Summary
Para investigar a fisiopatologia do AVC, é criado um modelo do rato de isquémia-reperfusão cerebral. Nós distalmente ligate da artéria cerebral média direita e artéria carótida comum direita e restaurar o fluxo sanguíneo após 10 ou 40 min de isquemia.
Abstract
Neste estudo, um modelo de mouse de oclusão de artéria cerebral média (MCA) é empregado para estudar a isquémia-reperfusão cerebral. Um modelo do rato reprodutível e confiável é útil para investigar a fisiopatologia da isquémia-reperfusão cerebral e determinar potenciais estratégias terapêuticas para pacientes com acidente vascular cerebral. Variações na anatomia do círculo de Willis de C57BL/6 ratos afeta seu volume de infarto após lesão cerebral induzida a isquemia. Estudos têm indicado que oclusão distal do MCA (MCAO) pode superar esse problema e resultar em um tamanho de infarto estável. Neste estudo, podemos estabelecer um modelo de mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão cerebral através da interrupção do fluxo sanguíneo para o MCA certo. Nós distalmente ligate a MCA direita e artéria carótida comum direita (CCA) e restaurar o fluxo sanguíneo após um determinado período de isquemia. Esta lesão de isquemia-reperfusão induz um infarto de tamanho estável e um déficit comportamental. Células imunitárias periféricas infiltrar o cérebro isquêmico no prazo de 24 h infiltração. Além disso, a perda neuronal na área cortical é menor por um longo período de reperfusão. Portanto, este modelo de dois vasos oclusão é apropriado para investigar a resposta imune e recuperação neuronal durante o período de reperfusão após isquemia cerebral.
Introduction
O modelo do rato de isquémia-reperfusão cerebral é uma das abordagens experimentais mais amplamente utilizadas para investigar a fisiopatologia da induzida por isquemia cerebral lesão1. Porque isquémia-reperfusão cerebral ativa o sistema imunológico periférico, células imunitárias periféricas infiltrarem no cérebro isquêmico e causam dano neuronal2. Assim, um modelo de mouse confiável e reprodutível que imita a isquémia-reperfusão cerebral é necessário para compreender a fisiopatologia do acidente vascular cerebral.
C57Bl/6J (B6) ratos são a estirpe mais comumente usada em experimentos de curso porque eles facilmente podem ser manipulados geneticamente. Estão disponíveis dois modelos comuns de MCAO/reperfusão que imitam a condição de isquémia-reperfusão cerebral. O primeiro é o modelo do filamento intraluminal de MCAO proximal, onde um filamento de silício-revestido é empregado para por via intravascular, obstruir o fluxo de sangue na MCA; o filamento de oclusão posteriormente é removido para restaurar o fluxo de sangue3. Uma duração curta de oclusão resulta em uma lesão da região subcortical, Considerando que uma maior duração da oclusão provoca infartos nas áreas corticais e subcorticais. O segundo modelo é o modelo de ligadura de MCAO distal, que envolve a ligadura extravascular do MCA e CCA para reduzir o fluxo de sangue através da MCA, após o qual o fluxo sanguíneo é restaurado através da remoção da sutura e aneurisma clip4. Neste modelo, um infarto é causado nas áreas corticais e a taxa de mortalidade é baixa. Porque a ligadura do modelo MCAO/reperfusão requer craniectomia para expor o site do MCA distal, o site pode ser facilmente confirmado, e analisar se o fluxo de sangue na MCA distal é rompido durante o procedimento é simples.
B6 ratos apresentam consideráveis variações na anatomia de seu círculo de Willis; Isto pode afetar o volume de infarto cerebral de isquémia-reperfusão5,6,7a seguir. Atualmente, este problema pode ser superado através da ligadura do distal MCA8. Neste estudo, podemos estabelecer um método para obstruindo o fluxo sanguíneo do MCA e permitindo a reperfusão após um período pré-determinado de isquemia. Dois vasos de oclusão do modelo de isquémia-reperfusão cerebral induz isquemia transitória do território MCA através da ligadura do MCA bem distal e certo CCA, com fluxo de sangue restaurado após um determinado período de isquemia. Este modelo MCAO/reperfusão induz um infarto de tamanho estável, uma massa de células do sistema imunológico cérebro infiltrando no cérebro isquêmico e um déficit comportamental após isquémia-reperfusão cerebral4.
