Summary
यह अध्ययन नवजात चूहों को प्रोबायोटिक्स की सटीक मात्रा gavaging की प्रक्रिया का विवरण । प्रयोगात्मक सेट अप शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन प्रोबायोटिक खुराक, प्रशासन के तरीकों, और आंतों में बैक्टीरिया की ठहराव तक ही सीमित नहीं है.
Abstract
वयस्क माउस मॉडल व्यापक रूप से मानव में रोग प्रगति के पीछे तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है । नवजात रोगों के लिए वयस्क माउस मॉडल में किया अध्ययन की प्रयोज्यता सीमित है । बेहतर रोग प्रगति, मेजबान प्रतिक्रियाओं और नवजात शिशुओं में हस्तक्षेप के दीर्घकालिक प्रभाव को समझने के लिए, एक नवजात माउस मॉडल की संभावना एक बेहतर फिट है । नवजात माउस मॉडलों के विरल उपयोग भाग में इन छोटे जानवरों के साथ काम करने की तकनीकी कठिनाइयों के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । एक नवजात माउस मॉडल के लिए प्रारंभिक जीवन में प्रोबायोटिक प्रशासन के प्रभाव का निर्धारण और विशेष रूप से नवजात माउस आंत्र पथ में औपनिवेशीकरण स्थापित करने की क्षमता का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था । विशेष रूप से, नवजात माउस में प्रोबायोटिक औपनिवेशीकरण का आकलन करने के लिए, लैक्टोबैसिलस plantarum (एल. पी.) नवजात माउस जठरांत्र संबंधी मार्ग में सीधे दिया गया था । यह अंत करने के लिए, एल. पी. को इंट्रा-घेघा (आईई) gavage के माध्यम से खिला द्वारा चूहों को प्रशासित किया गया । एक उच्च reproducible विधि IE gavage की प्रक्रिया है कि प्रोबायोटिक खुराकों का एक सटीक प्रशासन की अनुमति देता है, जबकि आघात को कम करने, एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण नवजात चूहे की कमजोरी को देखते हुए एक पहलू को मानकीकरण विकसित किया गया था । इस प्रक्रिया की सीमाएं घेघा जलन या क्षति और आकांक्षा अगर gavaged गलत की संभावनाओं शामिल हैं । इस दृष्टिकोण वर्तमान प्रथाओं पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि बाहर घेघा में IE gavage आकांक्षा की संभावना कम कर देता है । gavage के बाद, प्रोबायोटिक के औपनिवेशीकरण प्रोफ़ाइल एल ई पी विशिष्ट प्राइमरों के साथ मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) निकाली आंत्र डीएनए का उपयोग कर पता लगाया गया था । विभिन्न कूड़े सेटिंग्स और पिंजरे प्रबंधन तकनीक औपनिवेशीकरण-प्रसार के लिए क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । प्रोटोकॉल का विवरण IE नवजात माउस gavage और बाद में एल पी एस के साथ औपनिवेशीकरण ठहराव की जटिलताओं ।
Introduction
शिशुओं में, जल्दी प्रोबायोटिक एक्सपोजर इम्यूनोमॉड्यूलेटरी नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ, atopic जिल्द की सूजन और पूति1,2,3, जैसे रोगों की कम घटनाओं के लिए अग्रणी प्रभाव के साथ जुड़ा हुआ है 4 , 5. हालांकि, इस इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रतिक्रिया के पीछे तंत्र नवजात मानव परीक्षणों में नमूना (यानी, अनुक्रमिक रक्त ड्रॉ और बायोप्सी) के लिए सीमा को देखते हुए तलाशने के लिए चुनौतीपूर्ण है । नवजात माउस मॉडल मदद कर सकता है नवजात प्रतिरक्षा में शामिल कार्रवाई के तंत्र का अध्ययन प्रोबायोटिक का उपयोग करें और आंत्र microbiota में परिवर्तन के साथ जुड़े विनियमन । दुर्भाग्य से, प्रोबायोटिक्स के लिए सबसे माउस मॉडल मोटे तौर पर वयस्क चूहों पर ध्यान केंद्रित किया है; हालांकि, प्रोबायोटिक्स के प्रभाव के जीवन में सबसे अधिक जल्दी होने की संभावना है, इस आयु वर्ग के लिए विशिष्ट मॉडल सुझाव3उपयोगी हो जाएगा,6। इसके अलावा, नवजात माउस मॉडल बेहतर रोगों और मानव शिशुओं के प्रारंभिक जीवन में आवेदन के लिए इरादा हस्तक्षेप के रूप में वे और अधिक बारीकी से एक विकासशील प्रतिरक्षा और माइक्रोबियल प्रणाली7,8 नकल की उंमीद कर रहे है अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं ,9,10. उद्देश्य हद तक और नवजात चूहों के प्रोबायोटिक औपनिवेशीकरण के पैटर्न मेजबान और उसके microbiome के बीच यंत्रवत बातचीत पर ध्यान देने के साथ अध्ययन करने के लिए किया गया था । नवजात मॉडलों के उपयुक्त वर्णन साहित्य में नहीं पाए गए, और इस प्रकार मजबूत और मानकीकृत विधि के विकास के लिए एक की जरूरत को संबोधित किया गया था ।
नवजात चूहों के लिए विभिन्न यौगिकों के मौखिक प्रशासन के स्थापित तरीकों में गर्भवती बांधों के लिए पानी के स्रोत के इलाज के द्वारा दूध के माध्यम से वांछित यौगिकों के मातृ हस्तांतरण शामिल11 या प्रशासन की सुविधा के लिए सुई खिला का उपयोग oropharynx12में वांछित यौगिकों । इन पद्धतियों सटीक खुराक आवश्यकताओं और जहां उपचार आसानी से प्राप्तकर्ता माउस द्वारा किया जाता है नहीं है कि प्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं । प्रोबायोटिक्स अक्सर galactooligosaccharide और fructooligosaccharide (फोस) है कि प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के लिए पोषण के एक स्रोत के रूप में सेवा के रूप में एक prebiotic के साथ संयोजन के रूप में प्रशासित रहे हैं; इन additive यौगिकों समाधान चिपचिपा और इसके बाद के संस्करण का उल्लेख किया तरीके के माध्यम से प्रशासन को चुनौती देते हैं । जीवन के पहले दिन के रूप में शुरू करने के रूप में नवजात चूहों को प्रोबायोटिक्स और prebiotics की सटीक मात्रा प्रशासन के लिए एक विधि तैयार करना (राजभाषा) आवश्यक था । gavage तकनीक के विकास की प्रक्रिया में, औपनिवेशीकरण-प्रसार की संभावना (के रूप में उपचार और