Summary
Un modelo murino de isquemia-reperfusión cerebral es establecido para investigar la patofisiología del accidente cerebrovascular. Distal, ligar la arteria cerebral media derecha y la arteria carótida común derecha y restablecer el flujo sanguíneo después de 10 o 40 min de isquemia.
Abstract
En este estudio, un modelo de ratón de oclusión de arteria cerebral media (MCA) se emplea para el estudio de isquemia-reperfusión cerebral. Un modelo reproducible y confiable es útil para investigar la fisiopatología de la isquemia-reperfusión cerebral y determinar posibles estrategias terapéuticas para pacientes con accidente cerebrovascular. Las variaciones en la anatomía del círculo de Willis de C57BL/6 ratones afecta su volumen de infarto después de la lesión inducida por la isquemia cerebral. Los estudios han indicado que oclusión distal de la MCA (MCAO) puede superar este problema y resultar en un tamaño de infarto estable. En este estudio, establecemos un modelo de ratón de oclusión de los vasos dos de isquemia-reperfusión cerebral a través de la interrupción del flujo sanguíneo a la derecha MCA. Distal, ligar el MCA derecha y arteria carótida común derecha (CCA) y restaurar el flujo sanguíneo después de un periodo de isquemia. Esta isquemia-reperfusión induce un infarto de tamaño estable y un déficit conductual. Las células inmunes periféricas infiltran en el cerebro isquémico dentro del período de infiltración de 24 h. Además, la pérdida neuronal en el área cortical es menor para una duración más larga de la reperfusión. Por lo tanto, este modelo de oclusión de los vasos dos es adecuado para investigar la respuesta inmune y la recuperación neuronal durante el período de reperfusión tras la isquemia cerebral.
Introduction
El modelo de ratón de isquemia-reperfusión cerebral es uno de los enfoques experimentales más utilizados para la investigación de la fisiopatología del cerebro inducida por la isquemia lesión1. Porque isquemia-reperfusión cerebral activa el sistema inmune periférico, las células inmunes periféricas infiltran en el cerebro isquémico y causan daño neuronal2. Así, un modelo de ratón fiable y reproducible que imita la isquemia-reperfusión cerebral es necesaria para entender la patofisiología del accidente cerebrovascular.
C57BL/6J (B6) los ratones son la cepa más comúnmente utilizada en experimentos de movimiento ya que pueden fácilmente ser manipulados genéticamente. Dos modelos comunes de MCAO/reperfusión que imitan a la condición de isquemia-reperfusión cerebral están disponibles. El primero es el modelo de filamento intramural de MCAO proximal, donde se emplea un filamento silicio intravascularly ocluir el flujo sanguíneo en el MCA; Posteriormente se retira el filamento oclusión para restaurar el flujo de sangre3. Una duración corta oclusión resulta en una lesión de la región subcortical, considerando que una mayor duración de la obstrucción provoca infartos en las áreas corticales y subcorticales. El segundo modelo es el modelo de ligadura de MCAO distal, que consiste en la ligadura extravascular de la MCA y CCA para reducir el flujo de sangre a través de la MCA, después de que el flujo sanguíneo se restablece a través de la remoción de la sutura y el aneurysm clip4. En este modelo, un infarto es causado en las áreas corticales, y la tasa de mortalidad es baja. Debido a la ligadura del modelo MCAO/reperfusión requiere craniectomía para exponer el sitio de la MCA distal, el sitio puede confirmarse fácilmente, y examinando si el flujo de sangre en el MCA distal se interrumpe durante el procedimiento es sencillo.
B6 ratones muestran considerables variaciones en la anatomía de su círculo de Willis; Esto puede afectar el volumen de infarto tras isquemia-reperfusión cerebral5,6,7. Actualmente, este problema puede superarse a través de la ligadura de la MCA distales8. En este estudio, establecemos un método para ocluir el flujo de sangre MCA y permitiendo la reperfusión después de un período predeterminado de isquemia. Oclusión de dos vasos del modelo de isquemia-reperfusión cerebral induce isquemia transitoria del territorio MCA a través de la ligadura de la MCA distal derecho y CCA derecha, con flujo de sangre restaurado después de un periodo de isquemia. Este modelo MCAO/reperfusión induce un infarto de tamaño estable, una mayor parte del cerebro de la infiltración de células inmunes en el cerebro isquémico y un déficit conductual después de isquemia – reperfusión cerebral4.
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Protocol
Los comités de uso de Sinica de la Academia y Universidad médica de Taipei y cuidado de los animales institucional aprobaron este protocolo para el uso de animales de experimentación.
