Summary
Deze studie een overzicht van het proces van de precieze bedragen gavaging van probiotica met neonatale muizen. De experimentele opstelling is geoptimaliseerd om te omvatten maar is niet beperkt tot probiotische doseren, methoden voor beheer, en kwantificering van bacteriën in de darmen.
Abstract
Volwassen Muismodellen hebben wijd gebruikt om te begrijpen van het mechanisme is erachter de progressie van de ziekte bij de mens. De toepasselijkheid van studies gedaan in volwassen Muismodellen neonatale ziekten is beperkt. Progressie van de ziekte, host reacties en op lange termijn gevolgen van interventies bij pasgeborenen beter te begrijpen, is een neonatale muismodel waarschijnlijk een betere pasvorm. Het spaarzame gebruik van neonatale Muismodellen kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de technische problemen van het werken met deze kleine dieren. Een neonatale muismodel werd ontwikkeld om te bepalen van de effecten van probiotische administratie in vroege leven en om te beoordelen uitdrukkelijk de mogelijkheid om kolonisatie in het darmkanaal van de pasgeboren muis. In het bijzonder om te beoordelen probiotische kolonisatie in de neonatale muis, werd Lactobacillus plantarum (LP) afgeleverd direct in het maag-darmkanaal van neonatale muis. Te dien einde werd LP toegediend aan muizen door voeding via maagsonde van intra-oesofageale (IE). Een zeer reproduceerbare methode ontwikkeld om te standaardiseren het proces van IE maagsonde waarmee een nauwkeurige administratie van probiotische doseringen terwijl het minimaliseren van trauma, een aspect met name belangrijk gezien de kwetsbaarheid van pasgeboren muizen. Beperkingen van dit proces zijn mogelijkheden voor irritatie van de slokdarm of schade en aspiratie als gavaged onjuist. Deze aanpak betekent een verbetering ten opzichte van de huidige praktijken omdat IE maagsonde in de distale slokdarm de kans op aspiratie vermindert. Naar aanleiding van maagsonde, was het profiel van de kolonisatie van de probiotische getraceerd kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) van het uitgepakte intestinale DNA met LP specifieke primers. De draagstoel van de verschillende instellingen en de technieken van het beheer van de kooi werden gebruikt voor het beoordelen van het potentieel voor kolonisatie-spread. Het protocol gegevens de fijne kneepjes van IE neonatale muis maagsonde en kwantificering van de latere kolonisatie met LP.
Introduction
Bij zuigelingen, vroege probiotische blootstelling is in verband gebracht met immunomodulerende effecten leidt tot verminderde incidentie van ziekten zoals necrotiserende enterocolitis, atopische dermatitis en sepsis1,2,3, 4 , 5. echter het mechanisme achter dit antwoord immunomodulerende is een uitdaging om te verkennen de beperking tot bemonstering in pasgeboren menselijke proeven (dat wil zeggen, sequentiële bloed trekt en biopten) gegeven. Neonatale Muismodellen kunnen helpen met het bestuderen van het werkingsmechanisme bij neonatale immuunregulatie probiotische gebruik en veranderingen in de intestinale microbiota is gekoppeld. Helaas hebben de meeste Muismodellen voor probiotica grotendeels gericht op volwassen muizen; echter, het effect van probiotica is waarschijnlijk hoogst vroeg in het leven, suggereren modellen specifiek voor deze leeftijdsgroep zal worden nuttig3,6. Daarnaast zijn neonatale Muismodellen beter geschikt om te studeren ziekten en interventies die bestemd zijn voor toepassing in het vroege leven van menselijke baby's wordt verwacht dat ze nauwer nabootsen een ontwikkelende immuun en microbiële systeem7,8 ,9,10. Het doel was het bestuderen van de omvang en de patronen van probiotische kolonisatie van neonatale muizen met een focus op de mechanistische interactie tussen de host en de microbiome. Geschikte beschrijvingen van pasgeboren modellen werden niet gevonden in de literatuur, en dus een noodzaak voor de ontwikkeling van robuuste en gestandaardiseerde methode werd aangepakt.