नियंत्रण शस्त्र13,14,15,16के बीच अंय प्रोबायोटिक अध्ययन में मनाया) परीक्षण और विभिंन gavage कार्यक्रम के साथ पिल्ले की आंतों में बृहदांत्र लैक्टोबैसिलस plantarum (एल. पी.) के सापेक्ष बहुतायत का आकलन किया गया था । प्रोबायोटिक तैयार प्रयोगों में इस्तेमाल किया 109 कॉलोनी बनाने इकाइयों (एल. पी. के gavage प्रति CFU) (ATCC-२०२१९५ तनाव), फोस (prebiotic) और माल्टोडेक्सट्रिन (excipient) के साथ मिश्रित के रूप में हाल ही में मानव परीक्षण3में वर्णित के शामिल हैं । प्रोबायोटिक डिलिवरी IE gavage का उपयोग कर पूरा किया गया था और इस प्रक्रिया के नीचे प्रोटोकॉल में विस्तृत है । प्रोबायोटिक के औपनिवेशीकरण प्रोफ़ाइल LP विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग पूरी आंतों से निकाले डीएनए के वास्तविक समय प्रवर्धन का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था ।
Protocol
सभी प्रक्रियाओं को ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय में पशु देखभाल की सुविधा पर समर्थन स्टाफ द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों से संबंधित किए गए थे और सभी प्रक्रियाओं UBC पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. प्रोबायोटिक्स प्रशासित के ठहराव
नोट: यह कदम एक ही खुराक में प्रशासित किया जा सकता है कि प्रोबायोटिक CFU की सटीक राशि निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है. प्रोबायोटिक्स और वाहन की मात्रा (फोस और माल्टोडेक्सट्रिन) समाधान की संतृप्ति शर्तों का निर्धारण करते हैं । अनुभव से, कोई 30 से अधिक µ l (~ 20 मिलीग्राम प्रति किग्रा) द्रव की किसी भी अधिक मात्रा आकांक्षा का खतरा बढ़ जाता है के रूप में 2 राजभाषा पर चूहों के लिए प्रशासित किया जा सकता है.
- एक ट्यूब के साथ सीरियल कमजोर पड़ने के लिए छह १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों तैयार १८० µ l के बाँझ 5% डेक्सट्रोज खारा.
- एक प्रोबायोटिक-prebiotic मिश्रण के एक ०.२ ग्राम aliquot वजन और एक बाँझ तरीके से 5% डेक्सट्रोज खारा के 1 मिलीलीटर में इसे भंग ।
- 30 सेकंड और पिपेट के झुरमुट को तोड़ने के लिए भंवर । दोहराने जब तक कोई दिखाई झुरमुट देखा जाता है ।
नोट: माल्टोडेक्सट्रिन समाधान चिपचिपा बनाता है और समाधान संतृप्ति में योगदान । - एक धारावाहिक कमजोर करने के लिए १.१ कदम में तैयार ट्यूबों का उपयोग कर प्रदर्शन । भंवर मिश्रण करने के लिए ।
- प्लेट ४० श्रीमती आगर प्लेट का एक लेबल का चक्र पर हर कमजोर पड़ने के µ एल । थाली प्रत्येक कमजोर पड़ने डुप्लिकेट में ।
- anaerobic (या microaerophilic) शर्तों के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम जार में ४८ एच के लिए एक गैस पैक का उपयोग कर मशीन ।
- चक्र प्रति 20-70 कालोनियों की एक सीमा के भीतर प्रत्येक थाली गिनती । औसत प्लेट एक ही कमजोर पड़ने के साथ गिना जाता है और वांछित इकाइयों को वापस गणना ।
2. gavage के लिए प्रोबायोटिक्स और prebiotics की तैयारी
नोट: प्रोबायोटिक और prebiotic के समुचित विघटन gavage के दौरान खिला सुई के माध्यम से तरल की चिकनी इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।
- एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में prebiotics और वाहन की वांछित मात्रा के साथ lyophilized प्रोबायोटिक जीव की आवश्यक राशि का मिश्रण ।
- प्रोबायोटिक-prebiotic मिश्रण को भंग करने के लिए उपयुक्त मात्रा में विलायक (5% डेक्सट्रोज खारा) जोड़ें ।
नोट: विघटन की क्षमता prebiotic और उपयोग किए गए वाहन द्वारा सीमित है । अनुभव से, synbiotic संयोजन (फोस और माल्टोडेक्सट्रिन के साथ) लगभग ०.३ ग्राम पर संतृप्ति तक पहुंच है, जबकि एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में भंग विलायक के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर । - भंवर मिश्रण करने के लिए जब तक सभी ठोस भंग कर रहे हैं । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा विलायक में ठोस कणों की globules को तोड़ने के लिए एक प्लास्टिक का प्रयोग करें ।
- 20 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में समाधान मशीन ।
नोट: यदि प्रोबायोटिक-prebiotic समाधान एक जीवित संस्कृति से बनाया जाता है, तो यह चरण छोड़ा जा सकता है । - प्लेट एक पांच श्रृंखला 10-gavage से पहले श्रीमती आगर प्लेटों पर कमजोर पड़ने से सही है प्रोबायोटिक पिल्ला प्रशासित यों तो । सटीक CFU गणना की आवश्यकता नहीं है, तो यह चरण छोड़ा जा सकता है ।
3. सुरक्षा कैबिनेट की तैयारी
- अपूतित तकनीक बनाए रखने के लिए प्रोबायोटिक्स के साथ काम करते समय एक सुरक्षा कैबिनेट का प्रयोग करें । एक हीटिंग कंबल पर बांधों और पिल्ले के साथ पिंजरे सेट (लगभग ३८ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट) कंबल के एक आधे पर । हीटिंग कंबल के दूसरे आधे पर एक साफ, खाली पशु पिंजरे प्लेस ।
- प्लेस एक संक्रमित या बाँझ, हीटिंग कंबल पर शोषक पैड gavage के दौरान माउस को करते हैं ।
- मौजूदा, बांध बनाया घोंसला के ऊपर से पिल्ले के लिए घोंसले के माल को इकट्ठा करने और एक नया शंकु घोंसले के हाथ का उपयोग कर कप बनाने के लिए, ७०% इथेनॉल का उपयोग कर संक्रमित और सूखे । इस नए घोंसले को साफ, खाली पकड़े पिंजरे में रखें । यह दस्ताने हाथ करने के लिए घोंसले की गंध के हस्तांतरण की सुविधा है और इस प्रकार के पिल्ला पर अन्य scents के परिचय को कम करता है, जबकि उन्हें प्रक्रिया के लिए हैंडलिंग, cannibalization के जोखिम को कम करने.