1. modelo MCAO/reperfusión
- Proporcionar los ratones con acceso libre al agua y chow hasta la cirugía.
- Autoclave el quirúrgico herramientas y desinfectar la mesa de cirugía y aparatos con etanol al 70%. Use una máscara quirúrgica y guantes estériles. Utilizar un esterilizador de grano seco a esterilizar los instrumentos quirúrgicos si múltiples cirugías de ratón se llevará a cabo en un experimento.
- Anestesiar un ratón de 8 a 12 semanas de edad (total: 25-30 g) mediante el uso de hidrato de cloral de 0,8%, a través de una inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el ratón anestesiado no tiene un reflejo pedal (como prueban usando un sujetador firme del dedo del pie) después de la anestesia.
- Use ungüento veterinario para prevenir la sequedad de ojo del ratón mientras está bajo anestesia.
- Utilice un sistema de la presión arterial no invasiva para monitorizar la presión arterial del ratón.
- Utilice un sistema de monitorización fisiológico para controlar su temperatura rectal y la gasometría arterial. Mantener la temperatura corporal a 36.5 ± 0,5 ° C.
- Inyectar por vía subcutánea el ratón con un antibiótico profilácticos (cefazolina de 25 mg/kg)8.
- Coloque el ratón en la posición supina en la almohada.
- Utilice tijeras eléctricas que exponga la piel al afeitarse la piel del ratón en la región ventral del cuello, así como en la región entre el ojo derecho y el oído derecho.
- Usar crema de depilación para aclarar la piel del cuerpo del ratón y para desinfectar el sitio quirúrgico alternando scrbus con povidione-yodo y etanol al 70%.
- Utilice tijeras de iris para cortar una incisión de 1 cm de largo de la línea media en el cuello.
- Utilice pinzas de iris para disecar cuidadosamente el CCA de los nervios vago sin causar daño físico.
- Use suturas de seda 5-0 para aislar el CCA.
- Haga una incisión de 0,3 cm en cuero cabelludo en el punto medio entre el ojo derecho y el oído derecho.
- Utilice microscissors para cortar el músculo de los temporalis para exponer el hueso zigomático y escamosal.
- Con un estéreo microscopio de disección, utilice una microperforadora para crear un agujero de diámetro 2 directamente sobre el MCA distal derecha.
- Ligar el tronco de la MCA distal lado derecho usando una sutura de 10-0.
- Ocluir la CCA derecha usando un clip de aneurisma nontraumatic.
- Después de 10 o 40 min de isquemia, quitar los clips de aneurisma y sutura para restablecer el flujo sanguíneo a la MCA y CCA.
- Utilizar una pinza de sutura para sellar la incisión de la piel en la cabeza.
- Sello de las incisiones de piel cervical utilizando una sutura única seguida por el cierre de la piel del cuello con sutura o grapas9.
- Inyectar por vía subcutánea buprenorfina (0.1 mg/kg) para el alivio de dolor9.
- Mantener la temperatura corporal del ratón en 36,5 ± 0,5 ° C en el cojín de calentamiento hasta que ha recuperado de la anestesia. No devuelva el animal que ha sufrido la cirugía a la compañía de otros animales hasta que haya recuperado completamente. No descuide el animal hasta que recupere conciencia suficiente.
- Coloque el ratón en la jaula del autoclave puede libremente acceder a agua y chow después de que ha recuperado completamente.
2. tinción con cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio
- Anestesiar el ratón con hidrato de cloral de 0,8% a través de una inyección intraperitoneal.
- Use tijeras para decapitar el animal del funcionamiento.
- Exponer el cráneo mediante el uso de tijeras de iris para hacer una incisión en la piel de la cabeza.
- Utilice tijeras para cortar la parte anterior del hueso frontal del funcionamiento.
- Utilice tijeras de iris para cortar el cráneo a lo largo de la sutura sagital.
- Utilizar una gubia ósea para empujar a un lado el frontal y el hueso parietal y exponer el cerebro.
- Utilice pinzas de iris para disecar el cerebro.
- Utilizar una matriz de cerebro de ratón y hojas de afeitar para obtener rebanadas coronales 2 mm.
- Mancha las rebanadas de cerebro durante 10 min a 37 ° C con cloruro 2% 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) en 1 x solución salina con tampón fosfato.
- Enjuague el cerebro 2 x con formalina al 10%.
- Corregimos el cerebro en formol al 10% a temperatura ambiente durante 24 h.