Gevestigde methodes van orale toediening van verschillende stoffen met pasgeboren muizen omvatten moeders overdracht van gewenste verbindingen via melk door het behandelen van de waterbron voor zwangere dammen11 of met behulp van voeding naalden om beheer van gewenste verbindingen in de orofarynx12. Deze methoden zijn handig voor experimenten die hebben geen precieze dosering vereisten en waar de behandeling wordt gemakkelijk geconsumeerd door de ontvangende muis. Probiotica worden vaak beheerd in combinatie met een prebiotisch zoals galactooligosaccharide en fructooligosaccharide (FOS), die dienen als een bron van voeding voor probiotische bacteriën; deze additieve verbindingen maken de oplossing viskeuze en uitdagend om te beheren via de bovengenoemde methoden. Het bedenken van een methode voor het beheer van de precieze hoeveelheden probiotica en prebiotica aan pasgeboren muizen beginnen zo vroeg als de eerste dag van het leven (DOL) noodzakelijk was. Tijdens het ontwikkelen van de maagsonde techniek, de mogelijkheid van kolonisatie-spread (zoals waargenomen in andere studies probiotische tussen de behandeling en de controle wapens13,14,15,16) werd getest en de relatieve overvloed van gekoloniseerde Lactobacillus plantarum (LP) in de darmen van pups met verschillende maagsonde schema's werd beoordeeld. De voorbereiding van de probiotische gebruikt in de experimenten bestond uit 109 kolonie-vormende eenheden (kve) per maagsonde van LP (ATCC-202195-stam), gemengd met FOS (prebiotische) en maltodextrine (excipiëns) zoals beschreven in de recente menselijke proef3. De levering van probiotische werd uitgevoerd met behulp van IE maagsonde en het proces wordt gedetailleerd beschreven in het protocol hieronder. Het profiel van de kolonisatie van de probiotische werd geëvalueerd aan de hand van real-time versterking van DNA geëxtraheerd uit hele darmen met behulp van specifieke primers LP.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met betrekking tot de richtsnoeren die zijn vastgelegd door het ondersteunend personeel bij het dier zorg faciliteit aan de University of British Columbia en alle procedures door het UBC Animal Care Comité zijn goedgekeurd.
1. kwantificering van probiotica beheerd
Opmerking: Deze stap wordt aanbevolen om te bepalen van het exacte bedrag van probiotische CFU die in een enkele dosis kan worden beheerd. De hoeveelheid probiotica en voertuig (FOS en maltodextrine) bepaalt de voorwaarden van de verzadiging van de oplossing. Uit ervaring, kan niet meer dan 30 µL (~ 20 mL per kg) van de vloeistof worden toegediend aan muizen op DOL 2, zoals een groter volume risico op aspiratie verhoogt.
- Zes 1,5 mL microcentrifuge buizen voorbereiden met seriële verdunningen met elke buis met 180 µL steriele 5% dextrose zoutoplossing.
- Weeg een 0.2 g aliquoot deel van een probiotische-prebiotisch mengsel en los het op in 1 mL dextrose 5% zoutoplossing in een steriele wijze.
- Vortex voor 30 seconden en Pipetteer te breken van de bosjes. Herhaal totdat er geen zichtbare klontjes in acht worden genomen.
Opmerking: Maltodextrine maakt de oplossing viskeuze en bijdragen tot de oplossing verzadiging. - Het uitvoeren van een seriële verdunning met behulp van buizen in stap 1.1 voorbereid. Vortex te mengen.
- Plaat 40 µL van elke verdunning op een gelabelde kwadrant van de MRS agarplaat. Plaat van elke verdunning in tweevoud.
- Incubeer onder anaërobe (of microaerophilic) omstandigheden bij 37 ° C gedurende 48 uur in een vacuüm jar gebruik van een gas-pack.
- Elke plaat binnen een bereik van 20-70 per Kwadrant kolonies te tellen. Gemiddelde plaat geteld met de dezelfde verdunning en terug naar de gewenste eenheden te berekenen.
2. voorbereiding van probiotica en prebiotica maagsonde
Opmerking: De juiste ontbinding van probiotische en prebiotisch is nodig om ervoor te zorgen de soepele injectie vloeistof via de voeding naald tijdens maagsonde.
- Combineer het normbedrag van gelyofiliseerd probiotische organisme met de gewenste hoeveelheid prebiotica en voertuig in een steriele microcentrifuge buis.
- Voeg toe de passende hoeveelheid oplosmiddel (5% dextrose saline) te ontbinden de probiotische-prebiotisch mengsel.
Opmerking: De capaciteit van ontbinding is beperkt door de prebiotische en voertuig gebruikt. Vanuit ervaring bereikt de synbiotic combinatie (met FOS en maltodextrine) verzadiging bij ongeveer 0,3 g/mL terwijl ontbinding in een tube van 2 mL microcentrifuge met behulp van 1 mL oplosmiddel. - Vortex te mengen totdat alle vaste stoffen zijn opgelost. Gebruik een pipet te breken bolletjes van vaste deeltjes in het oplosmiddel op en neer waarbij eveneens.
- Incubeer de oplossing in een waterbad 37 ° C gedurende 20 minuten.
Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen als de probiotische-prebiotisch oplossing wordt gemaakt uit een levende cultuur. - Plaat met een vijf series 10-fold verdunning op MRS agar platen voor maagsonde te kwantificeren nauwkeurig de probiotische toegediend aan de pup. Deze stap kan worden overgeslagen als de nauwkeurige CFU tellen is niet nodig.
3. bereiding van het biosafety kabinet
- Gebruik een kabinet bioveiligheid bij het werken met probiotica te handhaven aseptische techniek. De kooi met de dammen en pups op een Verwarming Deken (ingesteld op ongeveer 38 ° C) instellen op een helft van de deken. Plaats een schoon, lege dierlijke kooi op de andere helft van de verwarming deken.
- Plaats een ontsmet of gesteriliseerd, absorberend pad op de verwarming deken om de neiging om de muis tijdens maagsonde.
