2 '-deoxyuridine (FUDR) 242 µL ve 10 x 10 mg/mL viomisin nöronal medya (bkz. Tablo reçetesi) 485 ml µL.
  4. Besleme nöronlar daha önce açıklandığı gibi36 yarısı kaldırarak (100 µL) medya (nöronal hayatta kalma destekleyen bileşenler içeren klimalı ortam adlandırılır) medya her kuyudan önceden var olan ve 37 ° C 100 µL ile değiştirmeye prewarmed 1.3. adımda her 3-4 gün hazırladı. Her 4˚C adım 2.3 için besleme şartına medyadan saklamak.

2. DHPG (içinde Laminar akış Hood) yanıt olarak kaçakçılığı AMPA reseptör ölçme

  1. Gün içinde Vitro (DIV adlı) 14, 2 mM hücre kültürü kullanarak bir konsantrasyon, bir 500 µL hisse senedi çözüm Tetradotoksin (TTX) sınıf su hazırlamak.
    Uyarı: TTX bir nörotoksin var. Dikkatli bir şekilde ele ve deri ile temasından sakının.
  2. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 100 µL 96-şey Mikroplaka nöronların her kuyudan çıkarın ve Medya Havuzu.
  3. 2 µL TTX hisse senedi çözüm adım 2.2 TTX 4 µM çözüm oluşturmak için havuza alınan klimalı ortam için 1 mL ekleyin. Yeterince havuza alınan klimalı ortam varsa, adım 1.4 saklı şartına medyasından bazıları kullanıyor.
  4. Nöronlar 100 µL/iyi TTX 4 µM çözüm ile 2.3 adımından tedavi. Mikroplaka 37 ° C'de kuluçka %5 CO2 4 h için bir yer.
  5. Pasteur bir emiş hattına pipet ve Pipet Ucu steril 200 µL Pipet ucunu takın steril cam takmak. Medya her birinden de dikkatli bir şekilde çıkarın. Alt kısmındaki nöronların konumlandırıldığı Mikroplaka dokunmaktan kaçının.
  6. Oda sıcaklığında nöronal medya 200 µL her şey için ekleyin.
  7. 15 dk. kuluçka %5 CO2 tercih edilen ancak gerekli değildir için oda sıcaklığında Mikroplaka kuluçkaya.

3. Immunolabelling (içinde Laminar akış Hood)

  1. Anti-GluA1 veya anti-GluA2 antikor nöronal medyada bir 1:150 seyreltme hazırlayın.
  2. Adım 2,6 eklendi nöronal medyayı çıkarın. Anti-GluA1 veya anti-GluA2 antikor çözümleri 50 µL karşılık gelen kuyular antikor bağlantısına izin için oda sıcaklığında 20 dakika için ekleyin. Nöronal medya 50 µL ikincil antikor tek denetim wells için ekleyin.
  3. 3.2 basamaktaki antikor çözümleri kaldırın. Mikroplaka ilişkisiz herhangi bir antikor kaldırmak için 3 kez 100 µL/iyi oda sıcaklığında nöronal medya ile yıkayın.
  4. DHPG 50 mM stok çözeltisi nöronal medya veya hücre kültür sınıf su yapmak. Girdap kısaca tam DHPG çözülmeye çözüm. Bu çözüm taze deney aynı günde hazır olun. Eski veya çözdürülen çözümleri kullanmaktan kaçının.
  5. 1:500 yapmak a 100 µM eriyik için nöronal medya hisse senedi çözümde sulandırmak.
  6. Varolan ortam her kuyudan çıkarın. 100 µL/iyi 100 µM DHPG stok çözüm adımı 3.5 ekleyin. Mikroplaka %5 CO2 37 ° C'de 10 dakika için kuluçka kuluçkaya.
  7. Basamaktaki 3.6 DHPG çözüm kaldırın ve 100 µL/iyi nöronal medya ekleyin. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Mikroplaka %5 CO2 37 ° C'de kuluçka 5 min için bir yer.
  8. Deney aynı gün içinde PBS %4 paraformaldehyde/4% sükroz çözüm yapmak sükroz ekleyin. Eski veya çözdürülen çözümleri kullanmaktan kaçının. 3.7 basamaktaki medyayı çıkarın. 100 µL/iyi %4 paraformaldehyde/4% sükroz çözüm ekleyin. 3.6-3.8 ek her zaman noktası için yineleyin. İşlem tamamlandığında, 20 dk için 4 ° C'de Mikroplaka kuluçkaya.
    Uyarı: Paraformaldehyde hisse senetleri bir duman başlıklı başa.
  9. Sabitleştirici 3.8 adımından kaldırın ve soğuk 1 x DPBS 100 µL/kuyu ekleyin.
  10. DPBS kaldırın. 150 eklemek µL/iyi (TBS içinde kullanıma hazır formülasyonu Malzemeler tabloiçin bakınız) arabellek engelleme ve alternatif olarak 90 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya, gecede 4 ° C'de kuluçkaya