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Protocol
O cuidado animal institucional e comissões de utilização da Academia Sinica e Universidade de medicina de Taipei aprovaram este protocolo para o uso de animais experimentais.
1. modelo MCAO/reperfusão
- Fornece os ratos com livre acesso à água e comida até a cirurgia.
- Autoclave a cirúrgica ferramentas e limpar a mesa de cirurgia e equipamentos utilizando etanol a 70%. Use uma máscara cirúrgica e luvas estéreis. Use um esterilizador de grânulo seco para esterilizar os instrumentos cirúrgicos se múltiplas cirurgias do mouse serão realizadas em um experimento.
- Anestesiar um rato de 8 a 12 semanas de idade (massa: 25 – 30 g) usando 0.8% hidrato de cloral, através de uma injeção intraperitoneal. Certifique-se que o mouse anestesiado não tem um reflexo de pedal (como os testes com uma pitada de dedo firme) após o anesthetization.
- Pomada de uso veterinário para evitar ressecamento do olho para o mouse enquanto ele está sob anestesia.
- Use um sistema de pressão não-invasiva para monitorar a pressão de sangue do rato.
- Use um sistema de monitorização fisiológico para monitorar sua temperatura retal e gasometria arterial. Manter a temperatura do corpo em 36,5 ± 0,5 ° C.
- Injecte por via subcutânea o mouse com um antibiótico profilático (cefazolina 25mg/kg)8.
- Posicione o mouse na posição supina na rampa de aquecimento.
- Use tosquiadeiras elétricas para expor a pele por raspar o pelo do rato na região ventral do pescoço, bem como na região entre o olho direito e o ouvido direito.
- Use creme de depilação para limpar a pele do corpo do rato e desinfectar o local cirúrgico alternando scrbus com povidione-iodo e etanol a 70%.
- Use tesoura de íris para cortar uma incisão de 1 cm de comprimento da linha média do pescoço.
- Use pinça íris para dissecar cuidadosamente o CCA livre de nervos vago sem causar danos físicos.
- Use as suturas de seda 5-0 para isolar o CCA.
- Faça uma incisão de 0,3 cm no couro cabeludo no ponto médio entre o olho direito e o ouvido direito.
- Use micro-tesouras para cortar o músculo temporalis para expor o osso zigomático e esquamosal.
- Sob um microscópio estéreo de dissecação, use um microdrill para criar um furo de 2 mm de diâmetro diretamente sobre o MCA distal do lado direito.
- Ligar o porta-malas a MCA distal do lado direito usando uma sutura de 10-0.
- Ocluir o CCA lado direito usando um clipe de aneurisma não-traumática.
- Depois de 10 ou 40 min de isquemia, remova os clips de aneurisma e sutura para restaurar o fluxo sanguíneo para a MCA e CCA.
- Use um clipe de sutura para selar a incisão de pele na cabeça.
- Sele as incisões na pele do colo do útero usando uma única sutura seguida, fechando a pele do pescoço com sutura ou grampo9.
- Injecte por via subcutânea buprenorfina (0,1 mg/kg) para alívio de dor9.
- Manter a temperatura do corpo do rato a 36,5 ± 0,5 ° C na rampa de aquecimento até recuperou totalmente da anestesia. Não retornam o animal que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente. Não abandone o animal até que ele recupere a consciência suficiente.
- Posicione o mouse no ringue autoclavados para que livremente pode acessar água e comida depois que ele se recuperou totalmente.
2. coloração com cloreto de 2,3,5-triphenyltetrazolium
- Anestesia o mouse com hidrato de cloral 0,8% através de uma injeção intraperitoneal.
- Use tesoura operacional para decapitar o animal.
- Expor o crânio usando uma tesoura de íris para fazer uma incisão na pele da cabeça.
- Use tesoura manual para cortar anterior do osso frontal.
- Use tesoura de íris para cortar o crânio ao longo da sutura sagital.
- Use um osso rongeur para empurrar de lado frontal e osso parietal e expor o cérebro.
- Use o fórceps de íris para dissecar o cérebro.
- Use uma matriz de cérebro de rato e lâminas de barbear para obter fatias coronais de 2 mm.
- Manche as fatias do cérebro durante 10 minutos a 37 ° C, com cloreto de 2,3,5-triphenyltetrazolium de 2% (TTC) em tampão fosfato salino de 1x.
- Lavar o cérebro 2 x com formol a 10%.
- Conserte o cérebro em formol a 10% em temperatura ambiente por 24 h.
3. a medição do tamanho do infarto
- Organizar as seções sobre uma lâmina de plástico limpo e orientar as seções de rostral ao caudal.
- Digitalize o slide usando um scanner. Coloque uma régua métrica e certifique-se que é visível na imagem digitalizada. Vire o slide e digitalizar o lado reverso.
- Calcule a área de infarto de cada seção utilizando o software ImageJ.
- Abra o arquivo de imagem e configurar a escala da imagem.
- Use a seleção à mão livre para selecionar a área de infarto.
- Use as regiões de Gerenciador de interesse (ROI) para medir a área de interesse.
- Soma das áreas de infarto para cada seção e multiplicar o resultado pela espessura de corte para estimar o volume total de infarto.
4. análise estatística
- Use o GraphPad Prism 6 para determinar a significância estatística com Student t-teste.
Nota: As barras de erro na barra de gráficos representam erros-padrão da média (SEMs). - Uso G * poder 3.1 para calcular o tamanho de amostra adequado e realizar uma análise de poder10.
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Representative Results
Este procedimento MCAO/reperfusão produziu um enfarte cortical nas imediações do MCA certo e causou um déficit comportamental. Diferentes graus de isquemia induzida por infarto volume (figura 1AB) e perda neuronal (Figura 1D) foram criados no córtex cerebral da área MCA certo através de um aumento na duração da ligadura. Esta lesão MCAO/reperfusão diminuiu a atividade locomotora do animal a 48 h após a reperfusão/MCAO (Figura 2). Uma massa de células imunitárias periféricas (CD45alta células) também se infiltrou o cérebro isquêmico (hemisfério ipsilateral) após a isquémia-reperfusão cerebral (Figura 3). Além disso, estamos em relação a este modelo de oclusão de dois vasos com o modelo MCAO e encontrado que os volumes de infarto destes dois modelos não foram significativamente diferentes (Figura 4). A taxa de mortalidade foi baixa (< % de 5) no modelo de rato de oclusão de dois vasos de isquémia-reperfusão cerebral. Excluídos os ratos ainda mais as análises se sangramento excessivo ocorreu durante a cirurgia. Quando os procedimentos cirúrgicos foram seguidos corretamente, a taxa de exclusão animal devido a sangramento excessivo de craniectomia ou MCA foi inferior a 15%. Oclusão da direita MCA ou CCA sozinho não causou infarto.
Figura 1: volume de infarto e perda neuronal são positivamente correlacionadas com o comprimento da oclusão do vaso. (A) representante TTC manchas de fatias de cérebro de ratos, 24 h após o MCAO/reperfusão. O MCAO durou 10 ou 40 min. dados mostrados são representativos de três experimentos independentes. (B) a quantificação do volume de infarto. As barras de erro representam SEMs; n = 8; p < 0,05. (C) a expressão MAP2 em B6 cérebros a 24 h após MCAO/reperfusão foi determinado usando imuno-histoquímica. Áreas de map2-negativo são delimitadas por uma linha tracejada na imagem representativa de MAP2 coloração da seção do cérebro. (D) a quantificação da área negativa MAP2. Área de map2-negativo (%) = área de MAP2-negativo ipsilateral / contralateral hemisfério x 100; n = 3; * p < 0,05.
Figura 2: atividade locomotora diminuída após isquémia-reperfusão cerebral. (A) atividade locomotora foi analisada a 48 h após o MCAO/reperfusão. O MCAO durou 40 min. Os dados foram registrados por 60 min em um ensaio de campo aberto. Distâncias de rastreamento do ratos foram analisadas usando CleverSys TopScan 1.0. O grupo de controle de fraude foi composto de ratos que tinham sido submetido a cirurgia sem a oclusão do MCA ou CCA. (B) a quantificação da distância comovida com a farsa e os ratos MCAO/reperfusão. Os dados são apresentados como média ± SEM; n = 7; p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: células imunitárias periféricas infiltrarem no hemisfério isquêmico após isquémia-reperfusão cerebral. (A) cérebro-infiltrating imunes células (CD45alta ) do hemisfério ipsilateral e contralateral, a 24 h após o MCAO/reperfusão, foram analisadas por citometria de flow. O isolamento do cérebro-infiltração de células imunes tem sido descrito em um anterior de estudo4. O MCAO durou 40 min. (B) a quantificação de células do sistema imunológico cérebro infiltrando no hemisfério ipsilateral e contralateral, a 24 h após o MCAO/reperfusão. Os dados são apresentados como média ± SEM; n = 4; p < 0,05.
Figura 4: O volume de infarto não é diferente entre lesões MCAO - e induzida por MCAO/reperfusão. (A) representante TTC manchas de fatias de cérebro de ratos, 24 h após o MCAO. No grupo experimental MCAO, o MCA certo foi permanentemente truncado usando um cauterizador de navio, Considerando que o CCA certo foi transitoriamente ligado por 40 min. No grupo experimental MCAO/reperfusão (MCAO/Rep), o procedimento foi conforme descrito na seção 1 do protocolo. O MCAO durou 40 min. (B) a quantificação do volume de infarto. Os dados são apresentados como média ± SEM; n = 7.
Tabela 1: comparação do volume de infarto e variabilidade das diferentes experiências. O volume de infarto foi determinado a 24 h após a reperfusão/MCAO de três experimentos independentes. O MCAO durou 40 min. SD = desvio padrão; n = número de ratos usados por experiência.
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Discussion
O modelo de rato MCAO/reperfusão é um modelo animal, comumente empregado para imitar a isquemia transitória em seres humanos. Este modelo animal pode ser aplicado para as cepas de camundongos transgênicos e nocaute para investigar a fisiopatologia do acidente vascular cerebral. Várias etapas do protocolo são especialmente críticas. (1) o microdrill deve ser usado com cuidado quando criando um buraco no crânio, com ação inadequada facilmente causando sangramento do MCA. (2) o MCA não deve ser danificado, e sangramento deve ser evitado antes e após o procedimento da ligadura. Danos para o MCA afeta o nível de reperfusão no cérebro isquêmico7. O status de reperfusão MCA deve ser verificado após o MCAO. A oclusão e a restauração do fluxo sanguíneo para o MCA podem ser analisados usando um laser Doppler. (3) o CCA não deve sangrar durante o isolamento do CCA. (4) o nervo vago não devem ser danificado durante o isolamento de CCA, porque isto poderia aumentar o tamanho do infarto e a probabilidade de mortalidade. (5) a temperatura de corpo do mouse deve ser mantida a 36,5 ± 0,5 ° C. Hipertermia aumenta o tamanho do infarto e a probabilidade de mortalidade11. Hipotermia reduz o volume do infarto após isquemia cerebral12.
O significado deste modelo MCAO/reperfusão é que ela pode criar altamente reprodutíveis infartos corticais e défices comportamentais4. Comparado com diferentes modelos MCAO, tais como o hipóxica isquêmica (H / eu) modelo de curso conforme descrito em um anterior estudo8, este modelo de dois vasos oclusão induz uma variação relativamente pequena no volume de infarto (o coeficiente de variação variou de 0.11-0,17) (tabela 1). Modelos de traçado alternativo, como o modelo do filamento intraluminal, podem resultar em um volume de infarto imprevisível por causa do status incerto da condição oclusão e reperfusão após cirurgia de13. Em comparação com os três vasos MCAO modelo (ligadura do direito MCA e CCAs direito e esquerdos)14, o modelo proposto envolve a ligadura de apenas dois navios (o MCA certo e certo CCA) para alcançar a isquemia cerebral. Consequentemente, um menor tempo de cirurgia é necessário do que no modelo MCAO três vasos. A principal limitação deste modelo MCAO/reperfusão é que ele requer craniectomia para realizar a ligadura da MCA. Um estudo indicou que craniotomia provoca alterações transcricionais no cérebro15. Portanto, um controle de Souza é necessário para determinar os efeitos da MCAO/reperfusão na expressão gênica.
Perda neuronal na área cortical é menor quando é empregada uma maior duração de reperfusão. Estudos têm demonstrado que a área de MAP2-negativo é menor após 7 dias de reperfusão, em comparação com 2 dias de reperfusão4,16. No entanto, este efeito de recuperação é improvável em um cérebro com isquemia induzida por um modelo de monofilamento intraluminal de MCAO17,18. Além disso, o modelo de monofilamento intraluminal de MCAO pode sustentar o tamanho do infarto pelo menos 7 dias.
Os ratos B6 têm extensa collateralization entre a artéria cerebral anterior e a MCA19. Quando estamos permanentemente truncado o MCA no cérebro isquêmico, achamos que o volume de infarto não foi significativamente diferente dos ratos com um MCA reperfused a 24 h após o MCAO (Figura 4). Portanto, sugerimos que o fluxo de sangue de cauções a artéria cerebral anterior pode compensar os efeitos da isquemia do território MCA quando o MCA distal é permanentemente obstruído.
Neste estudo, o modelo de dois vasos MCAO/reperfusão criou uma lesão de isquemia-reperfusão e causou periféricas células do sistema imunológico para se infiltrar no cérebro isquêmico. Este modelo pode ser empregado para investigar a interação entre o cérebro e o sistema imunológico. Além disso, ele pode ser usado para testar o potencial neuroprotectants ou drogas que modulam a resposta imune depois de isquémia-reperfusão cerebral.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan (mais 106-2320-B-038-024, 105-2221-E-038-007-MY3 mais e mais 104-2320-B-424-001) e Taipei Medical University Hospital (107TMUH-SP-01). Este manuscrito foi editado por Wallace edição académica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone rongeur | Diener | Friedman | |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | |
| Cefazolin | Sigma | 1097603 | |
| Chloral hydrate | Sigma | C8383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Electric clippers | Petpro | ||
| 10% formalin | Sigma | F5304 | |
| Germinator dry bead sterilizer | Braintree Scientific | ||
| Iris Forceps | Karl Klappenecker | 10 cm | |
| Iris Scissors | Diener | 9 cm | |
| Iris Scissors STR | Karl Klappenecker | 11 cm | |
| Microdrill | Stoelting | FOREEDOM K.1070 | |
| Micro-scissors-Vannas | HEISS | H-4240 | blade 7mm, 8 cm |
| Mouse brain matrix | World Precision Instruments | ||
| Non-invasive blood pressure system | Muromachi | MK-2000ST | |
| Operating Scissors STR | Karl Klappenecker | 14 cm | |
| Physiological Monitoring System | Harvard Apparatus | ||
| Razor blades | Ever-Ready | ||
| Stoelting Rodent Warmers | Stoelting | 53810 | Heating pad |
| Suture clip | Stoelting | ||
| Tweezers | IDEALTEK | No.3 | |
| Vetbond | 3M | 15672 | Surgical glue |
| 10-0 suture | UNIK | NT0410 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 |
References
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