- Verzamelen van nesten materiaal voor de pups vanaf de bovenkant van de bestaande, dam-gemaakt nest en maak een nieuwe conische nesten beker met behulp van gehandschoende handen, ontsmet is met 70% ethanol en gedroogd. Plaats deze nieuwe nest in de kooi schoon, lege bedrijf. Dit vergemakkelijkt de overdracht van de geur van het nest naar de gehandschoende handen en dus minimaliseert de invoering van andere geuren op de pup tijdens het verwerken van hen voor de procedure, waardoor het risico van kannibalisatie.
- Verhuizen de pups naar de conische nest houden kooi en verwijder de kooi met de dam van het kabinet. Dit vermindert de stress op de dam door te voorkomen dat het horen van de pups tijdens de procedure.
Opmerking: Als de probiotische een bekende kolonisator van de lymfkliertest darmen is, de voorwaarden van de behandeling moeten worden gescheiden door kooien of zelfs verschillende bioveiligheid kasten om te voorkomen dat de mogelijkheid van grensoverschrijdende kolonisatie.
4. Intra-oesofageale maagsonde van neonatale muis
- Open de verpakking van de spuit voor gemakkelijke toegang. De verpakking van de naald op een steriele wijze geopend en deze koppelen aan het hoofd van de spuit. Wassen van de naald met 70% ethanol en autoclaaf vóór de ingreep. Gebruik verschillende sets van naalden voor de behandeling en de controlegroep om verontreiniging te voorkomen.
- Trekken een beetje meer dan de gewenste hoeveelheid probiotic-kleurstof oplossing in de spuit. Houdt de spuit naar boven. Vervolgens pull-down verdere en flick met vinger te verjagen bubbels en druk op de plunjer tot uitzetting van de belletjes en het extra vloeibare volume totdat het gewenste volume is bereikt. Dit zorgt ervoor dat er geen ruimte van de lucht in de naald is. Voor DOL-2-muis, de omvang van de maagsonde mag niet meer dan 30 µL.
- Plaats de pup op het steriel absorberend stootkussen op de top van de verwarming pad. De voeding naald (24 Gauge, 1" lengte van de naald, 1.25 mm bal diameter) extern gebruiken voor het meten van de lengte van de slokdarm door het plaatsen van de bal van de naald net onder de xiphoid process (onderste eind van het borstbeen). Mark de naald op het niveau van de snuit te merken van de limiet van het inbrengen van de naald (Figuur 1). Observeer de pup voor gezondheidssignalering, waaronder regelmatige ademhaling en roze verkleuring van de huid.
- Dompel het puntje van de naald in het onderdompelende oplosmiddel (5% dextrose zoutoplossing of het medium gebruikt voor het ontbinden van de probiotische en prebiotische) te smeren de externe oppervlakken van de voeding naald. Dit vergemakkelijkt de soepele binnenkomst van de naald in de slokdarm van de muis.
- Til de pup door de scruff of door het hoofd en het lichaam tussen de duim en de wijsvinger zachtjes te houden. Zorgen voor het hoofd, hals en lichaam in een rechte positie worden gehouden. Houd niet de pup door de scruff voor langer dan 60 s als er is een risico van obstructie van de trachea leiden tot verstikking. Zorg ervoor dat de pup kan ademen. Tekenen van scruffing te hard kunnen zijn onvermogen om te ademen, aanzienlijke hijgend en de tong uit de mond uitgebreid. Monitor de kleur en de ademhaling tijdens de gehele procedure van de pup.
- Plaats de lamp van de naald in het midden van de mond van de pup in een hoek van 45° op het vlak van de romp totdat zij de achterkant van de keel tot.
- Zachtjes het wijzigen van de hoek van de naald door het draaien op de bol van de naald en verplaatsen van de injectiespuit weg van de persoon van de gavaging (naar de dorsale zijde van de pup) totdat het is evenwijdig zijn aan het vlak van de wervelkolom van de pup. Scruffing de pup zorgt u ervoor dat de naald op zijn plaats in de achterkant van de keel, en voorkomt bovendien dat de muis tollen. Zorg ervoor dat de bal van de naald niet verder of het uitoefenen van druk tegen de achterkant van de keel tijdens de verandering van de hoek.
- Als de muis probeert te slikken van de naald, laat het natuurlijk Schuif naar beneden en arresteren van de beweging wanneer de markering op de naald wordt uitgelijnd met de snuit. De spuit en de naald zijn meestal zwaar genoeg om dia beneden de vervaldatum aan de zwaartekracht. Steun het gewicht van de naald te allen tijde zodat de naald dia's gemakkelijk onderaan de slokdarm met geen neerwaartse druk van de persoon die uitvoering van de maagsonde.
- Als de naald voldoet aan weerstand in de achterkant van de keel, trekken de naald van de maagsonde iets te verjagen van de bal van de naald en opnieuw hoek de naald binnenkant van de mond naar links van de muis (handler van rechts) langzaam in kleine, 1 mm stappen. De naald moet gaan gemakkelijk schuif naar beneden van de slokdarm.
- Als de naald stopt voordat de markering op de nld de mond tot, niet de oplossing injecteren.