4. yüzey reseptörlerinin etiketleme

  1. 680RD keçi Anti-fare IgG ikincil antikor engelleme arabellekte bir 1:1500 seyreltme hazırlayın.
  2. Engelleme arabellek 3.10 adımından kaldırın. 50 µL/iyi ikincil antikor çözüm ekleyin ve 60 dk. tutun ikincil antikor eklenir bir kez ışıktan korunan Mikroplaka oda sıcaklığında kuluçkaya. Sonraki incubations sırasında ışıktan Mikroplaka korumaya devam emin olun.
  3. Belgili tanımlık eriyik--dan adım 4.2 kaldırın. 100 µL/iyi TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) ekleyin ve 4 ek kez bu adım 5 dk. tekrarlamak için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  4. TBS 4.3 adımından kaldırın. %4 paraformaldehyde/4% sükroz 100 µL/kuyu içinde PBS ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Çözüm Adım 4.4 kaldırın. 100 µL/iyi TBS ekleyin ve 5 dk. tekrarlamak bu adım 2 ek kez oda sıcaklığında kuluçkaya.

5. içselleştirilmiş reseptör nüfus etiketleme

  1. TBS % 0,2 saponin içeren hazır olun. Girdap çözüm kısaca tam saponin toz geçiyoruz. Çözüm otomatik floresans neden olabilecek herhangi bir parçacıkları kaldırmak için 0.2 µm filtre kullanarak filtre.
  2. 150 µL TBS ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya % 0,2 saponin içeren.
  3. 5.2 adımından saponin çözüm kaldırın ve 150 µL/iyi engelleme arabellek ekleyin. 90 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  4. 800CW eşek Anti-fare IgG ikincil antikor engelleme arabellekte bir 1:1500 seyreltme hazırlayın.
  5. 5.3 adımından engelleme arabellek kaldırın ve 50 µL/iyi ikincil antikor çözüm ekleyin. 60 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  6. 100 µL/iyi TBS ekleyin ve 5 dk. tekrarlamak bu adım 4 ek kez oda sıcaklığında kuluçkaya.

