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Neuroscience

Um protocolo para a terapia de décadas transcraniana em ratos

Published: November 18, 2018 doi: 10.3791/59076
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5,6, 1, 1, 7, 8,9,10, 1
1Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 2ProNeuroLIGHT LLC, 3LiteCure LLC, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Depression Clinical and Research Program, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 6Center for Anxiety and Traumatic Stress Disorders, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 7Research Institute for Applied Physics and Astronomy, University of Tabriz, 8Department of Medical Physics, Tabriz University of Medical Sciences, 9Department of Medical Bioengineering, Tabriz University of Medical Sciences, 10School of Medical Sciences, University of Aberdeen

Summary

Décadas de terapia é uma inovadora modalidade não-invasiva para o tratamento de uma ampla variedade de desordens neurológicas e psiquiátricas e também pode melhorar a função cerebral saudável. Este protocolo inclui um guia passo a passo para executar décadas de cérebro em ratos pela entrega de luz transcraniana, que pode ser adaptada para uso em outros roedores de laboratório.

Abstract

Transcraniana décadas é uma abordagem terapêutica não invasiva inovadora potencial para melhorar bioenergética do cérebro, a atividade cerebral em uma ampla variedade de desordens neurológicas e psiquiátricas e realce da memória em declínio cognitivo relacionados com a idade e doenças neurodegenerativas. Descreveremos um protocolo do laboratório para a terapia de décadas transcraniana (PBMT) em ratos. Envelhecido camundongos BALB/c (18 meses de idade) são tratados com um 660 nm laser transcranially, uma vez ao dia por 2 semanas. Dados de transmitância do laser mostram que aproximadamente 1% da luz incidente sobre o couro cabeludo vermelho atinge uma profundidade de 1 mm da superfície cortical, penetrando o hipocampo dorsal. Os resultados do tratamento são avaliados por dois métodos: um Barnes labirinto teste, que é um hipocampo-dependente espacial aprendizagem e memória tarefa avaliação, e medição de níveis de ATP hipocampo, que é usado como um índice de Bioenergética. Os resultados da tarefa de Barnes mostram um aumento da memória espacial em ratos envelhecidos do laser-tratado quando comparado com a idade-controles. Análise bioquímica após tratamento com laser indica aumento dos níveis de ATP hippocampal. Podemos postular que a melhoria do desempenho da memória é potencialmente devido a uma melhoria no metabolismo de energia hippocampal induzida pelo tratamento a laser vermelho. As observações em camundongos poderiam ser estendidas a outros modelos animais, desde que este protocolo potencialmente poderia ser adaptado para outras espécies frequentemente usados em neurociência translacional, tais como o coelho, gato, cachorro ou macaco. Transcraniana décadas é uma modalidade segura e econômica, que pode ser uma promissora abordagem terapêutica no comprometimento cognitivo relacionados com a idade.

Introduction

PBMT, ou terapia de luz laser de baixo nível (LLLT), é um termo geral que refere-se a métodos terapêuticos baseados a estimulação de tecidos biológicos pela energia luminosa do laser ou diodos emissores de luz (LEDs). Quase todos os tratamentos de PBMT são aplicados com vermelho a luz infravermelha (NIR) em comprimentos de onda de 600 a 1100 nm, uma potência variando de 1 a 500 mW e uma fluência que variam de < 1 a > 20 J/cm2 (veja Chung et al.1).

Transcranial PBMT é um método de entrega de luz não-invasiva que é conduzido por irradiação da cabeça usando um externo fonte de luz (laser ou LEDs)2. Para aplicações de animais, este método inclui contacto ou sem contacto colocação da sonda LED ou laser na cabeça do animal. Dependendo da região de interesse terapêutica, uma sonda de luz pode ser colocada sobre a cabeça inteira (para cobrir todas as áreas do cérebro) ou sobre uma parte específica da cabeça, como a região pré-frontal, frontal ou parietal. A transmissão parcial de luz vermelha/NIR através do couro cabeludo, crânio e dura-máter pode alcançar o nível da superfície cortical e fornecem uma quantidade de energia do photon suficiente para produzir benefícios terapêuticos. Posteriormente, a fluência de luz entregue a nível cortical iria ser propagada em matéria cinza e branca do cérebro até atingir as estruturas mais profundas do cérebro3.