- Houd niet de naald ingevoegd voor meer dan 20 s. Als dit gebeurt, intrekken van de naald langzaam terwijl de spuit parallel aan de romp, en laat de pup die rusten op de papieren handdoek voor 30 s tot 1 min. proberen gavaging weer na het smeren van het buitenoppervlak van de naald met het oplosmiddel.
Opmerking: Anesthesie wordt niet gebruikt voor de procedure van de muis respons is noodzakelijk om te meten van het succes van de maagsonde.
- Wanneer de markering op de voeding naald is boven de snuit en uitgelijnd met de punt van de snuit, laat niet de naald verplaatsen of om het even welk verder verder. Langzaam injecteren de gewenste hoeveelheid vloeistof. Als de vloeistof is aanzuiging of aan bubble via de neus waargenomen, de injectie onmiddellijk stoppen en langzaam het intrekken van de naald.
- Plaats de pup rechtop op de papieren handdoek op de verwarming pad om te helpen bij haar herstel. In de gaten voor verdere ademhalingsproblemen of wijzigen in de kleur van de pup die streven aangeeft. Pups die onmiddellijk hebben aanzuiging euthanaseren.
- Zodra de maagsonde voltooid is, zachtjes trekken de voeding naald onder dezelfde hoek die het is ingevoegd. Plaats de pup op de papieren handdoek op de verwarmde verwarming pad. Wacht 10 s voor de pup om normale activiteit en ademhaling patroon te herstellen. Een gezonde roze tint moet verschijnen over de pup van lichaam en de kleurstof alleen zichtbaar moet zijn in het compartiment van de maag. Zet het terug naar de kooi met de andere pups.
Opmerking: Gavaging blauwe voedselkleuring is een uitstekende manier om de praktijk van de hierboven beschreven procedure. Als de maagsonde succesvol is, zal de maag van de muis worden zichtbaar als een blauwe tint. Als de blauwe kleurstof wordt gevonden buiten de maag van de pup (nek, borst of axillaire regio), moet het dier worden humaan euthanized (volgens de dierenverzorgers regels), zoals dit blijkt uit een breuk van de slokdarm of aspiratie.
5. verzameling van intestional monsters voor analyse van de kolonisatie
- Tijdens de daaropvolgende monitoring of gavaging, fecale microbiome monsters te verzamelen van de pups.
Opmerking: De pup vaak plast en kotst wanneer gavaged en ditmaal kan worden gebruikt als een kans om te verzamelen van de fecale monsters voor analyse van de microbiome. - Voor beëindiging van experimenten, verzamelen de darmen vanaf de twaalfvingerige darm tot en met rectum na euthanasie van de pups. PIN van de pup een chirurgische Board en desinfecteren van de huid met 70% ethanol. De huid in vier kwadranten weggesneden zonder beschadiging van de peritoneale laag gebruik van hulpmiddelen die gesteriliseerd met 70% ethanol en een hete kraal sterilisatie bij 250 ° C.
- Gebruik een andere set voor steriele tools snij het buikvlies in vier kwadranten en verplaatsen van het centrum op een manier dat de viscerale organen worden blootgesteld.
- Zoek de maag en het gebruik van een klem om te knijpen onder de pyloric sphincter en aan het einde van de endeldarm. Voer de lengte van de darm met een botte gereedschap of pincet te stroomlijnen van de darm en het bevrijden van het bindweefsel en de mesenterische weefsel. Zodra de gehele lengte van de darm is vrijgemaakt van bindweefsel, gesneden op de geklemd uiteinden.
- Mark van de aluminium-folie met de oriëntatie van de darm, wikkel op een veilige manier en bevriezen bij-80 ° C.
Opmerking: De DNA-extractiemethode kan worden uitgevoerd op dit punt zonder bevriezing. De blauwe kleurstof werd ook gezien de darm meer dan 24u passeren en het verzamelen van monsters voor analyse van de kolonisatie is het beste wanneer de darmen ten minste 24 uur zijn verzameld post de laatste maagsonde. Signalen kunnen worden versterkt voordat dat timepoint door de niet-naleving bacteriën Transient passeren de maagsonde mengsel.
6. DNA-extractie van darmen kolonisatie p.a.
Opmerking: De DNA-extractie gebeurt met behulp van een commerciële kit met het optimaliseren van de aangebrachte wijzigingen op het protocol voor de darm DNA-extractie. Zorgen voor de kookplaat is ingesteld op de gewenste temperatuur en de oplossingen moeten verbouwingen of vooraf opwarming van de aarde op de juiste wijze zijn bereid.
- Voorbereiden van de enzymatische Lysis Buffer (ELB) als volgt: Maak een oplossing met 20 mM Tris-Cl, 2 mM natrium EDTA en 1,2% Triton X-100. Breng de pH op 8.0. Voeg onmiddellijk vóór gebruik ELB, lysozym aan een definitieve concentratie van 20 mg/mL.
- Weeg vooraf de granaat kralen buizen op analytische balans met de caps verwijderd.
Opmerking: Dit is gedaan zodat als de gewenste gewicht is overschreden, is het makkelijker om te verwijderen van de intestinale inhoud. - Snijd de darmen in kleine segmenten met behulp van een steriele wegwerp scalpel en schep de gewenste segmenten in de vooraf gewogen garnet kraal buizen.