6. görüntüleme ve çözümleme

  1. 96-şey Mikroplaka görüntüleme sistemi üreticinin yönergelerine uygun bir kızılötesi lazer kullanarak görüntü. Tarama çözünürlüğü 84 µm, orta ve odağı kullanılan 96-şey Mikroplaka taban yüksekliği göre Ofset tarama kalitesini ayarlayın. Tıklayın "Resim Studio" menü düğmesini → klibi dışa aktar → görüntü için dijital medya → ihracat görüntüleri TIFF biçiminde 300 dpi çözünürlükte.
  2. Görüntü J "Fiji" https://imagej.net/Fiji/Downloads indir
  3. Görüntü J "Fiji" açık görüntüde. "Görüntü" menüsünden tıklatarak renk kanalları bölme
    Renk → Split kanalları.
  4. "Analiz" → "Araçlar" ROI Yöneticisi'ni açın. Onay kutusunu "etiket" daire numaraları ile etiketlemek için yatırım getirisi Yöneticisi'nde.
  5. Kırmızı kanal (680 nm yüzey reseptör havuzu), faiz bölge (ROI) Daire aracı ve doğru bir şekilde ilk şey uygun bir daire çizim işaretleyerek seçin. CTRL + T tuşlarına basın.
  6. Daireyi de diğerine sürükleyin ve bütün wells daire içine kadar Ctrl + T. tekrar basın.
  7. ROI Yöneticisi'nden, "Ölçü"'ı tıklatın. Görüntülenir ve bir e-tabloya kopyalayın değerleri seçin.
  8. Tıklayın yeşil kanalı (800 nm iç reseptör havuzu) ve görüntü adım 6,6 ROIs seçilen işlemi tersine çevir. ROI Yöneticisi'nden, "Ölçü"'ı tıklatın. Görüntülenir ve bir e-tabloya kopyalayın değerleri seçin.
  9. İkincil ortalama entegre yoğunluk değerleri sadece kuyu kontrol hesaplayın. Entegre yoğunluk değerleri için ikincil tek entegre denetim yoğunluğu için Ortalama değerlerin yüzey reseptör havuzu deneysel her kuyudan çıkarın. İç reseptör havuzu için bu adımı yineleyin.
  10. Yüzey reseptör ifade burada Rs yüzey reseptörlerinin entegre yoğunluk temsil eder ve Rt gösterir yüzey reseptörlerinin entegre yoğunluk + entegre yoğunluğu Rs/rt, kullanarak değişiklikleri hesaplamak iç reseptörleri.

Representative Results

Ark/Arg3.1 AMPA reseptör endositoz AP-2, endophilin-3 ve dynamin-216,18 mGluR harekete geçirmek37takip ile etkileşimi aracılığıyla hızlandırır. Arc çakma fare (ArcKR), lysines 268 ve 269 Arc protein ark ubiquitination ile müdahale arginin, mutasyona. Bu proteasome bağımlı ciro ark bozar ve onun half-life nöronlar21,30uzatır. Bu deneyde, AMPA reseptör kaçakçılığı düzenlenmesinde Arc kalıcılığı yüksek içerikli AMPA reseptör kaçakçılığı tahlil kullanarak incelenmiştir. Nöronlar Na+ kanal engelleyici Aksiyon potansiyelleri engeller ve ark düzeyleri38Arc çeviri ve ubiquitination37,39neden olmaktadır DHPG tarafından takip, azaltır TTX ile tedavi edildi. Yüzey ve GluA1 - içselleştirilmiş havuzları (Şekil 2A) ve GluA2 (Şekil 3A) içeren AMPA reseptör alt birimleri DHPG silerek geç sonra 5 ve 15 dk ölçülen. Bu özel deneme 3 bağımsız deneyler üzerinden üç teknik çoğaltır kullanılan. ArcKR nöronlar WT nöronlar için karşılaştırıldığında DHPG nöronlar ile TTX sadece (Şekil 2B) tedavi edildi zaman görülen değildi bir efekt ile tedavi ederken artan GluA1 endositoz gösterdi. GluA2 alt birimleri yüzey ifade potansiyel bir alt birim yerine30gösteren WT nöronlar (Şekil 3B), karşılaştırıldığında kısa sürede noktalarda önemli ölçüde arttı. Bazı kuyular arka plan floresans nonspesifik bağlama tarafından neden olduğu için kontrol etmek için sadece ikincil antikorlar ile tedavi edildi.