Luz das bandas espectrais em vermelho para far-red (600-680 nm) e região NIR precoce (800-870 nm) corresponde o espectro de absorção da citocromo c oxidase, a enzima terminal da cadeia respiratória mitocondrial4. Supor que PBMT no espectro vermelho/NIR provoca photodissociation do óxido nítrico (NO) da citocromo c oxidase, resultando em aumento do transporte de elétrons mitocondrial e, em última análise, aumentou a geração de ATP5. Em relação aos aplicativos neuronais, os potenciais benefícios de neurostimulatory do cérebro PBMT usando transcraniana irradiação métodos têm sido relatados em uma variedade de estudos pré-clínicos, incluindo modelos de roedores de cerebral traumática lesão (TBI)6, AVC agudo7, a doença de Alzheimer (AD)8, a doença de Parkinson (PD)9, depressão10e envelhecimento11.

Envelhecimento cerebral é considerado uma condição neuropsicológica que afeta negativamente a algumas funções cognitivas, como memória e aprendizagem12. As mitocôndrias são as organelas primárias responsáveis pela produção de ATP e bioenergética neuronal. Disfunção mitocondrial é conhecida para ser associado com déficits relacionados com a idade, em áreas do cérebro que estão ligadas à memória de navegação espacial, tais como o hipocampo,13. Porque o tratamento craniano com vermelho/NIR luz principalmente atos pela modulação de bioenergética mitocondrial, doses suficientes de luz entregues para o hipocampo podem resultar na melhoria da memória espacial resultados14.

O objectivo do protocolo atual é demonstrar o procedimento PBMT transcraniana em ratos, utilizando baixos níveis de luz vermelha. As medições de transmissão de luz de laser necessária através dos tecidos cabeça de ratos envelhecidos são descritas. Além disso, labirinto de Barnes, como uma aprendizagem espacial do hipocampo-dependente e memória tarefa e hippocampal níveis de ATP, como um índice de bioenergética, são utilizados para uma avaliação sobre o impacto do tratamento nos animais.

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Protocol

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do National Institutes of Health (NIH; Publicação n º 85-23, revista em 1985) e aprovado pelo Comitê de ética regionais de Ciências da Universidade de Tabriz Medical.

Atenção: Este protocolo inclui a aplicação de instrumentos de laser classe 3B e exigirá uma formação adequada e aderência às diretrizes de segurança. Lasers de classe 3B podem danificar gravemente os olhos e podem aquecer a pele. Lasers de classe 3B não são considerados um risco de queimaduras. Óculos de proteção de olho é obrigatório em todos os momentos quando operar o dispositivo a laser.

1. experimentos de transmissão de luz de laser

Nota: Usado aqui três camundongos BALB/c machos de 18 meses de idade foram obtidos da instalação de animais da Universidade de Tabriz Medical Sciences. Um laser de 60 mW (660 nm) com um feixe circular forma de 2,5 mm de diâmetro é usada como a fonte de luz. A fonte de laser produz uma luz circularmente polarizada com um perfil de intensidade Gaussian e é operada no modo de onda contínua. Um medidor de energia do fotodiodo comercial com uma resolução de nW 10, uma área ativa de quadrados de 1 cm2 fotodíodo e uma faixa de resposta espectral de 400 a 1100 nm é usado para medir a potência de luz transmitida através das amostras.

  1. Preparação da amostra
    1. A fim de obter amostras frescas, anestesia profundamente o mouse com uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg).
    2. Disse a cabeça do rato com tesoura regular, começando do ponto localizado logo acima dos ombros.
    3. Gire a cabeça de modo que o lado ventral da mandíbula voltado para. Deslize a tesoura angulada dissecação lisamente através da cavidade oral até a resistência da junção mandibular é notada. Corte todos os músculos grandes, vinculando o osso maxilar inferior ao crânio e descartá-las.
    4. Remova os ossos palatinos, usando tesouras de dissecação em ângulo.
    5. Descarte toda a carne em torno do crânio, utilizando pinças curvas.
    6. Dissecar a parte inferior do crânio e depois, cuidadosamente o osso remanescente do crânio, o cérebro com uma espátula curva.
    7. Reparar o tecido cerebral intacta em um gel de agarose 2% assim o tecido será apropriado para cortar.
      Nota: A fim de obter um crânio intacto, além do couro cabeludo amostra, o tecido cerebral deve ser removido do lado ventral da cabeça do animal sem nenhum dano para a porção dorsal da cabeça.
  2. Procedimento de corte de cérebro
    1. Espalhe uma gota de supercola (~0.05 mL) na superfície do bloco de montagem de vibratome.
    2. Cuidadosamente coloque o agarose do vibratome bloco de montagem, para que a superfície ventral do cérebro é virado para baixo e ajustar a sua posição.
    3. Ligeiramente coincidir com a lâmina de vibratome para a superfície superior do bloco de agarose e registre o valor do cortador como nível primário.
    4. Encha o depósito de vibratome com solução salina normal gelada.
    5. Ajuste os parâmetros de vibratome (por exemplo, a fatia espessura [1], velocidade [5 de 5 unidade do dispositivo] e frequência de vibração [5 de 5 unidade do dispositivo]) para obter o corte satisfatório.
    6. Corte o cérebro transversalmente em uma fatia com uma espessura de 1.000 µm.
      Nota: A fatia é a parte do tecido cerebral delimitado pela superfície cortical e um avião posicionado 1.000 µm inferior à superfície cortical (o hipocampo dorsal).
    7. Adicionar uma gota de água (~0.05 mL) na superfície de vidro óptico e colocar a fatia de cérebro em cima dela. Em seguida, adicione uma gota de água no cérebro fatia e coloque cuidadosamente o segundo vidro óptico em cima dela.
      Nota: Uma gota de água deve ser adicionada aos limites de vidro de amostra, para evitar a secagem de tecido e luz espalhamento de superfícies ásperas.
  3. Medida de transmissão de luz através dos tecidos da cabeça
    1. Configure o equipamento óptico, incluindo o dispositivo a laser, refletindo os espelhos e unidade de medidor de energia.
      Atenção: Usar óculos de proteção de olho antes de ligar o laser.
    2. Na ausência de uma amostra sobre o medidor de energia, ligue o dispositivo a laser e focar o feixe de laser que está localizado a distância adequada para orientar o feixe perpendicular à área ativa do fotodiodo espelho.
      Nota: As medições de transmissão de luz devem ser realizadas em um quarto escuro, à temperatura ambiente (23-25 ° C), até 30 min após os cabeça tecidos foram extraídos.
    3. Realizar medições sobre o tecido cerebral em fatias.
      1. Coloque dois vidros óticos em branco sobre a superfície do medidor de energia.
      2. Leia a potência de luz transmitida (eu0) do medidor de energia ecrã e registre o valor.
      3. Delicadamente Coloque a amostra do cérebro, que é abarcada por dois vidros óticos, na superfície do medidor de energia, focar o feixe na respectiva área do tecido, leia a potência transmitida e registre o valor.
    4. Realizar medições sobre o crânio e o couro cabeludo.
      1. Coloque um vidro ótico em branco sobre a superfície do medidor de energia.
      2. Leia a potência de luz transmitida (eu0) do medidor de energia ecrã e registre o valor.
      3. Levemente Coloque um vidro ótico com crânio fresco plus couro cabeludo tecido na superfície do medidor de energia, coincidir com o feixe de luz na zona de bregma, leia a potência transmitida e registre o valor.
      4. A fim de maximizar a relação sinal-ruído, repita a medição de transmissão de luz de pelo menos 3 x para todas as amostras.
        Nota: A zona de bregma é colocada em uma cerca de 3 mm rostral uma linha traçada através da base anterior das orelhas. A espessura do crânio e couro cabeludo mais tecido é medida por um paquímetro padrão.

2. décadas terapia (PBMT)

Nota: Quarenta e cinco camundongos BALB/c masculinos, atribuídos a três grupos de 15 ratos cada foram usados. Os grupos foram compostos de jovens-controle ratos (2 meses de idade) que recebeu sham-PBMT, ratos envelhecidos-controle (18 meses de idade) que recebeu sham-PBMT e ratos de idosos-PBMT (18 meses de idade) que receberam PBMT. O tratamento de Souza-PBMT consistia de tratamento idêntico do PBMT grupo, mas com o laser inativo. Os ratos foram obtidos da instalação de animais, de Ciências da Universidade de Tabriz Medical e foram alojados no animal segurando a unidade de centro de pesquisa de Neurociências (NSRC) em 24-25 ° C e 55% umidade relativa, com uma luz de 12 h e fotoperíodo escuro de 12 h. Comida e água foram fornecidos ad libitum. Todos os ratos foram aclimatados para pelo menos 1 semana antes do tratamento.

  1. Procedimento de tratamento do laser
    Nota: Um laser de diodo GaAlAs com modo de onda contínua no comprimento de onda de 660 nm foi usado para o tratamento de PBMT transcraniana. O dispositivo a laser foi operado em uma potência de 200 mW ± 2 e uma irradiância de 6,66 W/cm2, com um tamanho de ponto de 0,03 cm2. Uma fluência média de 99,9 J/cm2 por cada sessão foi entregue para a superfície do couro cabeludo por 15 s de irradiação. A irradiação foi administrado 1 x diariamente por 2 semanas consecutivas.
    1. Traga os ratos em jaulas em casa para a sala de terapia, aproximadamente 20 min antes do início do tratamento.
    2. Conecte um protetor elétrico à tomada de parede.
    3. Insira o plugue do dispositivo do laser um surtos elétrico.
    4. Cobrir a ponta da sonda com uma película de nylon transparente do laser a fim de evitar qualquer arranhões na superfície.
    5. Ligar cuidadosamente a sonda no canal do dispositivo do laser.
    6. Ligue o dispositivo a laser e aguarde alguns segundos para a aquecer.
    7. Ajuste os parâmetros de tratamento a laser, incluindo o modo de tempo e operação de irradiação.
    8. Na ausência de quaisquer amostras, determine a potência média do laser em contato com a ponta da sonda para a área do medidor de energia ativa no dispositivo a laser. O valor de registro.
    9. Repita o processo de calibração (etapa 2.1.8) pelo menos 5x, ler os poderes incidentes desde do medidor de energia ecrã e registre os valores.
    10. Delicadamente segurar um mouse pela pele dorsal do pescoço do animal na palma de uma mão e imobilizar a sua cabeça.
      Nota: O protocolo atual, a sonda laser é colocada na zona de bregma, que é ~ 3 mm rostral uma linha traçada entre a base interna das orelhas.
    11. Levemente, coloque a ponta da sonda diretamente no couro cabeludo na linha média, cerca de 3 mm rostral uma linha traçada através da base anterior das orelhas.
      Nota: Segure a sonda em um ângulo de aproximadamente 45° ao plano do abdômen.
    12. A fim de evitar a irradiação direta para os olhos do animal, primeiro, entre em contato com a ponta da sonda na cabeça e, em seguida, ligue o dispositivo a laser.
    13. Ligar o laser e estàvel, segurar a sonda até a conclusão do tratamento por irradiação.
    14. Após o término da terapia, retirar a sonda do laser da cabeça e retornar suavemente o mouse para sua gaiola.
    15. Desligue o dispositivo a laser e desconectar a sonda do dispositivo.
    16. Limpe a sonda laser com um líquido de limpeza óptico adequado.
    17. Transferi os ratos para as instalações de animais.

3. comportamentais tarefas

  1. Teste de campo aberto
    1. Avaliar a locomoção atividade de cada rato pela distância total percorrida durante um teste de campo aberto, como descrito anteriormente a15.
  2. Tarefa de labirinto de Barnes
    1. Aparelho
      Nota: A tarefa de aprendizagem e memória espacial é executada em um labirinto de Barnes16. O aparelho utilizado para esta tarefa Neurocomportamentais consiste em uma plataforma circular, feita de madeira preta (95 cm de diâmetro) com 20 equidistante, 5 orifícios circulares cm-diâmetro localizados na plataforma, 3 cm do perímetro. O aparelho é elevado a 50 cm do chão para impedir que o animal descer. Uma caixa de fuga móveis de plástico preto (20 x 15 cm x 5 cm) é colocado sob o orifício de fuga. Um labirinto preto é usado para testes ratos brancos, e um tapete preto deve ser colocado sob o labirinto quando é usado um sistema de rastreamento de software.
      1. Coloque o aparelho de labirinto no centro de uma sala silenciosa com brilhante iluminação aérea.
      2. Coloca um sinal de "Não entre" do lado de fora da porta do quarto da tarefa.
      3. Anexe sugestões visual-espacial para as paredes de perímetro.
      4. Posicione uma câmera de vídeo digital sobre a plataforma do labirinto.
      5. Limpe a superfície da plataforma labirinto com etanol a 70% para remover indesejadas sugestões olfactory.
      6. Adicione uma pequena quantidade de roupa de cama de gaiola em casa do animal no interior da caixa de fuga para servir como uma sugestão olfativo.
    2. Sessão de adaptação
      1. Trazer cada rato para a tarefa sala cerca de 30 min antes de começar o experimento, para que o mouse para tornar-se hábito.
      2. Retire o mouse da jaula e delicadamente, coloque o animal na caixa fuga por 1 min.
    3. Sessão de treinamento
      Nota: A sessão de treino é repetido para cada rato em 4 dias consecutivos.
      1. Remova cuidadosamente o mouse da caixa de fuga.
      2. Coloque o mouse no centro da arena; em seguida, coloque a câmara iniciar na parte superior do rato.
      3. Remova a câmara de início após 10 s e permitir que o mouse para explorar a arena por 3 min.
      4. Calmamente, mova para a área de informática e colocar em fones de ouvido com cancelamento de ruído.
      5. Desencadear um estímulo auditivo negativo consistindo de um ruído branco alto de aproximadamente 80 dB no nível da plataforma e começar a gravar o mouse.
      6. Desligar o ruído branco e parar de gravar quando o mouse entra a caixa de saída. Permitir que o animal permanecer imperturbável na caixa por 1 min.
      7. Remover o mouse da caixa de fuga e colocá-lo de volta para sua jaula.
      8. Repita as etapas 3.4.2 através de 3.4.7 4x por dia, com intervalos de 3 min entre ensaios repetidos.
        Nota: Entre todos os ensaios, para eliminar qualquer urina ou fezes da arena e limpar o labirinto com etanol a 70%.
    4. Sessão experimental de sonda
      1. Após o último julgamento de treinamento, 24h depois, remova a caixa de escapar da plataforma do labirinto e repita os passos de 3.4.2 através de 3.4.5.
      2. Depois de 3 min, desligar o ruído branco e parar de filmar. Retire o mouse da arena labirinto e colocá-lo de volta para sua jaula.
      3. Depois que todos os animais foram testados, limpe a plataforma do labirinto e a câmara de início. Desligue as luzes da sala e remover o sinal de "Não entre" da porta.
      4. Armazene as gravações de vídeo das sessões de testes para um disco rígido externo para posterior análise.
      5. Configure o programa de software de controle de vídeo e extrair os parâmetros de interesse, desde os vídeos gravados, incluindo o tempo de latência para encontrar o buraco alvo durante 4 dias de sessões de treinamento e o tempo gasto no quadrante alvo durante a sessão de julgamento de sonda.

4. bioquímica avaliação

  1. Níveis de ATP no hipocampo
    1. Anestesia profundamente cada rato com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg por grama de peso corporal) e xilazina (10mg por grama de peso corporal).
    2. Decapitar o animal e remover rapidamente o tecido cerebral do crânio.
    3. Dissecar o hipocampo e homogeneizar o tecido no amortecedor da amostra gelada (fornecido pelo kit) com um homogeneizador.
    4. Centrifugar imediatamente o homogenate a 2.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
    5. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo.
    6. Avaliar os níveis de ATP hippocampal, usando o espectrofotométrico método conforme descrito anteriormente,11.

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Representative Results

Análises estatísticas

A análise estatística dos dados obtidos a partir das sessões de treinamento de Barnes foi analisada pela ANOVA de duas vias; os outros testes comportamentais e análise dos níveis de ATP hippocampal entre os grupos foram realizados por One-Way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Tukey. Todos os dados são expressos como média ± o erro padrão da média (SEM), com exceção dos dados de transmissão do laser, que são mostrados como significa ± o desvio padrão (SD). O nível de significância foi fixado em p < 0,05.

Transmissão de luz do laser

A luz do laser (660 nm) transmissão através do crânio e couro cabeludo mais tecido (com uma espessura de amostra de 0,85 ± 0,09 mm) dos ratos envelhecidos foi 15.67% ± 0,87% quando um feixe de laser incidiu sobre o bregma (Figura 1). Baseado nesta transmissão de luz, desde a fluência inicial na superfície do couro cabeludo 99,9 J/cm2 (6.66 [W/cm2] x 15 [s]), pode ser estimado que uma fluência aproximada de 16 J/cm2 atingiu a superfície cortical.

A transmitância do laser, através de uma fatia de 1mm de tecido de cérebro envelhecido, era 10,10% ± 0,95% (Figura 1). Desses valores, pode ser estimado que a fluência de luz diminuiu de 16 J/cm2 no nível do tecido do córtex cerebral para aproximadamente 1,6 J/cm2 a uma profundidade de 1 mm da superfície cortical.

Teste de campo aberto

Não havia diferenças estatisticamente significativas na atividade locomotora no teste de campo aberto entre todos os grupos experimentais (Figura 2).

Tarefa de labirinto de Barnes

Quando a latência de fuga foi analisada durante os 4 dias de formação e com grupos experimentais durante a tarefa do labirinto de Barnes, uma ANOVA de duas vias revelou efeitos significativos do dia (p < 0,001) e grupo (p < 0,001), mas não grupo x dia (p = 0,47). Um intergrupo análise dos dados mostrou que os tempos de latência dos animais idosos-controle foram significativamente mais do que aqueles do grupo controle de jovens no terceiro (p < 0,01) e quarta (p < 0,001) dias da sessão de treinamento. No entanto, os tempos de latência dos camundongos tratados com PBMT envelhecidos foram significativamente menores no quarto dia (p < 0,05), em comparação com os ratos envelhecidos-controle (p < 0,01) (Figura 3). Na sessão de julgamento de sonda, ratos envelhecidos-controle passaram tempos significativamente mais curtos no quadrante alvo, em comparação com os ratos jovens-controle (p < 0,01). No entanto, o Tratado de PBMT envelhecido ratos passados tempos significativamente mais no quadrante alvo em comparação com ratos idosos-controle (p < 0,05) (Figura 4).

Níveis de ATP hippocampal

Os ratos envelhecidos-controle tem uma diminuição significativa nos níveis de ATP hippocampal, comparada com ratos jovens-controle (p < 0,05). No entanto, o conteúdo médio de ATP no hipocampo dos ratos envelhecidos-PBMT foram significativamente maior do que aqueles nos ratos idosos-controle (p < 0,05) (Figura 5).

Figure 1
Figura 1 : Laser dados de transmissão de luz através do crânio além de couro cabeludo e o tecido cerebral. Dados são expressos em média ± SD. SD = desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Dados de atividade locomotora do teste de campo aberto Dados são expressos como a média ± SEM. PBMT = terapia de décadas; SEM = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Escapar de latência para grupos de ratos durante os quatro dias de sessões de treinamento. Valores representam a média ± SEM. * *p < 0,01 e * * *p < 0,001, comparado com os jovens-controle ratos. # p < 0.05, em comparação com os ratos envelhecidos-controle. PBMT = terapia de décadas; SEM = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Tempo gasto no quadrante alvo na sessão de sonda, em diferentes grupos. Valores representam a média ± SEM. * *p < 0,01, em comparação com os jovens-controle ratos. # p < 0.05, em comparação com os ratos envelhecidos-controle. PBMT = terapia de décadas; SEM = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Conteúdo de ATP no tecido hipocampo. Valores representam a média ± SEM. *p < 0.05, em comparação com os jovens-controle ratos. # p < 0.05, em comparação com os ratos envelhecidos-controle. PBMT = terapia de décadas; SEM = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Descreveremos um protocolo para a realização de um procedimento PBMT transcraniana em camundongos. Este protocolo destina-se especificamente aos laboratórios de neurociência que realizam pesquisas de décadas focadas em roedores. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para outros animais de laboratório que são frequentemente usados no campo da neurociência, tais como o coelho, gato, cachorro ou macaco.

Atualmente, há um interesse crescente na investigação transcraniana PBMT com vermelho/NIR lasers e LEDs. Para executar com êxito o procedimento todo tratamento em roedores, existem alguns passos essenciais para considerar.

Em primeiro lugar, é fundamental que, antes de tentar qualquer tratamentos em animais vivos, a penetração de luz precisamente é medida através dos tecidos animais de cabeça a fim de entregar uma dosagem ideal de fóton (J/cm2).

Em segundo lugar, com base em quais regiões do cérebro são afetados pela patologia e alvo de tratamento, precisam de vários parâmetros para ser otimizado maximizar a penetração de luz e aumentar a probabilidade de resultados positivos. Estes incluem o tempo de irradiação, intervalo de tratamento, irradiância aplicada e fluência. Por exemplo, em modelos animais de envelhecido, é crucial entregar uma dose de radiação suficiente para o cérebro hipocampo e córtex frontal, porque essas regiões estão ligadas a patologias relacionadas com a idade de2. Uma taxa de fluência ideal em tecidos-alvo é outro fator importante na PBMT. A maioria dos pesquisadores discutem fatores que afetam a transmissão de luz, mas muitas vezes negligenciam a considerar que uma resposta bifásica em tecidos-alvo cérebro existe não só para a fluência (J/cm2), mas também para a taxa de entrega de fluência. Em outras palavras, uma fluência de 1 J/cm2 entregado mais de 1 min não é equivalente a 1 J/cm2 entregado mais de 1 s17,18.

Existem vários fatores adicionais que também devem ser considerados antes da execução de estudos PBMT transcraniana. Transcranial PBMT em roedores é comumente aplicado usando laser ou LEDs sondas com o tamanho da ponta de sonda dimensionado para o tamanho do cérebro do animal. Para aplicação em roedores, lasers de potência moderada (com uma potência de ≤ 500 mW) pode fornecer uma grande quantidade de energia luminosa em um curto espaço de tempo e reduzir o tempo de tratamento e stress relacionado com o tratamento para o animal. Embora lasers de classe 3B não têm efeitos significativos originando em intervalos de dosagem PBMT (≤20 J/cm2), refrigerando a superfície do couro cabeludo com uma substância óptica transparente, como gelo ou gel, recomenda-se durante a aplicação transcraniana.

Em alguns estudos PBMT experimental transcraniana, fibra óptica é usada em vez de um laser ou LED sonda, devido a suas vantagens para a irradiação de uma pequena área específica na cabeça. Por exemplo, em modelos de PD, uma irradiação preciso da área danificada e isquemia focal, TBI, é garantido. No entanto, as fibras ópticas geralmente têm uma área de pequeno feixe, então isso afetará a quantidade total de energia entregue em uma única sessão e exigirá pesquisadores repetir o procedimento em mais de um local para compensar a diminuição da área. Em estudos PBMT transcraniana mais experimentais, irradiação da cabeça é conduzida no animal alerta, sem anestesia. Para garantir a estabilidade de animais, exploração de cabeça manual e o uso de dispositivos de retenção são recomendados. No manualmente segurando método, devido ao fato de que esse animal pode mudar de repente e possivelmente mover sua cabeça longe da zona de irradiação, uma porção de luz irradiada pode ser desperdiçada. Além disso, ambos os métodos podem induzir esforço extra para o animal e poderiam ser um fator de confundimento potencial. Em alguns casos, o procedimento de irradiação é realizado em um animal anestesiado. Note-se que muita anestesia pode afetar adversamente os resultados experimentais nos estudos de neurociência. Portanto, um intervalo mais curto de irradiação deverão ser cuidadosamente considerado nestes tipos de experimentos.

No presente estudo, primeiro medimos a transmissão da luz através do crânio e couro cabeludo da BALB/c masculino com idade entre ratos para determinar a quantidade de energia de laser nm 660 que atingiu a superfície cortical. Os resultados indicaram que 16% da luz na superfície do couro cabeludo unshaved inicial foi transmitida através do cérebro. Dados de transmissão de outros laboratórios em camundongos BALB/c machos têm mostrado que apenas 1,2% da luz de laser 670 nm foi capaz de penetrar o crânio intacto19. Também relatou-se que aproximadamente 90% dos 670 nm diodo emissor de luz é atenuada dentro do crânio de rato20.

A dosagem de neurostimulatory eficaz do laser vermelho sobre o nível de tecido cortical foi confirmada em um estudo anterior realizado em nosso laboratório11. Mostramos que uma fluência cortical diária de um laser de2 J/cm 8 em 660 nm tem efeitos procognitive em um rato envelhecimento modelo11. Na seção de terapia do atual estudo, entregar aproximadamente 16 J/cm2 para a superfície cortical, precisamos sair do laser por 15 s, que era tolerada pelos ratos. No presente trabalho, medimos também o poder de luz recebido na superfície do hipocampo. Baseado nos resultados do experimento, um valor aproximado de 10% foi medido a laser transmitância através de uma fatia de 1 mm do cérebro envelhecido, correspondente a uma fluência luz de aproximadamente 1.6 J/cm2 atingir 1 mm de profundidade da superfície cortical. Dados de outros estudos usando o cérebro de rato BALB/c revelaram uma redução de 65% de 670 nm LED intensidade de luz em cada milímetro de tecido cerebral21. Também tem sido demonstrado que aproximadamente 2,5% de 670 nm LED luz atinge uma profundidade no tecido cerebral de 5 mm, a distância entre a superfície do crânio para a substância negra compacta (SNc) área22.

O hipocampo desempenha um papel de Cardeal na consolidação da memória espacial23. Na verdade, a capacidade bioenergética hippocampal está associada a navegação espacial memória e aprendizagem. Os resultados aqui apresentados sugerem que uma dose leve de aproximadamente 1,6 J/cm2 no nível do hipocampo pode ser suficiente para produzir uma melhoria dos resultados de memória espacial em ratos envelhecidos. Pode presumir-se que uma melhoria de desempenho de memória na tarefa cognitiva-comportamental (labirinto de Barnes) poderia ser devido a uma melhoria do metabolismo de energia hippocampal que aparenta ser induzida por um laser vermelho em um determinado comprimento de onda de 660 nm.

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Disclosures

Salário do P.C. foi apoiado pelo departamento de Psiquiatria de Harvard (Dupont-Warren companheirismo e Livingston Award), o cérebro e o comportamento Research Foundation (NARSAD Young Investigator Award) e pela Photothera Inc. irrestrito de concessão. A doação de droga veio de TEVA. Reembolso de viagens veio da Pharmacia-Upjohn. P.C. recebeu honorários de consulta da Janssen de investigação e desenvolvimento. P.C. apresentou várias patentes relacionadas com o uso de luz infravermelha em psiquiatria. PhotoMedex, Inc. fornecidos quatro dispositivos para um estudo clínico. P.C. recebeu financiamento irrestrito de Inc Litecure para realizar um estudo sobre décadas transcraniana no tratamento de transtornos depressivos major e para realizar um estudo em indivíduos saudáveis. P.C. co-fundou uma empresa (Niraxx luz terapêutica) focada no desenvolvimento de novas modalidades de tratamento a base de luz infravermelha; Ele também é um consultor para a mesma empresa. P.C. recebeu financiamento de Ciências cerebrais para realizar um estudo sobre décadas transcraniana para transtorno de ansiedade generalizada. Os outros autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por um subsídio de Ciências da Universidade de Tabriz Medical (conceder n º 61019) para S.S.-E. e uma concessão de publicação da LiteCure LLC, Newark, DE, EUA, para L.D.T. Os autores gostaria de agradecer o departamento de Imunologia e educação Development Center (EDC), da Universidade de Tabriz Medical Sciences por sua gentil ajuda.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Alfasan #1608234-01
Xylazine Alfasan #1608238-01
Agarose Sigma #A4679
Superglue Quickstar
Vibratome Campden Instruments #MA752-707
Optical glass Sail Brand #7102
Power meter Thor labs #PM100D
Photodiode detector Thor labs #S121C
Caliper Pittsburgh
GaAlAs laser Thor Photomedicine
Etho Vision Noldus
Centrifuge Froilabo #SW14R
Earmuffs Blue Eagle
Digital camera Visionlite #VCS2-E742H
Sterio amplifier Sony
Ethanol Hamonteb #665.128321
Barnes maze Costom-made
ATP assay kit Sigma #MAK190
Elisa reader Awareness #Stat Fax 2100

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References

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Retração edição 141 décadas transcraniana terapia a laser de baixo nível luz vermelha propriedades óticas envelhecimento aprendizagem memória hipocampo rato
Um protocolo para a terapia de décadas transcraniana em ratos
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Salehpour, F., De Taboada, L.,… More

Salehpour, F., De Taboada, L., Cassano, P., Kamari, F., Mahmoudi, J., Ahmadi-Kandjani, S., Rasta, S. H., Sadigh-Eteghad, S. A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice. J. Vis. Exp. (141), e59076, doi:10.3791/59076 (2018).

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