- पिल्ले को शंकु घोंसले में पकड़े पिंजरे में ले जाएं और मंत्रिमंडल से बांध के साथ पिंजरे को हटा दें । इस प्रक्रिया के दौरान पिल्ले को सुनने से रोकने के द्वारा बांध के लिए तनाव कम हो जाती है ।
नोट: यदि प्रोबायोटिक murine आंतों के एक ज्ञात कॉलोनाईजर है, उपचार की स्थिति पिंजरों से अलग किया जाना चाहिए या भी विभिंन सुरक्षा अलमारियां पार औपनिवेशीकरण की संभावना से बचने के लिए ।
4. नवजात चूहे का इंट्रा-घेघा gavage
- आसान पहुंच के लिए सिरिंज पैकेजिंग खोलें । एक बाँझ तरीके से सुई की पैकिंग खोलें और सिरिंज के सिर करने के लिए संलग्न. ७०% इथेनॉल और प्रक्रिया से पहले आटोक्लेव के साथ सुई धो लो । संक्रमण से बचने के लिए उपचार और नियंत्रण समूह के लिए सुइयों के विभिन्न सेट का उपयोग करें ।
- सिरिंज में प्रोबायोटिक डाई समाधान की वांछित राशि से एक छोटे से अधिक ड्रा. ऊपर का सामना करना पड़ सिरिंज पकड़ो । तो फिर नीचे खींच और उंगली के साथ झटका बुलबुले को उखाड़ फेंक और गोताख़ोर पर पुश करने के लिए बुलबुले निष्कासित और अतिरिक्त तरल मात्रा तक वांछित मात्रा तक पहुंच जाता है । इससे यह सुनिश्चित होता है कि सुई में कोई वायु स्थान नहीं है. डॉल 2 माउस के लिए, gavage की मात्रा 30 µ l से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
- हीटिंग पैड के शीर्ष पर बाँझ शोषक पैड पर पिल्ला प्लेस । खिला सुई का प्रयोग करें (24 गेज, 1 "सुई लंबाई, १.२५ मिमी गेंद व्यास) बाह्य बस असिरूप प्रक्रिया (उरोस्थि के नीचे अंत) के नीचे सुई की गेंद रखकर घेघा की लंबाई को मापने के लिए. सुई की प्रविष्टि की सीमा नोट करने के लिए थूथन के स्तर पर सुई मार्क (चित्रा 1). स्वास्थ्य संकेत है, जो नियमित रूप से सांस लेने और त्वचा की गुलाबी रंगाई के लिए पिल्ला निरीक्षण ।
- सूई विलायक में सुई की नोक डुबकी (5% डेक्सट्रोज खारा या-मध्यम के प्रोबायोटिक और पूर्व बायोटिक भंग करने के लिए) खिला सुई की बाहरी सतहों चिकनाई के लिए इस्तेमाल किया । यह माउस के घेघा में सुई की चिकनी प्रवेश की सुविधा ।
- scruff द्वारा पिल्ला लिफ्ट या धीरे अंगूठे और तर्जनी उंगली के बीच सिर और शरीर धारण करके । सुनिश्चित करें कि सिर, गर्दन और शरीर को सीधी स्थिति में रखा जाए । ६० से अधिक समय के लिए scruff द्वारा पिल्ला पकड़ नहीं है के रूप में वहां घुटन के लिए अग्रणी श्वासनली की रुकावट का खतरा है । सुनिश्चित करें कि पिल्ला सांस ले सकता है । scruffing के लक्षण भी मुश्किल सांस लेने में असमर्थता शामिल कर सकते हैं, महत्वपूर्ण हांफते और जीभ बाहर मुंह बढ़ाया । है पिल्ला रंग की निगरानी और पूरी प्रक्रिया के दौरान सांस लेने ।
- एक ४५ डिग्री के कोण पर पिल्ला के मुंह के केंद्र में सुई के बल्ब डालें धड़ के विमान को जब तक यह गले के पीछे तक पहुंचता है ।
- धीरे सुई के बल्ब पर pivoting द्वारा सुई का कोण बदलने और gavaging व्यक्ति से दूर सिरिंज चलती है (पिल्ला के पृष्ठीय पक्ष की ओर) जब तक यह पिल्ला कशेरुका स्तंभ के विमान के समानांतर है. Scruffing पिल्ला गले के पीछे में जगह में सुई रखने में मदद करता है, और भी कुलबुलाहट से माउस को रोकता है । सुनिश्चित करें कि सुई की गेंद अग्रिम नहीं है या कोण परिवर्तन के दौरान गले के पीछे के खिलाफ किसी भी दबाव डालती है ।
- यदि माउस सुई निगल करने का प्रयास करता है, यह स्वाभाविक रूप से नीचे स्लाइड और आंदोलन की गिरफ्तारी जब सुई पर अंकन थूथन के साथ संरेखित करने के लिए अनुमति देते हैं । सिरिंज और सुई आमतौर पर काफी भारी नीचे गुरुत्वाकर्षण के कारण स्लाइड करने के लिए कर रहे हैं । हर समय सुई के वजन का समर्थन तो सुई आसानी से gavage बाहर ले जाने वाले व्यक्ति से कोई गिरावट के दबाव के साथ घेघा नीचे स्लाइड ।
- अगर सुई गले के पीछे में प्रतिरोध मिलता है, gavage सुई थोड़ा वापस लेने के लिए सुई की गेंद को उखाड़ फेंकना और फिर कोण माउस (हैंडलर सही) के बाईं ओर मुंह के अंदर सुई छोटे, 1 मिमी वेतन वृद्धि में धीरे. सुई घेघा नीचे आसानी से स्लाइड करने के लिए शुरू कर देना चाहिए ।
- सुई पर निशान से पहले बंद हो जाता है, तो मुंह पर पहुंचता है, समाधान सुई नहीं है ।
- सुई को 20 से अधिक एस के लिए डाला न रखें । यदि ऐसा होता है, सुई धीरे से वापस लेने जबकि धड़ करने के लिए समानांतर सिरिंज रखने और 30 के लिए 1 मिनट के लिए कागज तौलिया पर पिल्ला आराम करते हैं । विलायक के साथ सुई की बाहरी सतह चिकनाई के बाद फिर से gavaging की कोशिश करो ।
नोट: संज्ञाहरण के लिए माउस की प्रतिक्रिया gavage की सफलता गेज करने के लिए आवश्यक है के रूप में प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल नहीं किया है ।
- जब खिला सुई पर अंकन थूथन के ऊपर है और थूथन की नोक के साथ गठबंधन, सुई ले जाने या आगे किसी भी अग्रिम नहीं है । धीरे तरल की वांछित मात्रा इंजेक्षन । यदि तरल aspirated या नाक के माध्यम से बुलबुला मनाया जाता है, इंजेक्शन तुरंत बंद करो और धीरे से सुई वापस लेना ।
- हीटिंग पैड पर कागज तौलिया पर पिल्ला ईमानदार प्लेस को अपनी वसूली में सहायता । निरंतर श्वास समस्याओं या पिल्ला जो आकांक्षा इंगित करता है के रंग में परिवर्तन के लिए बारीकी से निगरानी । Euthanize पिल्ले कि तुरंत aspirated है ।
- एक बार gavage पूरा हो गया है, धीरे से एक ही कोण इसे डाला गया था पर खिला सुई वापस ले लो । गर्म हीटिंग पैड पर कागज तौलिया पर पिल्ला प्लेस । सामांय गतिविधि और श्वास पैटर्न हासिल करने के लिए पिल्ला के लिए 10 एस रुको । एक स्वस्थ गुलाबी रंग का पिल्ला शरीर पर दिखाई देना चाहिए और डाई केवल पेट के डिब्बे में दिखाई जानी चाहिए । इसे वापस दूसरे पिल्ले के साथ पिंजरे में ले जाएं ।
नोट: Gavaging ब्लू खाद्य रंग एक शानदार तरीका ऊपर उल्लिखित प्रक्रिया अभ्यास है । यदि gavage सफल होता है तो चूहे का पेट नीली छटा के रूप में दिखाई देगा । यदि नीले रंग पिल्ला (गर्दन, छाती या कांख क्षेत्र) के पेट के बाहर पाया जाता है, पशु humanely euthanized (पशु देखभाल नियमों के अनुसार) होना चाहिए, के रूप में यह घेघा या आकांक्षा का टूटना इंगित करता है ।
5. औपनिवेशीकरण विश्लेषण के लिए intestional नमूनों का संग्रह
- बाद में निगरानी या gavaging के दौरान, पिल्ले से मल microbiome नमूने इकट्ठा ।
नोट: पिल्ला अक्सर पेशाब और defecates जब gavaged और इस समय microbiome विश्लेषण के लिए एक मल के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक अवसर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । - प्रयोगों की समाप्ति के लिए, ग्रहणी से आंतों के पिल्ले की इच्छामृत्यु के बाद मलाशय के लिए इकट्ठा । एक शल्य चिकित्सा बोर्ड के लिए पिल्ला पिन और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित । पेरिटोनियल परत को नुकसान पहुंचाए बिना चार चक्रों में दूर त्वचा काट ७०% इथेनॉल और २५० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म मनका नसबंदी के साथ निष्फल उपकरण का उपयोग कर ।
- चार चक्रों में योनि में कटौती और आंत अंगों सामने आ रहे हैं कि एक तरह से केंद्र से दूर ले जाने के लिए बाँझ उपकरण का एक अलग सेट का उपयोग करें ।
- पेट का पता लगाने और जठरनिर्गम लुगदी नीचे और मलाशय के अंत में चुटकी के लिए एक क्लैंप का उपयोग करें । आंत को व्यवस्थित करने और संयोजी ऊतक और mesenteric ऊतक से मुक्त करने के लिए एक कुंद उपकरण या संदंश का उपयोग कर आंत की लंबाई भागो । एक बार आंत की पूरी लंबाई संयोजी ऊतक के मुक्त किया गया है, clamped सिरों पर काटा ।
- एल्यूमीनियम पंनी आंत के उंमुखीकरण के साथ मार्क, एक सुरक्षित तरीके से लपेट और पर स्थिर-८० ° c ।
नोट: डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया ठंड के बिना इस बिंदु पर किया जा सकता है । ब्लू डाई भी आंत के माध्यम से पारित करने के लिए देखा गया था 24 ज और औपनिवेशीकरण विश्लेषण के लिए नमूनों का संग्रह सबसे अच्छा है जब आंतों कम से ज्यादा एकत्र कर रहे हैं 24 घंटे पिछले gavage पोस्ट. संकेत है कि timepoint से पहले गैर-पालन बैक्टीरिया क्षणिक gavage मिश्रण के माध्यम से गुजर द्वारा परिलक्षित किया जा सकता है ।
6. औपनिवेशीकरण विश्लेषण के लिए आंतों से डीएनए निष्कर्षण
नोट: डीएनए निष्कर्षण आंत डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल के लिए किए गए संशोधनों के अनुकूलन के साथ एक वाणिज्यिक किट का उपयोग किया जाता है । सुनिश्चित हीटिंग तंत्र वांछित तापमान और समाधान की जरूरत है कि परिवर्तन या पूर्व वार्मिंग उचित रूप से तैयार कर रहे है के लिए निर्धारित है ।
- एंजाइमी Lysis बफ़र (ईएलबी) निम्नानुसार तैयार करें: 20 मिमी Tris-सीएल, 2 मिमी सोडियम EDTA और १.२% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ एक समाधान बनाओ । ८.० के लिए पीएच समायोजित करें । तुरंत ईएलबी का उपयोग करने से पहले, 20 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए lysozyme जोड़ें ।
- पूर्व गार्नेट मनका ट्यूबों को हटाया टोपियां के साथ विश्लेषणात्मक संतुलन पर वजन ।
नोट: यह इतना है कि यदि आवश्यक वजन ठेंगा है किया जाता है, यह आंतों सामग्री को दूर करने के लिए आसान है । - छोटे एक बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग कर क्षेत्रों में आंतों में कटौती और पूर्व तौला गार्नेट मनका ट्यूबों में वांछित क्षेत्रों स्कूप.
नोट: डीएनए सर्वव्यापी है और पीसीआर परिणामों को प्रभावित कर सकते है के रूप में हर नमूने के बीच नश्तर बदलने के लिए सुनिश्चित करें । - lysozyme के साथ ईएलबी के 1 मिलीलीटर जोड़ें (६.१ कदम से) प्रत्येक ट्यूब के लिए, भंवर मनका डिब्बा पर जगह और अधिकतम सेटिंग में चलाने के लिए (14) 5 मिनट के लिए ।
- एक बार ऊतक बाधित है, ट्यूबों के लिए स्थानांतरण 37 ° c पानी स्नान और 30 मिनट के लिए मशीन ।
नोट: यह कदम lysozyme को सक्रिय करने और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की कोशिका दीवार peptidoglycan के टूटने के लिए प्रेरित करने के लिए किया जाता है । - हर नमूने के लिए Proteinase K के 20 µ l के साथ ट्यूबों तैयार करें ६०० मऊ प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर ।
- 10 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक । lysate कुछ मोतियों के शीर्ष पर अवशेष ऊतक के साथ स्पष्ट दिखना चाहिए ।
- स्थानांतरण १८० µ एल के supernatant (ऊपरी चरण) एक ट्यूब में Proteinase K युक्त और फिर अल बफर के २०० µ एल जोड़ने के लिए ट्यूब. 15 एस मिश्रण करने के लिए भंवर ।
- हीटिंग ब्लॉक पर 10 मिनट के लिए ५६ ° c पर ट्यूबों प्लेस ।
- 15 एस के लिए भंवर द्वारा ट्यूब और मिश्रण करने के लिए १००% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़ें
- स्पिन कॉलम (किट से) lysate के लगभग ६०० µ एल जोड़ें ।
- ८,००० x gपर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक के माध्यम से प्रवाह त्यागें ।
- सभी lysate स्तंभ के माध्यम से आरेखित किया गया है जब तक चरण ६.१२ दोहराएँ ।
- स्तंभ को एक नए संग्रह ट्यूब में रखें । AW1 बफर के ५०० µ एल जोड़ें और 1 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- के माध्यम से प्रवाह त्यागें । AW2 बफर के ५०० µ एल जोड़ें और 3 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- के माध्यम से प्रवाह त्यागें और 3 मिनट के लिए ८,००० x g पर एक खाली संग्रह ट्यूब में कॉलम केंद्रापसारक ।
- कॉलम को डीएनए रेफरेंस ट्यूब पर ट्रांसफर करें । पीसीआर ग्रेड ultrapure पानी के ६० µ एल जोड़ें सीधे झिल्ली पर और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए गर्मी ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म्ड रेफरेंस वॉटर का प्रयोग elute के लिए करें । रेफरेंस को दो बार फाइनल रेफरेंस वॉल्यूम का इस्तेमाल करके और यील्ड बढ़ाने के लिए दोहरा कदम ६.१५ दो बार किया जा सकता है ।
- ८,००० x g पर 1 मिनट के लिए elute डीएनए के लिए केंद्रापसारक ।
- वांछित ठहराव विधि का उपयोग कर डीएनए eluted की एकाग्रता को मापने । निष्कर्षण प्रक्रिया पैदावार 10-40 एनजी/µ एल डीएनए की सीमा में हैं ।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर eluted डीएनए स्टोर ।
7. qPCR सेटअप
- पीसीआर अटी
- मशीन पर बारी और एक वास्तविक समय qPCR मशीन में 1 तालिका में कार्यक्रम लोड ।
- ४० चक्र के लिए 1 तालिका में चरण 3 से 5 लूप और प्रतिक्रिया के अंत में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना पकड़ ।
- पीसीआर प्रायोगिक सेटअप
- 2 तालिकामें पाया प्राइमरों और तापमान का उपयोग करें । तालिका 3में मिली सांद्रता और प्रतिक्रिया शर्तों का उपयोग करें । प्रक्रियात्मक भिंनता के लिए नियंत्रण के लिए तपसिल में प्रत्येक प्रतिक्रिया सेट करें ।
- qPCR सिस्टम में पीसीआर रिएक्शन ट्यूबों/प्लेट लगाएं और स्टेप ७.१ से सिस्टम में लोड किए गए प्रोग्राम को चलाएं ।
- रन के अंत में ट्यूब निकालें, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह और जेल लोडिंग के लिए तैयार करते हैं ।
8. ठहराव के एल. पी. औपनिवेशीकरण
- तैयार qPCR 10 µ l या 20 µ एल प्रतिक्रियाओं के लिए तालिका 3के अनुसार घोला जा सकता है ।
- LP जीनोमिक डीएनए मानक वक्र 107 से 101 प्रतियां/µ l
नोट: चूंकि प्रत्येक कमजोर पड़ने के 4 µ l को चढ़ाया जाएगा, 4 µ l में 107 प्रतियां या २.५ x 106 प्रतियां प्रति µ l शुरू होने वाले स्टॉक में आवश्यक है । वक्र के आराम के लिए एक ही सिद्धांत का प्रयोग करें ।- तैयार एक 1:4 कमजोर पड़ने: 107 प्रति µ l में ५० µ l
३.१४७ µ l के LPDNA + ४६.८५ µ l के डीएच2हे = २.५ x 106 प्रति µ l - प्रश्नपत्र पतला 10-गुना: जोड़ 5 µ l से ४५ µ l डीएच2O के लिए १.२५ x 105 प्रतियां/µ l
- अच्छी तरह से प्रति कमजोर पड़ने प्रति प्लेट 4 µ एल ।
- तैयार एक 1:4 कमजोर पड़ने: 107 प्रति µ l में ५० µ l
- एल. पी. amplicons का दृश्य
- का प्रयोग करें 2% agarose जेल के एक स्पष्ट जुदाई तक पहुंचने के लिए ~ १९७ बीपी LP प्रवर्धित टुकड़ा ।
- जेल में प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 9 µ एल लोड ।
- १२० वी में 30 मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
Representative Results
इस विधि की विशिष्टता एक नवजात चूहे के आकार और दायित्व निभाने एकदम को gavaging तकनीक के अपने अनुकूलन में टिकी हुई है । पिछले अनुभाग में एक डॉल 2 माउस पर एक सफल gavage प्रक्रिया को कार्यांवित करने में महत् वपूर्ण कदम बताए गए हैं । एक अच्छा ठहराव स्केल स्थापित करने के लिए, एक मानक वक्र तीन तकनीकी प्रतिकृति (चित्रा 2) के साथ शुद्ध LP डीएनए का उपयोग कर उत्पंन किया गया था । मानक वक्र एल. पी. ए. डीएनए का पता लगाने की एक गतिशील रेंज प्रदान की प्राइमरों का उपयोग कर । डायनेमिक रेंज 7 और 28 चक्र के बीच था जहां LP DNA की 101 से 107 प्रतियों की सीमा का पता लगाया गया था । मानक वक्र के स्थिर ढाल दक्षता और प्रतिक्रिया की दरिद्रता का प्रतिनिधित्व किया ।
IE gavage की प्रक्रिया रिश्तेदार आसानी के साथ वयस्क चूहों में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, एक नवजात चूहे के ऊपरी जठरांत्र संबंधी मार्ग नाजुक और प्रक्रिया के दौरान gavage सुई के नपे आंदोलनों की आवश्यकता है । दोहराया gavages से निपटने के लिए कारण बांध द्वारा अंतर-घेघा जलन, चोट और विफलता या अस्वीकृति की संभावना बढ़ सकता है । इस प्रकार, दो अलग gavaging कार्यक्रम का परीक्षण किया गया और आंतों औपनिवेशीकरण पूरी आंत homogenates से डीएनए का उपयोग quantified था । चूहों हर दिन या हर दो दिन (चित्रा 3) प्रोबायोटिक प्रशासित के साथ डॉल 8 के माध्यम से डॉल 2 से gavaged थे । प्रत्येक नमूना एक तकनीकी दोहराने निहित है और हर हालत कम दो जैविक प्रतिकृति था । पिल्ले gavaged हर दिन 7 खुराक के साथ एल. एम. के 103 प्रतियां के आसपास था, जबकि पिल्ले gavaged 4 खुराक के साथ हर दो दिन में 105 प्रतियां के आसपास था. प्रतिकृति के बीच परिणामों की निरंतरता तकनीक की शुद्धता के लिए क्रेडिट जोड़ें । वहां और LP पिल्ले की आंतों में पाया गया gavaged हर दो दिन पिल्ले के साथ तुलना में है कि हर दिन gavaged थे । इसे देखते हुए, बाद के प्रयोगों हर दूसरे दिन के एक gavage अनुसूची के साथ स्थापित किया गया था के रूप में यह भी पिल्ले के लिए तनाव कम कर देता है ।
प्रोबायोटिक्स के साथ काम करते समय इंट्रा-करकट प्रोबायोटिक क्रॉस प्रदूषित होने से बचना ज़रूरी है । littermates की microbiome से ऐसी ही उम्मीद की जा रही थी जैसे वे एक ही माँ और घोंसले के वातावरण को बाँटते हों. यह प्रोबायोटिक अध्ययन के लिए एक समस्या साबित होता है अगर उपचार और नियंत्रण की स्थिति एक ही कूड़े के भीतर मौजूद थे के रूप में प्रोबायोटिक जीव microbiota का एक हिस्सा बनने की क्षमता है ("औपनिवेशीकरण प्रसार ') । यह निर्धारित करने के लिए यदि एक प्रोबायोटिक दूषित और उपनिवेश अनुपचारित littermates, एक कूड़े का आधा ऊपर के रूप में gavaged था और आंतों qPCR के लिए एकत्र किए गए थे । डॉल का आंतों qPCR विश्लेषण 10 चूहों gavaged चूहों में एल ई डी डीएनए की अपेक्षित प्रवर्धन दिखाया लेकिन यह भी, गैर में एक कम डिग्री करने के लिए gavaged littermates (चित्रा 4). एक अनुपचारित पिंजरे से एक ही डॉल चूहों की आंतों को ३२ से अधिक चक्र में कोई प्रवर्धन या न्यूनतम प्रवर्धन नहीं दिखाया गया. यह एक पिंजरे में एक कूड़े के भीतर microbiome के सांप्रदायिक बंटवारे के लिए सबूत प्रदान की है । इस प्रकार, प्रोबायोटिक्स के साथ प्रयोग के लिए उपचार समूहों पिंजरों से अलग किया जाना चाहिए पार संदूषण के माध्यम से परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करते हैं । पालक बांधों के उपयोग पर विचार किया जा सकता है अगर एक प्रयोग के लिए एक कूड़े की स्थापना के भीतर स्थापित किया जा रहा है, लेकिन फोस्टर बांध और अस्वीकृति से कम देखभाल की तरह मिल प्रभाव का मूल्यांकन किया जाना चाहिए और के लिए अनुकूलित । जब तक चूहों gavaged जब तक डॉल 8 को छह दिन के लिए अनुपचारित छोड़ दिया गया और डॉल 14 पर आंतों के डीएनए का विश्लेषण किया गया, तो लगभग 10 प्रतियां एल. पी. आई (5 चित्रा) मिलीं । इस प्रकार, एल. पी. के औपनिवेशीकरण क्षणिक होना पाया गया और पता लगाने वाली जनसंख्या समय के साथ कम हो गई.
चित्रा 1 . असिरूप प्रक्रिया (उरोस्थि के निचले छोर) और थूथन सुई के लिए अंकन अधिकतम प्रविष्टि बनाने के लिए के बीच की लंबाई को मापने. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 . lp प्राइमरों और ATCC lp डीएनए का उपयोग कर स्थापित मानक वक्र । ATCC एलपी डीएनए के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने अध्ययन में इस्तेमाल प्राइमरों के लिए गतिशील जासूसी रेंज स्थापित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 . एल. पी. प्रवर्धन से आंतों के डीएनए के लिए डॉल 10 पिल्ले के बीच व्यवहार किया गया 2 और राजभाषा gavages अनुसूचित में हर दिन (7 खुराक) और हर दूसरे दिन (4 खुराक). हर दूसरे दिन Gavaging हर दिन Gavaging के साथ तुलना में उच्च आंत्र LP दिखाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . एल. डी. से आंत्र डीएनए के प्रवर्धन 10 पिल्ले 2 इलाज और 4 पिल्ले के एक कूड़े में 2 अनुपचारित के साथ. gavage (7 खुराक) हर दिन अनुसूचित gavages में राजभाषा 2 और राजभाषा के बीच था । दो प्रोबायोटिक इलाज पिल्ले की उंमीद प्रवर्धन प्रोफ़ाइल दिखाओ । अनुपचारित पिल्ले एल एम के चर प्रवर्धन दिखाने के एक कूड़े के भीतर प्रोबायोटिक जीव के सांप्रदायिक बंटवारे का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 . एल. पी. प्रवर्धन से आंतों के डीएनए के प्रति डॉल 14 पिल्ले के बीच इलाज किया (7 खुराक) और हर दूसरे दिन (4 खुराक) अनुसूचित gavages में राजभाषा 2. एल. पी. लोड नीचे गिरता है 28 चक्र 6 दिनों के पोस्ट पिछले प्रोबायोटिक gavage के पाठ्यक्रम पर एल पी एस की मंजूरी का संकेत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| चरण | तापमान | समय |
| 1 | ५० ° c | 2 मिनट |
| 2 | ९५ ° c | 3 मिनट |
| 3 | ९५ ° c | 30 सेकंड |
| 4 | ५८ ° c | 30 सेकंड |
| 5 | ७२ ° c | 30 सेकंड |
तालिका 1. qPCR प्रवर्धन शर्तें । पीसीआर रिएक्शन के लिए तापमान और चक्र की स्थिति की संख्या ।
| लक्ष्य | 16S-23S intergenic स्पेसर क्षेत्र |
| अपेक्षित अंश आकार | १४४ बीपी |
| प्राइमरी टीएम | ५८ ˚ C |
| फॉरवर्ड प्राइमर (एफ पी) | Lpn-1: TGG एटीसी एसीसी टीसीसी TTT CTA AGG AAT |
| रिवर्स प्राइमर (आरपी) | Lpn-2: टीजीटी TCT CGG TTT बिल्ली ताट गाा एएए ATA |
तालिका 2. qPCR प्रतिक्रिया के घटकों का विवरण । प्राइमरों पर विवरण, पीसीआर प्रतिक्रिया में उनके एनीलिंग तापमान और अपेक्षित टुकड़ा आकार ।
| एकाग्रता | 10 µ l रिएक्शन | 20 µ l रिएक्शन | |
| टेंपलेट डीएनए | २०० pg/µ एल | 1 µ l | 1 µ l |
| SYBR मास्टर मिक्स | - | 5 µ l | 10 µ l |
| Fp | १० µ मी | ०.३ µ l | ०.६ µ l |
| आरपी | १० µ मी | ०.३ µ l | ०.६ µ l |
| डीएच२हे | - | ३.४ µ l | ८.८ µ l |
तालिका 3. प्रति प्रतिक्रिया मात्रा और सांद्रता । प्रतिक्रियाओं के लिए पुनर्अभिकर्ताओं और संस्करणों की एकाग्रता ।
Discussion
IE gavage की प्रक्रिया को सुरक्षित रूप से नवजात चूहों के लिए एक प्रोबायोटिक की एक विशिष्ट खुराक प्रशासन के लिए विकसित किया गया था । तरल की छोटी मात्रा में ऊपरी जठरांत्र पथ को वितरित कर रहे है एक खिला सुई का उपयोग करने के लिए आकांक्षा को रोकने जबकि विश्वास में खुराक की डिलीवरी सुनिश्चित करने । चूहों की आंतों को औपनिवेशीकरण एनालिसिस के लिए दो और छह दिन पोस्ट gavage के लिए एकत्र किया गया. डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रक्रिया प्रोबायोटिक ग्राम पॉजिटिव जीव की उच्च उपज सुनिश्चित करने के लिए संशोधित किया गया था । डीएनए के qPCR विश्लेषण से दो दिन बाद निकाले गए पिछले gavage के चूहों 2-8 के बीच हर दिन gavaged चूहों की तुलना में हर दो दिन में एल पी एस के अपेक्षाकृत उच्च औपनिवेशीकरण दिखाया. वहाँ भी छह दिनों में एल पी की मात्रा में कमी आई, इस प्रोबायोटिक को दिखाते हुए चूहे की आंतों में एक क्षणिक जीव हो गया. इन प्रयोगों के परिणाम इस आयु वर्ग में उच्च कठोरता के साथ अनुसंधान का संचालन करने के लिए शर्तें स्थापित करते हैं ।
नवजात चूहों में प्रोबायोटिक्स के दीर्घकालिक प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए, यह डॉल 2 पर नवजात चूहों को प्रशासित किया गया था; मानव परीक्षण के लिए एक समान प्रारंभिक समय बिंदु । नवजात चूहों के Oropharyngeal खिला पहले साहित्य में वर्णित है और केवल एक अच्छी तरह से विकसित निगल यांत्रिकी के कारण आकांक्षा का खतरा कम है जब राजभाषा 5-812,17 के बाद किया गया है । हालांकि, oropharyngeal खिलाने की आकांक्षा की उच्च दर के रूप में डॉल 2 चूहों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है पायलट अध्ययन में देखा गया (डेटा नहीं दिखाया गया है) । प्रोबायोटिक और prebiotic समाधान की चिपचिपा प्रकृति आकांक्षा के जोखिम को जोड़ा । IE gavaging प्रक्रिया के बाद राजभाषा 2 में आकांक्षा के जोखिम को कम चूहों जबकि ऊपरी जठरांत्र पथ के लिए सीधे वांछित मात्रा पहुंचाने । प्रक्रिया की सफलता पहले खाद्य रंग संचार प्रोबायोटिक gavage का उपयोग कर मांय किया गया था । एक मार्कर है कि पिल्ला की त्वचा के माध्यम से दिखाई दे रहा है के रूप में खाद्य रंग कार्य करता है । भोजन के रंग के साथ चूहों gavaged में कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं मनाया गया, और यह बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले इस तरीके से gavaging प्रक्रिया को मान्य करने के लिए सिफारिश की है. हांफते हुए पलटा देखी तेजी का संकल्प पोस्ट gavage भी एक सफल gavage के लिए एक अतिरिक्त संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक बार माउस हीटिंग कंबल के बाद gavage पर रखा गया है, हांफते पलटा उपपक्ष और श्वास आवृत्ति में वृद्धि 20 सेकंड के भीतर मनाया जाएगा । 