Figure 1
Şekil 1: karşılaştırma AMPA reseptör yüksek içerikli kaçakçılığı testin reseptör biotinylation tahlil için. Yüksek içerikli kaçakçılığı tahlil daha az zaman ve standart biotinylation tahlil göre kaynak tüketir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: GluA1 AMPA reseptör alt birimleri WT ve ArcKR hipokampal nöronlar içinde yüzey ve iç nüfusu. (A)yüzey (sGluA1) ve içselleştirilmiş (iGluA1) GluA1 içeren AMPA reseptör alt birimleri WT ve ArcKR hipokampal nöronlar DHPG silerek geç sonra 5 ve 15 dk içinde. WT için karşılaştırıldığında, ArcKR nöronlar sGluA1 içeren AMPA reseptör havuzu 5 ve 15 dk daha fazla bir düşüş sonra DHPG silinerek geçiş var. (B) grafik yüzey floresans toplam floresan yoğunluğu için normalleştirilmiş temsil eder. Bir tek yönlü ANOVA, eşleştirilmiş ve unpaired öğrencinin t testleri kullanarak istatistiksel karşılaştırmalar yapılmıştır. p ≤ 0,05; n = 3 bağımsız deneyler üzerinden 3 Teknik çoğaltır. Değerleri ortalama ± SEM temsil eder. Bu rakam duvardan, M. J. vd. 201830değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: GluA2 AMPA reseptör alt birimleri WT ve ArcKR hipokampal nöronlar içinde yüzey ve iç nüfusu. (A) aynı deneysel koşulu olarak Şekil 2. WT için karşılaştırıldığında, ArcKR nöronlar bir artış sGluA2 içeren AMPA reseptör havuzda 5 dk sonra DHPG silinerek geçiş var. (B) grafik yüzey floresans toplam floresan yoğunluğu için normalleştirilmiş temsil eder. Tek yönlü ANOVA, eşleştirilmiş ve unpaired öğrencinin t testleri kullanarak istatistiksel karşılaştırmalar yapılmıştır. p ≤ 0,05; n = 3 bağımsız deneyler üzerinden 3 Teknik çoğaltır. Değerleri ortalama ± SEM temsil eder. Bu rakam duvardan, M. J. vd. 201830değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

AMPA reseptör kapsayan sinaps oluşumu, sinaps istikrar ve sinaptik plastisite nöronal işlevleri için ayrılmaz bir ionotropic glutamat reseptör alt türü vardır. AMPA reseptör bozulma için birden çok sinir hastalıkları24 bağlantılı ve çekici uyuşturucu hedefleri40olarak kabul edilir. Örneğin, çalışmalar bir Alzheimer hastalığı (Ah) erken işaretler synapse kaybı ve sinaptik AMPA reseptör düzeyleri41,42azalma göstermiştir. Çoğu intriguingly konularda, amiloid-β reaksiyonlar ilavesi yüzey GluA1 içeren AMPA reseptör ifade sinapslarda43bozar. Ayrıca, durum epileptikus aşağı-GluA2 mRNA ve hipokampal nöronların kendi ölüm44önceki protein düzenlemektedir. Amyotrofik lateral skleroz (ALS), TAR DNA'ya bağlanıcı protein (TDP-43) patoloji, bir ALS özgü moleküler anormallik, bağlantılı verimsiz GluA2 Q/R site-RNA45düzenleme.

Yüksek-içerik AMPA reseptör kaçakçılığı tahlil reseptör kaçakçılığı profilleri çok daha az zaman ve malzeme alternatif yöntemlere göre tüketen çeşitli faktörler cevaben nöronal ağından toplu değişiklikleri ölçmek için etkili bir yol sağlar. Tek bir 96-şey Mikroplaka birden fazla teknik çoğaltır ve aynı plaka farklı deneysel koşullar için denetimleri çalıştırmak için çok sayıda wells sağlar. 2 x 104 hücreleri/iyi göre 5 x 105 hücreleri/iyi yoğunluğu düşük kaplama yoğunluğu önemli ölçüde hayvanlar ve malzemeler her deneme (Şekil 1) için gerekli sayısını azaltır. Kızılötesi tarayıcı altı 96-şey Mikroplaka teker teker görüntü. Tahlil hangi tahlil elde etmek zordur ya da kültür (örneğin insan örnekleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler) pahalı olan değerli örnekleri üzerinde çalıştırırsanız, özellikle değerli hale gelir bir 384-şey Mikroplaka46için de değiştirilebilir. Tüm tahlil tamamlanmış ve değerli zaman (Şekil 1) kaydeder aynı gün analiz.

