Summary
Un modèle murin d’ischémie-reperfusion cérébrale est mis en place pour étudier la physiopathologie des accidents vasculaires cérébraux. Nous distalement ligaturer l’artère cérébrale moyenne droite et artère carotide commune droite et restaurer le flux sanguin après 10 ou 40 min d’ischémie.
Abstract
Dans cette étude, un modèle de souris de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCA) est utilisé pour étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale. Un modèle de souris fiable et reproductible est utile pour étudier la physiopathologie de l’ischémie-reperfusion cérébrale et de déterminer des stratégies thérapeutiques potentiels pour les patients atteints d’accident vasculaire cérébral. Variations dans l’anatomie du cercle de Willis de C57BL/6 mâles affecte leur volume d’infarctus après lésion cérébrale induite d’ischémie. Des études ont indiqué qu’occlusion distale du MCA (OACM) peut remédier à ce problème et entraîner une taille de l’infarctus stable. Dans cette étude, nous établissons un modèle de souris de deux vaisseaux occlusion d’ischémie-reperfusion cérébrale par l’intermédiaire de l’interruption de la circulation sanguine vers la droite MCA. Nous distalement ligaturer le MCA droite et artère carotide commune droite (CCA) et de restaurer le flux sanguin après une certaine période d’ischémie. Cette lésion d’ischémie-reperfusion provoque un infarctus de taille stable et un déficit comportemental. Les cellules du système immunitaires périphérique infiltrent le cerveau ischémique dans le délai de l’infiltration de 24h. En outre, la perte de neurones dans la zone corticale est moindre pour une plus longue durée de reperfusion. Par conséquent, ce modèle de deux-bateau occlusion est approprié pour étudier la réponse immunitaire et la récupération neuronale au cours de la période de reperfusion après une ischémie cérébrale.
Introduction
Le modèle de souris de l’ischémie-reperfusion cérébrale est l’une des approches expérimentales plus largement utilisés pour étudier la physiopathologie des induite par l’ischémie cérébrale lésion1. Car l’ischémie-reperfusion cérébrale active le système immunitaire périphérique, les cellules du système immunitaires périphérique s’infiltrer dans le cerveau ischémique et causent des dommages neuronaux2. Ainsi, un modèle de souris fiable et reproductible qui imite l’ischémie-reperfusion cérébrale est nécessaire pour comprendre la physiopathologie des accidents vasculaires cérébraux.
C57BL/6J (B6) souris sont la souche plus couramment utilisée dans les expériences de course car ils peuvent facilement être génétiquement manipulés. Il existe deux modèles courants d’OACM/reperfusion qui imitent la condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Le premier est le modèle de filament d’intraluminale d’OACM proximale, où il est employé un filament de silicium enduit d’occlure intravasculaire le flux sanguin dans le MCA ; le filament occlusion est ensuite supprimé pour restaurer le flux de sang3. Une durée courte occlusion entraîne une lésion de la région sous-corticale, considérant qu’une plus longue durée de l’occlusion provoque un infarctus dans les régions corticales et sous-corticales. Le second modèle est le modèle de ligature d’OACM distal, qui implique la ligature extravasculaire du MCA et CCA pour réduire la circulation sanguine par l’intermédiaire de la MCA, après quoi la circulation sanguine est rétablie par la suppression de la suture et anévrisme clip4. Dans ce modèle, un infarctus est causé dans les aires corticales, et le taux de mortalité est faible. Car la ligature du modèle OACM/reperfusion nécessite craniotomie afin d’exposer le site de la MCA distale, le site peut être facilement confirmé, et tente de déterminer si le flux sanguin dans le MCA distale est perturbé au cours de la procédure est simple.
B6 souris présentent des variations considérables dans l’anatomie de leur cercle de Willis ; Cela pourrait affecter le volume d’un infarctus après ischémie-reperfusion cérébrale5,6,7. Actuellement, ce problème peut être surmonté grâce à la ligature du MCA distale8. Dans cette étude, nous établir une méthode d’occlusion de l’écoulement de sang MCA et permettant de reperfusion après une période d’ischémie. Deux vaisseaux occlusion du modèle d’ischémie-reperfusion cérébrale induit une ischémie transitoire du territoire MCA par ligature du MCA distale droite et droite CCA, avec débit sanguin restauré après une certaine période d’ischémie. Ce modèle OACM/reperfusion provoque un infarctus de taille stable, une grande partie de cerveau-infiltration de cellules immunitaires dans le cerveau ischémique et un déficit comportemental après ischémie – reperfusion cérébrale4.
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Protocol
L’utilisation des comités de l’Academia Sinica et Université de médecine de Taipei et le soin des animaux institutionnelle a approuvé ce protocole pour l’utilisation des animaux d’expérimentation.
1. modèle OACM/reperfusion
- Fournir les souris avec libre accès à l’eau et chow jusqu'à ce que la chirurgie.
- Autoclave l’intervention chirurgicale des outils et assainir la table de chirurgie et équipements à l’aide d’éthanol à 70 %. Porter un masque chirurgical et des gants stériles. Utilisez un stérilisateur sec perle pour restériliser les outils chirurgicaux si plusieurs chirurgies de souris seront déroulera dans une expérience.
- Anesthésier une souris âgés de 8 à 12 semaines (masse : 25 à 30 g) à l’aide d’hydrate de chloral de 0,8 %, par une injection intrapéritonéale. Assurez-vous que la souris anesthésiée n’a pas un réflexe de pédale (selon les essais à l’aide d’une pincée de pied ferme) après l’anesthetization.
- La pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pour la souris alors qu’il est sous anesthésie.
- Utiliser un système de tension artérielle non invasive pour surveiller la tension artérielle de la souris.
- Utiliser un système de monitorage physiologique pour surveiller sa température rectale et les gaz du sang artériel. Maintenir la température corporelle à 36,5 ± 0,5 ° C.
- Injecter par voie sous-cutanée la souris avec un antibiotique prophylactique (céfazoline 25 mg/kg)8.
- Placez votre souris dans la position couchée sur le coussin chauffant.
- Utiliser des tondeuses électriques pour exposer la peau en se rasant la fourrure de la souris sur la région du cou ventrale, ainsi que dans la région située entre le œil droit et l’oreille droite.
- Utiliser la crème épilation pour effacer la fourrure du corps de la souris et de désinfecter le site chirurgical en alternance scrbus avec povidione-iode et de l’éthanol à 70 %.
- Utiliser des ciseaux iris pour couper une incision de 1 cm de long médiane au niveau du col.
- Forceps iris permet de disséquer attentivement la CCA contre les nerfs vagues sans causer de dommage physique.
- Utiliser des sutures soie de 5-0 pour isoler le CCA.
- Faire une incision de 0,3 cm du cuir chevelu au point médian entre le œil droit et l’oreille droite.
- Utilisez microciseaux pour couper le muscle temporal pour exposer l’os zygomatique et squamosal.
- Sous un microscope à dissection stéréo, utilisez un microforages pour créer un trou de 2 mm de diamètre directement au-dessus de la MCA distale du côté droit.
- Ligaturer le tronc de la MCA distale de droite à l’aide d’une suture de 10-0.
- Occlure la CCA à droite à l’aide d’un clip d’anévrisme non traumatique.
- Après 10 ou 40 min d’ischémie, retirer le clips pour anévrisme et la suture pour restaurer le flux sanguin à la MCA et CCA.
- Utilisez un trombone de suture pour sceller l’incision de la peau sur la tête.
- Sceller les incisions de la peau du col utérin à l’aide d’une suture simple suivie en fermant la peau du cou avec suture ou agrafes9.
- Injecter par voie sous-cutanée de buprénorphine (0,1 mg/kg) pour le soulagement de douleur9.
- Maintenir la température du corps de la souris à 36,5 ± 0,5 ° C sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu’il a pleinement récupéré de l’anesthésie. Ne pas retourner l’animal qui a subi une chirurgie à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il reprend conscience suffisante.
- Placez votre souris dans la cage autoclavée afin qu’il peut librement accéder à l’eau et chow après que elle a entièrement récupéré.
2. la coloration avec le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium
- Anesthésier la souris avec 0,8 % d’hydrate de chloral par une injection intrapéritonéale.
- Utilisez des ciseaux d’exploitation pour décapiter l’animal.
- Exposer le crâne à l’aide de ciseaux iris à faire une incision dans la peau de la tête.
- Usage d’utilisation des ciseaux pour couper la partie antérieure de l’os frontal.
- Utiliser des iris ciseaux pour découper le crâne le long de la suture sagittale.
- Utilisez un rongeur d’OS pour repousser le frontal et l’os pariétal et exposer le cerveau.
- Forceps iris permet de disséquer le cerveau.
- Utilisez une matrice de cerveau de souris et de lames de rasoir pour obtenir des tranches coronales de 2 mm.
- Colorer les tranches de cerveau pendant 10 min à 37 ° C avec du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium 2 % (TTC) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate.
- Rincez le cerveau 2 x avec 10 % de formol.
- Difficulté le cerveau dans du formol 10 % à la température ambiante pendant 24 h.
3. mesure de la taille de l’infarctus
- Organiser les sections sur une lame de plastique propre et orienter les tronçons rostral caudal.
- Numérisez les diapositives à l’aide d’un scanner. Placez une règle métrique et assurez-vous qu’il est visible sur l’image numérisée. Retournez la diapositive et numériser le verso.
- Calculer l’aire d’infarctus du myocarde de chaque section à l’aide de logiciels ImageJ.
- Ouvrez le fichier image et mettre en place l’échelle de l’image.
- Sélection à main levée permet de sélectionner la zone de l’infarctus.
- Les régions de gestionnaire d’intérêt (ROI) permet de mesurer l’aire d’intérêt.
- Les zones d’infarctus du myocarde pour chaque section de la somme et multipliez le résultat par l’épaisseur de coupe pour estimer le volume total d’infarctus du myocarde.
4. analyse statistique
- GraphPad Prism 6 permet de déterminer la signification statistique de Student t-test.
Remarque : Les barres d’erreur sur les graphiques à barres représentent les erreurs-types de la moyenne (SEM). - Utilisation G * puissance 3.1 pour calculer la taille de l’échantillon approprié et effectuer une analyse de puissance10.
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Representative Results
Cette procédure OACM/reperfusion produit un infarctus cortical dans le voisinage de la MCA droite et causé un déficit comportemental. Différents niveaux de volume induite par l’ischémie du myocarde (Figure 1 aB) et la perte neuronale (Figure 1D) ont été créés dans le cortex cérébral de la zone droite de MCA à travers une augmentation de la durée de la ligature. Cette blessure OACM/reperfusion a diminué l’activité locomotrice de l’animal à 48 h après l’OACM/reperfusion (Figure 2). Une grande partie de cellules immunitaires périphériques (celluleshaute CD45) a également infiltré le cerveau ischémique (hémisphère ipsilatéral) après l’ischémie-reperfusion cérébrale (Figure 3). En outre, nous avons comparé ce modèle de deux-bateau occlusion avec le modèle OACM et constaté que les volumes d’infarctus de ces deux modèles n’étaient pas significativement différents (Figure 4). Le taux de mortalité est faible (< 5 %) dans le modèle de souris de deux vaisseaux occlusion d’ischémie-reperfusion cérébrale. Nous avons exclu les souris d’approfondir les analyses si saignement excessif avait eu lieu au cours de la chirurgie. Lorsque les interventions chirurgicales ont été suivies correctement, le taux d’exclusion animale en raison de saignements excessifs de craniotomie ou MCA était inférieure à 15 %. Occlusion du MCA ou CCA seul droit n’a pas causé d’infarctus du myocarde.
Figure 1 : volume de l’infarctus et la perte neuronale sont en corrélation positive avec la longueur de l’occlusion du vaisseau. Taches (A) TTC représentant des coupes de cerveau de souris, 24 h après l’OACM/reperfusion. La durée de l’OACM était 10 ou 40 min. données présentées sont représentatifs de trois expériences indépendantes. (B) Quantification du volume de l’infarctus. Les barres d’erreur représentent SEMs ; n = 8 ; p < 0,05. (C), l’expression de la MAP2 en B6 cerveaux à 24h après que OACM/reperfusion a été déterminée par immunohistochimie. MAP2 négatifs zones sont entourés d’une ligne en pointillés dans l’image représentative de la MAP2 coloration de la section du cerveau. (D) la Quantification de la zone négative carte2. Zone négative MAP2 (%) = ipsilatéral MAP2 négatif area / controlatérale hémisphère x 100 ; n = 3 ; * p < 0,05.
Figure 2 : l’activité locomotrice a diminué après ischémie-reperfusion cérébrale. L’activité locomotrice (A) a été analysée 48 h après l’OACM/reperfusion. La durée de l’OACM était de 40 min. Les données ont été enregistrées pendant 60 min dans un test de terrain ouvert. Distances suivi de souris ont été analysées à l’aide de CleverSys TopScan 1.0. Le groupe de contrôle fictif se composait des souris qui avaient subi l’intervention chirurgicale sans l’occlusion du MCA ou CCA. (B) la Quantification de la distance parcourue par l’imposture et les souris OACM/reperfusion. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM ; n = 7 ; p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : les cellules du système immunitaires périphérique s’infiltrent dans l’hémisphère ischémique après ischémie-reperfusion cérébrale. (A) cerveau-infiltrating cellules immunitaires (celluleshaute CD45) dans l’hémisphère homolatéral et controlatéral, 24 heures après l’OACM/reperfusion, ont été analysés par cytométrie en flux. L’isolement de cellules immunitaires infiltrant de cerveau a été décrit dans une précédente étude4. La durée de l’OACM était 40 min. (B), la quantification des cellules immunitaires infiltrant de cerveau dans l’hémisphère homolatéral et controlatéral, 24h après l’OACM/reperfusion. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM ; n = 4 ; p < 0,05.
Figure 4 : le volume de l’infarctus n’est pas différent entre les blessures OACM - et induite par l’OACM/reperfusion. Taches (A) TTC représentant des coupes de cerveau de souris, 24 h après l’OACM. Dans le groupe expérimental OACM, le MCA de droite a été tronqué en permanence à l’aide d’un cauterizer de navire, tandis que la droite CCA a été ligaturée transitoirement pendant 40 min. Dans le groupe expérimental OACM/reperfusion (OACM/Rep), la procédure était tel que décrit à l’article 1 du protocole. La durée de l’OACM était 40 min. (B) Quantification du volume de l’infarctus. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM ; n = 7.
Tableau 1 : comparaison du volume de l’infarctus et la variabilité des différentes expériences de. Le volume de l’infarctus a été déterminé après 24 h après l’OACM/reperfusion de trois expériences indépendantes. La durée de l’OACM était 40 min. SD = écart-type ; n = nombre de souris utilisées par expérience.
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Discussion
Le modèle de souris OACM/reperfusion est un modèle animal couramment employé pour imiter une ischémie transitoire chez l’homme. Ce modèle animal peut être appliqué à des souches de souris transgéniques et knock-out pour étudier la physiopathologie des accidents vasculaires cérébraux. Plusieurs étapes dans le protocole sont particulièrement critiques. (1) la microforages doivent être utilisé avec précaution lorsque vous créez un trou dans le crâne, par des mesures inappropriées facilement causant une hémorragie de la MCA. (2) le MCA ne devrait pas être endommagé, et les saignements doivent être évités avant et après l’intervention de la ligature. Dommage pour le MCA affecte le niveau de reperfusion dans le cerveau ischémique7. Le statut de reperfusion MCA doit être vérifié après l’OACM. L’occlusion et la restauration du flux sanguin à la MCA peuvent être analysées à l’aide d’un laser Doppler. (3) le CCA ne doit pas saigner lors de l’isolation de la CCA. (4) le nerf vague ne doit pas être endommagé lors de l’isolation de la CCA, car cela pourrait augmenter la taille de l’infarctus et la probabilité de mortalité. (5) la température du corps de la souris doit être maintenue à 36,5 ± 0,5 ° C. Hyperthermie augmente la taille de l’infarctus et la probabilité de mortalité11. Hypothermie réduit le volume d’un infarctus après une ischémie cérébrale,12.
La signification de ce modèle OACM/reperfusion est qu’il peut créer des infarctus corticaux hautement reproductibles et déficits comportementaux4. Par rapport aux modèles OACM différents, tels que le hypoxique ischémique (H / je) modèle de course tel que décrit dans une précédente étude8, ce modèle de deux-bateau occlusion induit une variabilité relativement faible du volume d’infarctus (le coefficient de variation allant de 0,11-0,17) (tableau 1). Modèles de temps alternative, comme le modèle de filament intraluminale peuvent entraîner un volume infarctus imprévisibles en raison du statut incertain de la condition de l’occlusion et la reperfusion après chirurgie13. En comparaison avec les trois vaisseaux OACM modèle (ligature du droit MCA et CCAs droit et gauche)14, le modèle proposé implique la ligature des vaisseaux seulement deux (la MCA droite et droite CCA), pour obtenir une ischémie cérébrale. Par conséquent, un temps plus court de la chirurgie est nécessaire que dans le modèle d’OACM trois vaisseaux. La principale limitation de ce modèle OACM/reperfusion est qu’il exige craniectomie pour effectuer la ligature de MCA. Une étude a indiqué que craniotomie provoque des changements transcriptional dans le cerveau de15. Donc, un contrôle de l’imposture est nécessaire pour déterminer les effets d’OACM/reperfusion sur l’expression génique.
La perte de neurones dans la zone corticale est inférieure quand une plus longue durée de reperfusion est employée. Études ont démontré que la zone MAP2 négatif est plus petite après 7 jours de reperfusion, comparée à 2 jours de reperfusion4,16. Toutefois, cet effet de récupération est peu probable dans un cerveau avec ischémie induite par un modèle de monofilament intraluminale d’OACM17,18. En outre, le modèle de monofilament intraluminale d’OACM peut supporter la taille de l’infarctus pendant au moins 7 jours.
Les souris B6 ont garantie étendue entre l’artère cérébrale antérieure et le MCA19. Lorsque nous tronqué en permanence le MCA dans le cerveau ischémique, nous avons constaté que le volume de l’infarctus n’était pas significativement différent des souris avec un MCA reperfusé après 24 h après l’OACM (Figure 4). Par conséquent, nous suggérons que le flux de sang depuis les collatérales de l’artère cérébrale antérieure peut compenser les effets de l’ischémie du territoire MCA lorsque le MCA distale est obstrué en permanence.
Dans cette étude, le modèle de deux-bateau OACM/reperfusion créé une lésion d’ischémie-reperfusion et causé des cellules immunitaires périphériques de s’infiltrer dans le cerveau ischémique. Ce modèle peut être utilisé pour étudier l’interaction entre le cerveau et le système immunitaire. En outre, il peut être utilisé pour tester le potentiel neuroprotecteurs ou médicaments qui modulent la réponse immunitaire après ischémie-reperfusion cérébrale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et la technologie, Taïwan (plus 106-2320-B-038-024, plus 105-2221-E-038-007-MY3 et plus 104-2320-B-424-001) et le Taipei Medical University Hospital (107TMUH-SP-01). Ce manuscrit a été édité par Wallace édition académique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone rongeur | Diener | Friedman | |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | |
| Cefazolin | Sigma | 1097603 | |
| Chloral hydrate | Sigma | C8383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Electric clippers | Petpro | ||
| 10% formalin | Sigma | F5304 | |
| Germinator dry bead sterilizer | Braintree Scientific | ||
| Iris Forceps | Karl Klappenecker | 10 cm | |
| Iris Scissors | Diener | 9 cm | |
| Iris Scissors STR | Karl Klappenecker | 11 cm | |
| Microdrill | Stoelting | FOREEDOM K.1070 | |
| Micro-scissors-Vannas | HEISS | H-4240 | blade 7mm, 8 cm |
| Mouse brain matrix | World Precision Instruments | ||
| Non-invasive blood pressure system | Muromachi | MK-2000ST | |
| Operating Scissors STR | Karl Klappenecker | 14 cm | |
| Physiological Monitoring System | Harvard Apparatus | ||
| Razor blades | Ever-Ready | ||
| Stoelting Rodent Warmers | Stoelting | 53810 | Heating pad |
| Suture clip | Stoelting | ||
| Tweezers | IDEALTEK | No.3 | |
| Vetbond | 3M | 15672 | Surgical glue |
| 10-0 suture | UNIK | NT0410 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 |
References
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