30 सेकंड से अधिक समय के लिए हांफते पलटा की निरंतरता एक असफल gavage इंगित करता है । सफल gavage भी सही पेट के हृदय लुगदी के उद्घाटन के ऊपर बैठे बल्ब के साथ खिला सुई के उचित प्रविष्टि पर निर्भर करता है । यह सुनिश्चित करना है कि असिरूप प्रक्रिया और थूथन के टिप के बीच लंबाई मापने सुई पर अंकन, gavage के दौरान माउस के थूथन पिछले जाना नहीं है द्वारा सुविधा हो सकती है । यह माउस को चोट की संभावना को कम करता है । gavage की आवृत्ति प्रयोगात्मक परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । लगातार gavaging भी पिंजरे और घोंसले के लगातार गड़बड़ी के कारण पिल्ले और मां के लिए और अधिक तनाव पैदा कर सकता है । सबसे इष्टतम gavage अनुसूची है जब gavages कम बार कर रहे है और समय की एक छोटी अवधि पर प्रणाली में अपेक्षित प्रभाव खोने के बिना । इस प्रक्रिया की सुरक्षा और बांझपन सुनिश्चित करने के लिए gavage सुई धोने और autoclaving के बीच उपयोग के द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए । बाहर एक साफ़ और autoclaving से पहले एक सिरिंज का उपयोग कर सुई के माध्यम से पानी मजबूर द्वारा अंदर का उपयोग कर बाहर पर कड़ाई से धोने के रूप में आवश्यक है किसी भी बचे हुए कणों autoclaving के दौरान सुई पर अलंकृत कर सकते हैं और gavaging प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
उच्च एल. पी. औपनिवेशीकरण पिल्ले में मनाया गया है कि हर दूसरे दिन gavaged थे जब पिल्ले gavaged की तुलना में हर दिन । इस पिल्ले gavaged पर कम तनाव के कारण हो सकता है हर दूसरे दिन और संभवतः प्रोबायोटिक अपेक्षाकृत अधिक दूध के माध्यम से अधिक पोषक तत्वों हो रही इन पिल्ले द्वारा किया जाता है । प्रोबायोटिक उपचार की खुराक निर्भरता पहले माउस मॉडल में अध्ययन किया गया है18,19 और इस प्रकार सही खुराक के प्रशासन महत्वपूर्ण है. प्रोबायोटिक समाधान तैयार CFU प्रशासित की एक सटीक गिनती पाने के लिए हर gavage से पहले चढ़ाया जाता है । यदि प्रोबायोटिक जीव anaerobic है, यह देखने के लिए अगर वहां CFU में अंतर है जब प्रसंस्कृत एरोबिक या anaerobically महत्वपूर्ण है । के बाद से एल. पी. एक facultative anaerobe है, यह दोनों तरीकों का उपयोग कर संस्कृति और CFU में कोई फर्क नहीं देखा गया था ।
पोस्ट gavage आंत्र LP लोड विश्लेषण qPCR और उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए नमूनों का उपयोग किया गया था । उपचार और नियंत्रण समूहों के बीच LP डीएनए संदूषण को कम करने के लिए, विभिन्न खिला सुई, सुरक्षा अलमारियां और शल्य चिकित्सा उपकरण उच्चतम गुणवत्ता के नमूनों को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । आंत में प्रोबायोटिक की सटीक माप एक अनुकूलित डीएनए निष्कर्षण विधि की आवश्यकता है । मल से डीएनए की निकासी के लिए सबसे कुशल तरीके कई मनका पिटाई कदम20,21,22शामिल है । यह विधि आंतों के निष्कर्षण के लिए अपनाया गया था मोतियों की धड़कन का उपयोग कर बैक्टीरिया और मनाया कम प्रतिनिधित्व (< 102 प्रतियां बरामद) एल पी एस की पूरी आंत डीएनए निष्कर्षण में. के रूप में LP सेल दीवार में peptidoglycan की एक पर्याप्त राशि के साथ एक ग्राम सकारात्मक जीव है, प्रोटोकॉल lysozyme23,24 एंजाइमी lysis बफर के लिए जोड़ा का उपयोग कर एक peptidoglycan विघटन कदम के साथ अनुकूलित किया गया था । यह दो गुना से अधिक से एक ही आंत्र नमूना में एल. पी. का प्रतिनिधित्व बढ़ा । lysozyme उपचार बाहरी परत के विघटन सुनिश्चित करता है, जबकि मनका धड़कन कदम जीव के lysis की सुविधा । ऊतक की राशि का अनुकूलन, गार्नेट मनका के प्रकार और विघटन की अवधि के मोतियों का उपयोग करने के लिए इष्टतम डीएनए उत्पादों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है पीसीआर विश्लेषण का संचालन ।
पूर्व अवधि और अवधि नवजात शिशुओं में प्रोफिलैक्सिस या उपचार के रूप में प्रशासित प्रोबायोटिक्स के सकारात्मक प्रभाव हाल के अध्ययन में सबूत है25,26,27,28. प्रोबायोटिक्स के लिए एक उचित नवजात माउस मॉडल की स्थापना के प्रोबायोटिक्स के सुरक्षात्मक प्रभाव खोलना वारंट है । इस प्रोटोकॉल यहां उल्लिखित नवजात माउस काम प्रोबायोटिक्स का उपयोग कर के साथ अपरिचित शोधकर्ताओं के लिए एक गाइड का प्रतिनिधित्व करता है । मानव स्वास्थ्य और रोग का अध्ययन करते समय कुतर microbiota के साथ मुद्दों के बावजूद, इस विधि प्रोबायोटिक्स के कारण microbiome के परिवर्तन को समझने पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान के लिए बढ़ाया जा सकता है । यह मॉडल भी विभिंन विकासात्मक चरणों के पाठ्यक्रम पर मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है ।
Disclosures
हितों का कोई विरोध प्रकट नहीं होता.
Acknowledgments
पशु देखभाल सुविधा स्टाफ और प्रशिक्षण के लिए UBC पशुचिकित्सा और बीसी बच्चों के अस्पताल अनुसंधान संस्थान में माउस काम में सहायता करने के लिए धंयवाद । अध्ययन के वित्तपोषण के लिए ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय और प्रायोगिक चिकित्सा विभाग के लिए धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
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