Tahlil başarılı ve verimli tamamlamak için bazı noktaları dikkate alınması gerekir. İlk olarak, DHPG çözüm nöron tedavi aynı gün hazırlamak önemlidir. Yeniden veya DHPG hisse senetleri dondurma değil. %4 paraformaldehyde/4% sükroz PBS çözümünde de deney aynı gün taze yapılmalıdır. İkinci olarak, denetim wells TTX ile sadece tedavi veya araç gözlenen etkileri tedavi için belirli olmasını sağlamak için gereklidir. Non-spesifik bağlama tarafından üretilen arka plan floresan için denetimine yalnızca ikincil antikorlar ile tedavi wells dahil etmek önemlidir. İkinci fiksasyon adım (ikincil antikorların aşağıdaki silinerek geçiş) anahtar ikincil antikor arka plan efektleri azaltılması ve etkili reseptör alt birimleri etiketleme ulaşmak olduğunu unutmayın.

Uzlaşma ve sınırlamalar, herhangi bir yöntemle gibi mevcut. Bu tahlil tek hücreli (veya hücre altı) çözünürlüğü sağlamaz ve gerçek zamanlı izleme gibi diğer yöntemleri32,33,35kaçakçılığı reseptör için izin vermez. Ayrıca, bu yöntem aşırı permeabilization durumunda hücre içi bileşenleri sızıntı için hassas olarak uygun bakım nöronlar, permeabilization adımı sırasında alınması gerekir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Zachary Allen teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Whitehall Vakfı (Grant 2017-05-35) tarafından desteklenen ve A.M.M. gökçek ve D.W.Y. Cleon C. Arrington araştırma başlatma hibe programı (teçhizat-93) her ikisi de Georgia State Üniversitesi Neurogenomics 2CI arkadaş grubu tarafından desteklenen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal EMD Millipore Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 ThermoFisher Scientific Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Li-COR Biosciences Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG Tocris Bio-Techne Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX) Tocris Bio-Techne Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich Cat#P7280-5X5MG
Saponin ACROS Organics Cat# 419231000
B-27 Supplement (50x), Serum Free Gibco Cat#17504044
Glutamax Supplement Gibco Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) Sigma-Aldrich Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/mL) Gibco Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified Electron Microscopy Sciences Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF) FisherScientific Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS) Li-COR Cat#927-50003 Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water HyClone Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red Gibco Cat#12348017 Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile Corning Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates Corning Cat#3603
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ) NIH http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system Li-COR Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
  2. Hebb, D. O. The organization of behavior; a neuropsychological theory. Wiley. (1949).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369, (1633), 20130288 (2014).
  4. Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5, (12), 952-962 (2004).
  5. Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58, (4), 472-497 (2008).
  6. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22, (3), 461-469 (2012).
  7. Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11, (4), 457-466 (2008).
  8. Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, (3), 535-548 (2008).
  9. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141, (3), 524-535 (2010).
  10. Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10, (10), 0140868 (2015).
  11. Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544, (7650), 316-321 (2017).
  12. Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77, (3), 542-558 (2013).
  13. Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (42), E5744-E5752 (2015).
  14. Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73, (2), 260-267 (2012).
  15. Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28, (46), 11760-11767 (2008).
  16. Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52, (3), 445-459 (2006).
  17. Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19, (3), 319-326 (2009).
  18. Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
  19. DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2, (3), (2016).
  20. Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (24), 14112-14117 (1999).
  21. Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82, (6), 1299-1316 (2014).
  22. Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, (2), 511-525 (2000).
  23. Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63, (1), 92-105 (2009).
  24. Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17, (6), 337-350 (2016).
  25. Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287, (5461), 2262-2267 (2000).
  26. Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (15), 3948-3953 (2018).
  27. Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43, (2), 221-236 (2004).
  28. Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40, (4), 763-774 (2003).
  29. Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67, (1), 11-19 (1991).
  30. Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98, (6), 1124-1132 (2018).
  31. Mammen, A. L., Huganir, R. L., O'Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17, (19), 7351-7358 (1997).
  32. Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284, (5421), 1811-1816 (1999).
  33. Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18, (3), 402-407 (2015).
  34. Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
  35. Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27, (5), 257-261 (2004).
  36. Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
  37. Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59, (1), 84-97 (2008).
  38. Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52, (3), 475-484 (2006).
  39. Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. (2015).
  40. Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease--advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35, (12), 1908-1916 (2012).
  41. Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52, (5), 831-843 (2006).
  42. DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27, (5), 457-464 (1990).
  43. Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284, (16), 10639-10649 (2009).
  44. Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (7), 3631-3636 (2000).
  45. Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
  46. Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481, (7380), 185-189 (2011).
AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).More

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter