Fluorescens resonans energi transfer-baseret real-time observation systemer af DNA streng exchange reaktion ved Rad51 mellemkomst blev udviklet. Bruger de protokoller, der præsenteres her, er vi købedygtig opdager dannelsen af reaktion mellemprodukter og deres omdannelse til produkter, mens også analysere den enzymatiske kinetik af reaktionen.
DNA streng exchange reaktion medieret af Rad51 er et kritisk skridt af homologe rekombination. I denne reaktion, Rad51 danner en nucleoprotein glødetråd på enkeltstrenget DNA (ssDNA) og indfanger dobbelt-strenget DNA (dsDNA) ikke-specifikt for at afhøre den for en homolog sekvens. Efter at være stødt homologi, katalyserer Rad51 DNA streng exchange for at mægle bindingen af ssDNA med de supplerende strand af dsDNA. Denne reaktion er stærkt reguleret af talrige accessary proteiner i vivo. Selv om konventionelle biokemiske undersøgelser har med held ansat til at undersøge rollen af sådanne tilbehør protein in vitro-, kinetic analyse af mellemliggende dannelse og dets progression i et endeligt produkt har vist sig udfordrende skyldes den ustabil og forbigående karakter af reaktionen mellemprodukter. At observere disse reaktion trin direkte i løsning, fluorescens resonans energioverførsel (FRET)-baseret real-time observation systemer af denne reaktion blev etableret. Kinetic analyse af realtids observationer viser, at DNA streng exchange reaktion ved Rad51 mellemkomst adlyder en tre-trins reaktion model der involverer dannelsen af en tre-strenget DNA mellemliggende, modning af dette mellemprodukt, og frigivelsen af ssDNA fra de modne mellemliggende. Swi5-Sfr1-kompleks, en accessary protein bevaret i eukaryoter, øger kraftigt de anden og tredje trin af denne reaktion. FRET-baserede assays præsenteres her muligt at afdække de molekylære mekanismer gennem hvilke rekombination accessary proteiner stimulere DNA streng exchange aktivitet af Rad51. Hovedformålet med denne protokol er at forbedre repertoire af teknikker til rådighed for forskere inden for homologe rekombination, især dem, der arbejder med proteiner fra andre arter end Schizosaccharomyces pombe, således at den evolutionære bevarelse af resultaterne præsenteres heri kan bestemmes.
Homologe rekombination (HR) letter blander af genetiske oplysninger mellem to forskellige DNA molekyler. HR er afgørende for to grundlæggende biologiske fænomener: generation af genetisk mangfoldighed under gametogenesis1 og reparation af DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs)2 under mitosen. DSBs er den mest alvorlige form for DNA-skader og udgør et brud i kromosom. Forkert reparation af DSBs kan forårsage omfattende kromosomale rearrangementer og genomisk ustabilitet, som er både kendetegnende for kræft3.
DNA streng exchange reaktion er den centrale fase af HR. Rad51 protein, som er medlem af den yderst velbevarede RecA-type familie af recombinases, er det vigtigste protein, der katalyserer denne reaktion i eukaryoter4,5. I denne reaktion, Rad51 binder til enkeltstrenget DNA (ssDNA) genereret af nucleolytic behandling af DSB slutningen og former en spiralformet nucleoprotein komplekse betegnes den præsynaptiske glødetråd. Denne endeløse fangster intakt dobbelt-strenget DNA (dsDNA) nonspecifically til at søge efter en homolog sekvens. Når glødetråden finder en homolog sekvens, en mellemliggende indeholdende tre-strenget DNA reaktion er dannet og Rad51 glødetråden medierer strand udveksling inden for denne struktur6,7,8. For at opnå denne reaktion effektivt, kræver Rad51 flere slags tilbehør proteiner som BRCA1 og BRCA2, produkter af bryst kræft modtagelighed gener9,10.
Forståelse er hvordan tilbehør faktorer regulere Rad51 en integreret skridt i afdække årsagerne til genomisk ustabilitet under tumordannelse. Selv om meget forskning beskæftiger sig med virkningerne af disse faktorer på præsynaptiske glødetrådens dannelse og stabilitet11,12,13,14,15,16, den bidrag af disse faktorer til dannelsen af de tre-strenget mellemliggende og dets forarbejdning til det færdige produkt er stadig uklart. Observere disse reaktion trin gennem konventionelle biokemiske eksperimenter er meget vanskeligt, fordi de tre-strenget mellemliggende er ustabil og udsat for sammenbrud af fælles eksperimentelle manipulationer såsom deproteinization af prøver eller elektroforese.
For at overvinde dette problem har vi tilpasset to tidligere udviklet real-time observationssystemer af DNA streng exchange reaktion ved hjælp af fluorescens resonans energioverførsel (FRET): DNA streng parring og DNA streng forskydning assays17, 18 (figur 1). I DNA streng parring assay, Rad51 former en præsynaptiske glødetråd med fluorescein tilføjes amidite (FAM) – mærket ssDNA og derefter homologe carboxy-x-rodamin (ROX) – mærket dsDNA indlede strand exchange reaktion. Når glødetråden fangster den ROX-mærket dsDNA og danner de tre-strenget mellemliggende, de to fluorophores kommer ind i umiddelbar nærhed og fluorescens emission af FAM er slukket af ROX (figur 1A). I DNA streng forskydning assay inkuberes en præsynaptiske glødetråd dannet på umærkede ssDNA med FAM og ROX dobbelt-mærket dsDNA. Når strand exchange er afsluttet og FAM mærket ssDNA er frigivet fra tre-strenget mellemliggende, skal emissionen af FAM stiger fordi FAM er ikke længere i umiddelbar nærhed af ROX (figur 1B). Disse analyser gør det muligt at observere dannelsen af tre-strenget mellemprodukter og deres behandling i færdigvarerne i realtid uden eventuelle forstyrrelser til reaktionen.
Med denne real-time observationssystem, fandt at DNA streng exchange reaktion medieret af Rad51 forløber i tre trin herunder dannelsen af den første reaktion mellemliggende (C1), overgang af de første mellemliggende i en anden mellemliggende (C2), og frigivelsen af ssDNA fra C219. Vi fandt også denne fission gær (S. pombe) Swi5-Sfr1, som er en evolutionært bevarede Rad51 tilbehør protein kompleks13,16,20,21,22, stimulerer C1-C2 skiftes og frigivelse af ssDNA fra C2 på en måde, der er afhængige af ATP-hydrolyse af Rad5119.
Om disse resultater er evolutionært bevaret forbliver ukendt. Denne protokol er leveret med håbet om, at forskere inden for HR, især dem, der arbejder med proteiner fra organismer end S. pombe, kan anvende disse teknikker for at afgøre, i hvilket omfang den molekylære mekanisme af Rad51-drevet strand exchange er bevaret. Desuden, disse teknikker har vist sig meget vellykket i bestemmelse af S. pombe Swi5-Sfr1 betydning. Det er således en rationel forudsigelse om at disse teknikker vil være uvurderlig i afdække de præcise roller af anden HR tilbehør faktorer.
Her har vi beskrevet en detaljeret protokol, der udnytter FRET for at måle Rad51-drevet DNA streng exchange i realtid. Vigtigere, tillade disse målinger til bestemmelse af reaktion kinetik. Mens beskrivelserne angivet ovenfor er tilstrækkelige til at genskabe vores offentliggjorte resultater, er der flere kritiske punkter, der vil blive beskrevet i dette afsnit. Desuden, fordele og ulemper af FRET-baserede metoder til at studere DNA streng udveksling vil blive drøftet, samt anvendelse af sådanne teknikker til at studere andre aspekter af DNA stofskifte.
Som med alle biokemiske reconstitutions, er sikrer, at alle reaktion substrater af høj renhed afgørende. Det er uagtsom at antage mangel af forurenende aktiviteter baseret udelukkende på den tilsyneladende renhed af en protein forberedelse bedømt af Coomassie farvning. Især kan tilstedeværelsen af spormængder af nukleaser eller helicases drastisk påvirke resultaterne af parring og fordrivelse assays. Dermed, vi vil stærkt opfordre testning for sådanne aktiviteter hver gang et nyt parti af protein er renset. Derudover er det klogt at tjekke renheden af syntetiseret DNA substrater af indfødte polyacrylamid gelelektroforese. Trods mange virksomheder sikrer renheden af oligonukleotider, har vi ofte fundet gennem vores egen testning, renheden af syntetiseret DNA kan variere mellem partier.
Det er vigtigt at overveje følgende to punkter, når der udføres eksperimenter med kvarts kuvetter. For det første, nogle proteiner er tilbøjelige til at binde kvarts kuvetter nonspecifically. For at imødegå dette, BSA og polyoxyethylenesorbitan monolaurate er inkluderet i reaktion buffere. For det andet, temperatur har en drastisk effekt på reaktion hastighed og fluorescens intensitet. For at minimere denne effekt, bør kvarts kuvette præ inkuberes ved 37 ° C før brug.
Selv om konventionelle biokemiske analyser har været enormt nyttigt i at studere DNA streng udveksling, har de flere ulemper. I et typisk tidsforløb eksperiment, en reaktion er inkuberes ved en bestemt temperatur og delprøver er trukket tilbage på ønskede timepoints og proteinfrit ved behandling med rengøringsmiddel og protease at opsige reaktionen. Ved afslutningen af tidsforløb udsættes prøver derefter for elektroforese at adskille DNA substrater fra produkter. Den største fordel ved metoden beskrevet her er, at det giver mulighed for real-time observation af reaktion uden forstyrrelser. Ethvert tidspunkt under reaktionen kan kontrolleres uden afbrydelse af reaktionen, sig selv og der er ingen grund til deproteinize prøver eller udsætte dem for de potentielt forstyrrende kræfter af elektroforese. Dette er især relevant, når overvågning labile DNA strukturer.
Trods disse styrker over konventionelle assays har metoden beskrevet her nogle ulemper. Mens brugen af oligonukleotid DNA substrater til strand exchange forenkler fortolkning af resultaterne, er det vigtigt at huske, at sådanne substrater ikke ligner DNA substrater involveret i HR i cellen. Nogle konventionelle assays udnytte plasmid mellemstore DNA substrater, som er mere tilbøjelige til at afspejle antallet basepar, der er udvekslet in vivo. Derudover kan brugen af topologisk begrænsede cirkulære dsDNA substrater i en delmængde af konventionelle assays i det mindste delvist genskabe spændinger i fysiologiske DNA.
Anvendelsen af metoden beskrevet her er begyndt at trævle de molekylære mekanismer til Rad51-drevet DNA strand udveksling. Der er dog mange interessante spørgsmål, der mangler at blive besvaret. Der er klare beviser for at HR under meiose kræver både Rad51 og Dmc1, meiose-specifikke RecA-type recombinase i eukaryoter24. Men manglen på væsentlige biokemiske forskelle mellem disse to recombinases har forvirret forskere i feltet i år. Derudover roller af mange forskellige grupper af rekombination tilbehør faktorer har været et omdrejningspunkt emne af forskning inden for HR. Ud over at belyse biokemiske forskellene mellem Rad51 og Dmc1, vi sigter mod at undersøge og sammenligne effekter af forskellige rekombination tilbehør faktorer på kinetik af DNA streng udveksling i den nærmeste fremtid. Endelig er det vigtigt at understrege, at de FRET-baseret metode beskrevet her ikke er begrænset til undersøgelse af DNA streng exchange. Med relativt mindre ændringer forestiller vi mange former for ansøgninger om denne teknik i efterforskningen af funktionelt mangfoldigt proteiner involveret i DNA stofskifte25,26,27,28. Vi håber, at den udvikling, der er beskrevet her vil give yderligere muligheder for forskere, tilhører mange forskellige discipliner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Grants-in-Aid for videnskabelig forskning (a 18H 03985) og på Innovative områder (15H 05974) til HI, for unge forskere (B) (17K 15061) til BA, og for videnskabelig forskning (B) (18H 02371) til HT fra Japan-samfund til fremme af videnskab ( JSP’ER).
0.2 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | |
1.0 x 1.0 cm quartz cuvette | Hellma Analytics | 101-10-40 | |
adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
DynaFit | BioKin, Ldt. | DynaFit is a program to analyze kinetics of biochemical reactions. | |
Fluorescent labeled and non-labeled oligonucleotides | Eurofins Genomics | The sequences of oligos are listed in Table. 1. | |
Magnetic stirrer | Aisis (Japan) | CM1609 | |
PCR machine | TAKARA (Japan) | TP600 | TAKARA PCR Thermal Cycler Dice |
Spectrofluorometer | JASCO | FP8300 | Contains a peltier temperature controller and magnetic stirrer system |
Syringe | HAMILTON | 1702RN 25ul SYR (22s/2"/2) |