Opmerking: Zorg ervoor dat scalpels tussen elke sample veranderen als DNA alomtegenwoordig is en PCR-resultaten kan beïnvloeden. - Voeg 1 mL ELB met lysozym (uit stap 6.1) aan elke buis, plaats op de vortexing kraal klopper en draaien op maximale instelling (14) voor 5 minuten.
- Zodra het weefsel wordt verstoord, de buizen overbrengen in het waterbad 37° C en incubeer gedurende 30 minuten.
Opmerking: Deze stap wordt gedaan om lysozym activeren en de verdeling van de celwand van gram-positieve bacteriën peptidoglycaan induceren. - Buizen met 20 µL van proteïnase K voorbereiden op elke sample bij een concentratie van 600 mAU per mL.
- De buizen op 400 x g gedurende 10 minuten centrifugeren. De lysate ziet er duidelijk met sommige weefsel residu op de top van de kralen.
- Breng 180 µL van supernatant (de bovenste fase) in een buis met proteïnase K en voeg vervolgens 200 µL van AL buffer aan de buis. Vortex voor 15 s te mengen.
- Plaats buizen op het blok van de verwarming bij 56 ° C gedurende 10 minuten.
- Voeg 200 µL ethanol 100% aan de buis en meng door de vortexing voor 15 s.
- Ongeveer 600 µL van lysate aan de spin kolom toevoegen (uit kit).
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g. Stroom door negeren.
- Herhaal stap 6.12 totdat alle lysate is opgesteld door de kolom.
- Plaats de kolom in een nieuwe collectie buis. Voeg 500 µL van AW1 buffer en centrifuge op 8.000 x g gedurende 1 minuut.
- Gooi de stroom door. Voeg 500 µL van AW2 buffer en centrifuge op 8.000 x g gedurende 3 minuten.
- Negeren van de stroom door en centrifugeren van de kolom in een lege collectie buis bij 8.000 x g gedurende 3 minuten.
- De kolom overbrengen in DNA elutie buis. Voeg 60 µL van het PCR rang ultrazuiver water rechtstreeks op het membraan en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Gebruik de voorverwarmde elutie-water bij 37 ° C te elueren. De elutie kan worden gedaan tweemaal door met behulp van de helft van het laatste elutievolume en herhalende stap 6.15 tweemaal te verhogen van de opbrengst.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g tot Elueer DNA.
- Het meten van de concentratie van het DNA geëlueerd met behulp van de methode van de gewenste kwantificering. De extractie proces opbrengsten zijn in de range van 10-40 ng/µL DNA.
- Winkel de eluted DNA bij-20 ° C.
7. qPCR setup
- PCR voorwaarden
- Inschakelen van de machine en laadt het programma in tabel 1 in een real-time qPCR machine.
- Loop de stappen 3 tot en met 5 in tabel 1 voor 40 cycli en houd het monster bij 4 ° C aan het einde van de reactie.
- PCR experimentele opstelling
- Gebruik de inleidingen en de temperatuur die zijn vermeld in tabel 2. Gebruik de concentraties en de omstandigheden vermeld in tabel 3. Elke reactie in drievoud naar besturingselement voor procedurele variatie instellen.
- Plaats de PCR reactie buizen/plaat in het qPCR-systeem en de run het programma in het systeem van stap 7.1 geladen.
- Verwijderen van de buis aan het einde van de termijn, plaats het op 4 ° C en voorbereiden van gel laden.
8. kwantificering van LP kolonisatie
- QPCR mixen voorbereiden met 10 µL of 20 µL reacties volgens tabel 3.
- LP genomic DNA standaard curve 107 tot 101 kopieën/µL
Opmerking: Aangezien 4 µL van elke verdunning zal worden bekleed, 107 exemplaren in 4 µL of 2.5 x 106 exemplaren per µL is vereist in de begin voorraad. Gebruik hetzelfde principe voor de rest van de curve.- Maak een verdunning 1:4:107 exemplaren per µL in 50 µL.
3.147 µL van LPDNA + 46.85 µL van dH2O = 2,5 x 106 exemplaren per µL - Serieel verdunnen 10-fold: Voeg 5 µL op 45 µL dH2O voor 1.25 x 105 exemplaren/µL.
- Plaat 4 µL per verdunning per putje.
- Maak een verdunning 1:4:107 exemplaren per µL in 50 µL.
- Visualisatie van LP waarbij
- Gebruik van een 2% agarose gel te bereiken van een duidelijke scheiding van de ~ 197 bp LP versterkte fragment.
- Laden 9 µL van elke PCR product in de gel.
- Stel de gel gedurende 30 minuten bij 120 V.
Representative Results
De uniciteit van deze methode ligt in de aanpassing van de gavaging-techniek om de grootte en broosheid van een neonatale muis. Het vorige gedeelte beschreven de belangrijke stappen in het uitvoeren van een succesvolle maagsonde procedure op een DOL 2-muis. Om een goede kwantificering schaal, werd een standaard curve gegenereerd met behulp van pure LP DNA met drie technische replicatieonderzoeken (Figuur 2). De standaard curve verschaft een dynamisch bereik van de opsporing van de LP-DNA met de inleidingen. Het dynamisch bereik was tussen 7 en 28 cycli waar een scala aan 101 tot en met 107 exemplaren van LP DNA werd ontdekt. De gestage helling van de standaard curve vertegenwoordigd de efficiëntie en schaalbaarheid van de reactie.
De procedure voor IE maagsonde is gebruikt in volwassen muizen met relatief gemak. Echter de bovenste gastro-intestinale tractus van een neonatale muis is kwetsbaar en vereist gekalibreerde bewegingen van de maagsonde naald tijdens de procedure. Herhaalde gavages zou kunnen vergroten de kans op irritatie van de intra-oesofageale, schade en storingen of afwijzing door de dam als gevolg van de behandeling. Dus, twee verschillende gavaging planningen zijn getest en de intestinale kolonisatie werd gekwantificeerd aan de hand van DNA uit de hele darm homogenates. Muizen waren gavaged van DOL 2 t/m 8 van de DOL met probiotische toegediend elke dag of om de twee dagen (Figuur 3). Elk monster bevatte een technische repliceren en elke aandoening had ten minste twee biologische replicatieonderzoeken. De pups gavaged had elke dag met 7 doses ongeveer 103 exemplaren van LP, overwegende dat de pups gavaged om de twee dagen met 4 doses had ongeveer 105 exemplaren. De consistentie van de resultaten tussen de duplo's Voeg krediet toe aan de precisie van techniek. Er was meer LP gedetecteerd in de darmen van pups gavaged om de twee dagen in vergelijking met pups die waren gavaged elke dag. Gezien dit, latere experimenten opgezet met een maagsonde schema van elke andere dag als het vermindert ook de stress voor de pups.
Het is belangrijk om te voorkomen dat intra-nest probiotische Kruis besmetting bij het werken met probiotica. De microbiome van nestgenoten verwachtte lijkt als ze dezelfde moeder en nesten milieu delen. Dit blijkt een probleem voor probiotische studies als de behandeling en de controlevoorwaarden aanwezig binnen het zelfde nest waren als het organisme probiotische de potentie heeft om een deel van de microbiota ("kolonisatie verspreid '). Om te bepalen als een probiotische zal besmetten en onbehandelde nestgenoten koloniseren, was de helft van een nestje gavaged als hierboven en de darmen waren verzameld voor qPCR. Intestinale qPCR analyse van DOL 10 muizen bleek de verwachte versterking van LP DNA in de gavaged muizen, maar ook, in mindere mate in de niet-gavaged nestgenoten (Figuur 4). De darmen van de dezelfde DOL muizen uit een onbehandelde kooi toonde geen versterking of minimale versterking op cycles groter is dan 32. Dit leverde bewijs voor de gemeenschappelijke delen van het microbiome binnen een nest in een kooi. Dus, voor experimenten met Probiotica moeten de behandeling in groepen worden gescheiden door kooien aan besturingselement voor variabiliteit door kruisbesmetting. Het gebruik van foster dammen kan worden beschouwd als een experiment worden opgericht moet binnen de instelling van een nestje, maar verstorende effecten zoals verminderde zorg vanaf de foster dam en verwerping moet worden geëvalueerd en geoptimaliseerd voor. Wanneer muizen gavaged totdat DOL 8 werden verlaten onbehandeld voor zes dagen en het intestinale DNA werd geanalyseerd op DOL 14, bleken ongeveer 10 exemplaren van LP (Figuur 5). Dus, de kolonisatie van LP bleek te zijn van voorbijgaande aard en de detecteerbare bevolking afgenomen na verloop van tijd.
Figuur 1 . Het meten van de lengte tussen de xiphoid process (onderste uiteinde van het borstbeen) en de snuit om maximale invoeging markering naar de speld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Standaard curve ingesteld met behulp van LP primers en ATCC LP DNA. Een seriële verdunning van het ATCC LP DNA werd gemaakt om het dynamisch detecteerbare bereik voor de inleidingen gebruikt in de studie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . LP versterking van intestinale DNA van DOL 10 pups tussen DOL 2 en DOL 8 in geplande gavages elke dag (7 doses) en behandeld om de andere dag (4 dosissen). Gavaging om de andere dag bleek hoger intestinale LP in vergelijking met de gavaging elke dag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . LP versterking van intestinale DNA van DOL 10 pups met 2 behandeld en 2 onbehandeld in een nestje van 4 pups. De maagsonde was tussen DOL 2 en DOL 8 in geplande gavages elke dag (7 doses). De twee probiotische behandeld pups Toon de verwachte versterking-profiel. De onbehandelde pups Toon variabele versterking van LP die aangeeft gemeenschappelijke delen van het organisme probiotische binnen een nestje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . LP versterking van intestinale DNA van DOL 14 pups tussen DOL 2 en DOL 8 in geplande gavages elke dag (7 doses) en behandeld om de andere dag (4 dosissen). De LP belasting druppels onder cyclus 28 Goedkeuringvande van het aangeeft in LP in de loop van 6 dagen post laatste probiotische maagsonde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Stap | Temperatuur | Tijd |
| 1 | 50 ° C | 2 minuten |
| 2 | 95 ° C | 3 minuten |
| 3 | 95 ° C | 30 seconden |
| 4 | 58 ° C | 30 seconden |
| 5 | 72 ° C | 30 seconden |
Tabel 1. qPCR amplificatie voorwaarden. De temperatuur en het aantal cyclus voorwaarden voor de PCR-reactie.
| Doel | 16S-23S intergenic spacer regio |
| Verwachte fragment grootte | 144 bp |
| Primer Tm | 58˚C |
| Voorwaartse primer (FP) | LPN-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT |
| Omgekeerde primer (RP) | LPN-2: TGT TCT CGG TTT CAT TAT GAA AAA ATA |
Tabel 2. Details van onderdelen van de reactie qPCR. De details over de inleidingen, de onthardende temperatuur en verwachte fragment grootte in de PCR-reactie.
| Concentratie | 10 µL reactie | 20 µL reactie | |
| Sjabloon DNA | 200 pg/µL | 1 ΜL | 1 ΜL |
| SYBR Master Mix | - | 5 ΜL | 10 ΜL |
| FP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0.6 ΜL |
| RP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0.6 ΜL |
| dH2O | - | 3.4 ΜL | 8.8 ΜL |
Tabel 3. Per reactie volumes en concentraties. De concentratie van reagentia en volumes voor reacties.
Discussion
De procedure voor IE maagsonde werd ontwikkeld om het veilig toedienen van een bepaalde dosis van een probioticum aan neonatale muizen. Kleine hoeveelheden vloeistof worden afgeleverd bij de bovenste gastro-intestinale tractus met behulp van een voeding naald om te voorkomen dat streven waarbij de levering van de dosering in vertrouwen. De darmen van de muizen werden verzameld voor kolonisatie analyse twee en zes dagen post maagsonde. De procedure voor DNA-extractie is bewerkt zodat hoog rendement van de probiotische gram-positieve organismen. De analyse van de qPCR van DNA geëxtraheerd twee dagen post laatste maagsonde toonde relatief hogere kolonisatie van LP in muizen gavaged om de twee dagen in vergelijking met muizen die gavaged dagelijks tussen DOL 2-8. Er was ook een daling van de hoeveelheid LP over zes dagen, tonen deze probiotische als een voorbijgaande organisme in de darmen van de muis. De resultaten van deze experimenten vaststellen van de voorwaarden voor onderzoek met hoge strengheid in deze leeftijdsgroep.
Om te zien hoe de langetermijneffecten van probiotica bij pasgeborenen muizen, werd het toegediend aan neonatale muizen op DOL 2; een soortgelijke begintijd wijzen op de menselijke proef. Orofaryngeale voederen van neonatale muizen is eerder beschreven in de literatuur en verricht nadat DOL 5-812,17 wanneer het risico op aspiratie lager als gevolg van een goed ontwikkelde slikken mechanica is. Zo is de orofaryngeale voederen echter niet geschikt voor DOL 2 muizen zoals hogere tarieven van aspiratie werden waargenomen in de pilot-studie (gegevens niet worden weergegeven). De viskeuze aard van de probiotische en prebiotisch oplossing toegevoegd aan het risico op aspiratie. Volgens de procedure van IE gavaging tot een minimum beperkt het risico op aspiratie in DOL 2 muizen terwijl het leveren van het gewenste volume rechtstreeks naar de bovenste gastro-intestinale tractus. Het succes van de procedure was eerst gevalideerd met behulp van voedselkleuring geïnfundeerd probiotische maagsonde. De voedselkleuring fungeert als een marker die zichtbaar is via de huid van de pup. Geen schadelijke effecten werden waargenomen in muizen gavaged met voedsel kleuren, en het wordt aanbevolen voor het valideren van de gavaging procedure op deze manier vóór grootschalige experimenten. De snelle oplossing van de maagsonde reflex gezien post hijgend kan ook worden gebruikt als extra indicator voor een succesvolle maagsonde. Zodra de muis is geplaatst op de verwarming deken na maagsonde, de hijgend reflex zal verdwijnen en een toename in de frequentie van de ademhaling zal worden waargenomen binnen 20 seconden. De voortzetting van de hijgend reflex langer dan 30 seconden geeft aan een mislukte maagsonde. Succesvolle maagsonde hangt ook passende invoeging van de voeding naald met de lamp zit pal boven de opening van de hartsfincter van de maag. Dit kan worden vergemakkelijkt door ervoor te zorgen dat de markering op de naald meet de lengte tussen de xiphoid process en het uiteinde van de snuit, gaat niet voorbij de snuit van de muis tijdens maagsonde. Dit minimaliseert de kans op schade aan de muis. De frequentie van de maagsonde kan een significant effect hebben op de experimentele resultaten. Frequente gavaging kunt ook meer stress voor de pups en de moeder als gevolg van de voortdurende verstoring van de kooi en de nest maken. De meest optimale planning van de maagsonde is wanneer de gavages de minste frequent zijn en over een kortere duur van tijd zonder verlies van het verwachte effect in het systeem. Om te zorgen voor de veiligheid en steriliteit van de procedure de maagsonde moet naald door wassen en autoclaaf tussen gebruik worden gesteriliseerd. Wassen strikt aan de buiten met een scrub en de binnenkant door het dwingen van water door de naald met een injectiespuit voordat autoclaaf nodig is als alle overgebleven deeltjes op de naald tijdens autoclaaf encrust kunnen en met de procedure gavaging interfereren kunnen.
Hogere LP kolonisatie werd waargenomen in pups die gavaged waren van elke andere dag wanneer vergeleken bij pups gavaged elke dag. Dit kan zijn als gevolg van de verminderde stress op pups gavaged om de andere dag en potentieel de probiotische krijgt meer voedingsstoffen via de relatief meer melk ingenomen door deze pups. De afhankelijkheid van de dosis van probiotische behandeling eerder is onderzocht in18,19 van de modellen van de muis en het beheer van de juiste dosering is dus belangrijk. De oplossing van de probiotische bereid is verguld vóór elke maagsonde om een nauwkeurige aantal KVE toegediend. Als het organisme probiotische anaërobe is, is het belangrijk om te zien of er verschil in CFU wanneer aëroob of anaëroob gekweekt. Aangezien LP een Facultatief anaeroob is, het werd gekweekt met behulp van beide methoden en geen verschil in CFU werd waargenomen.
De post maagsonde analyse voor belasting van intestinale LP werd gedaan met behulp van qPCR en kwalitatief hoogwaardige DNA-monsters. U wilt minimaliseren LP DNA besmetting tussen de behandeling en de controlegroepen, verschillende naalden, voederen bioveiligheid kasten en chirurgische apparatuur werden gebruikt om de hoogste kwaliteit monsters. De nauwkeurige meting van de probiotische in de darm vereist een geoptimaliseerde DNA-extractiemethode. Meest efficiënte methoden voor de extractie van DNA uit ontlasting omvat meerdere kraal verslaan stappen20,21,22. Deze methode was vastgesteld voor de extractie van intestinale bacteriën met behulp van de kraal kloppend en verminderde vertegenwoordiging waargenomen (< 102 exemplaren hersteld) van LP in de hele darm DNA-extractie. Als LP een Gram-positieve organismen met een aanzienlijke hoeveelheid peptidoglycaan in de celwand is, was het protocol met een peptidoglycaan ontbinding stap met behulp van lysozym23,24 toegevoegd aan de enzymatische lysis-buffermengsel geoptimaliseerd. Dit stegen de vertegenwoordiging van LP in hetzelfde intestinale monster groter is dan twee-voudige. De lysozym behandeling verzekert de ontbinding van de buitenste laag, terwijl de kraal verslaan stap de lysis van het organisme vergemakkelijkt. Optimalisatie van hoeveelheid weefsel, het type granaat kralen en de duur van de onderbreking met behulp van de kralen is noodzakelijk voor het verkrijgen van optimale DNA producten om uit te voeren van de PCR-analyse.
Het positieve effect van probiotica toegediend als profylaxe of behandeling bij de pre en termijn pasgeborenen blijkt in recente studies25,26,27,28. De oprichting van een juiste neonatale muismodel voor probiotica is gerechtvaardigd om uit te pakken van het beschermende effect van probiotica. Dit protocol hier geschetste vertegenwoordigt een gids voor onderzoekers onbekend met neonatale muis werk met probiotica. Niettegenstaande de problemen met knaagdier microbiota terwijl het bestuderen van de menselijke gezondheid en ziekte, kan deze methode worden uitgebreid tot onderzoek gericht op het begrijpen van de veranderingen van de microbiome als gevolg van probiotica. Dit model biedt ook een platform om te bestuderen van host-microbe interactie en immuunrespons in de loop van verschillende ontwikkelingsstadia.
Disclosures
Geen belangenconflict openbaar te maken.
Acknowledgments
Dank aan het personeel dier zorg faciliteit en de UBC dierenartsen voor opleiding en assisteren bij de muis werk bij BC Children's Hospital Research Institute. Dank aan de Universiteit van British Columbia en de Afdeling Experimentele Geneeskunde voor de financiering van de studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
References
- Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges. International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).
- Lin, H. C., et al. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).
- Panigrahi, P., et al. A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India. Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).
- Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development. Frontiers in Pediatrics. 5, 111 (2017).
- Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice? Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).
- Elazab, N., et al. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).
- Arrieta, M. C., et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152 (2015).
- Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges. Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).
- Qi, F., et al. Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32 (2017).
- Yang, J., et al. Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life. Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).
- Deshmukh, H. S., et al. The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice. Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).
- Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy. Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).
- Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).
- Costeloe, K., et al. A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial. Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).
- Kitajima, H., et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial. Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).
- Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG. Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).
- Preidis, G. A., et al. Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine. The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).
- Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).
- Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).
- Yu, Z., Morrison, M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).
- Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).
- Müller, A., et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).
- Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).
- Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria. Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955 (1991).
- Thomas, C. M., Versalovic, J.
- Tancredi, D. J.
- Bernardo, W. M., et al. Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis. Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).
- Aceti, A., et al. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis. Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89 (2015).