3. medición del tamaño del infarto
- Organizar las secciones en un portaobjetos de plástico limpio y orientar a las secciones de rostral a caudal.
- Analizar la diapositiva utilizando un escáner. Coloque una regla métrica y asegúrese de que esté visible en la imagen escaneada. Voltee la diapositiva y escanear el reverso.
- Calcular el área de infarto de cada sección usando el software ImageJ.
- Abra el archivo de imagen y establecer la escala de la imagen.
- Utilice selección a mano alzada para seleccionar el área de infarto.
- Utilizar las regiones de manager de interés (ROI) para medir el área de interés.
- Suma las áreas de infarto para cada sección y multiplique el resultado por el espesor de la sección para estimar el volumen total del infarto.
4. estadístico análisis
- Utilice GraphPad Prism 6 para determinar la significación estadística con el de Student t-test.
Nota: Las barras de error en los gráficos de barras representan los errores estándar de la media (SEM). - Uso G * 3.1 poder calcular el tamaño de muestra adecuado y realizar un análisis de la potencia10.
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Representative Results
Este procedimiento MCAO/reperfusión produce un infarto cortical en las cercanías de la MCA derecha y causó un déficit conductual. Diferentes grados de volumen inducida por la isquemia infarto (figura 1AB) y la pérdida neuronal (figura 1D) fueron creados en la corteza cerebral de la zona derecha de MCA a través de un aumento en la duración de la ligadura. Este MCAO/reperfusión disminuyó actividad locomotor del animal a las 48 h después de MCAO/reperfusión (figura 2). Un bulto de periféricas inmunitarias (células CD45alta ) también se infiltró en el cerebro isquémico (hemisferio ipsilateral) después de la reperfusión de la isquemia cerebral (figura 3). Además, en comparación con este modelo de oclusión de los vasos dos con el modelo MCAO y encontró que los volúmenes de infarto de estos dos modelos no fueron significativamente diferentes (figura 4). La tasa de mortalidad fue baja (< 5%) en el modelo de ratón de oclusión de los vasos dos de isquemia-reperfusión cerebral. Se excluyeron los ratones de más análisis si sangrado excesivo había ocurrido durante la cirugía. Cuando los procedimientos quirúrgicos fueron seguidos correctamente, la tasa de exclusión animal debido a sangrado excesivo de craniectomía o MCA fue inferior al 15%. Oclusión de la MCA o CCA solo no causó el infarto.
Figura 1: volumen de infarto y la pérdida neuronal se correlacionan positivamente con la longitud de la oclusión de los vasos. (A) representante TTC manchas de rebanadas del cerebro de los ratones, 24 h después de MCAO/reperfusión. La duración de la MCAO era 10 o 40 minutos datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes. (B) cuantificación del volumen del infarto. Las barras de error representan SEMs; n = 8; p < 0.05. (C) la expresión MAP2 en B6 cerebros a las 24 h después de MCAO/reperfusión se determinó por inmunohistoquímica. MAP2-negativo áreas están encerradas por una línea punteada en la imagen representativa de la MAP2, coloración de la sección del cerebro. (D) cuantificación de la zona negativa de la MAP2. MAP2-negativa área (%) = área ipsolateral de la MAP2-negativo / contralateral hemisferio x 100; n = 3; * p < 0.05.
Figura 2: Aparato Locomotor actividad disminuida después de isquemia-reperfusión cerebral. Actividad locomotora (A) se analizó 48 h después de MCAO/reperfusión. La duración de la MCAO fue 40 minutos. Los datos fueron registrados durante 60 min en un ensayo de campo abierto. Distancias de seguimiento de los ratones se analizaron CleverSys TopScan 1.0. Estaba compuesta por el grupo de control simulado de ratones que habían experimentado la cirugía sin la oclusión de la MCA o CCA. (B) cuantificación de la distancia movida por la farsa y los ratones MCAO/reperfusión. Los datos se presentan como media ± SEM; n = 7; p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: las células inmunes periféricas infiltran en el hemisferio isquémico después de isquemia-reperfusión cerebral. (A) cerebro-infiltrating inmune (células CD45alta ) en el hemisferio ipsilateral y contralateral, en 24 h después de MCAO/reperfusión, se analizaron por citometría de flujo. El aislamiento del cerebro de la infiltración de células inmunes se ha descrito en un estudio anterior4. La duración de la MCAO fue 40 minutos (B) la cuantificación de cerebro de la infiltración de células inmunes en el hemisferio ipsilateral y contralateral, en 24 h después de MCAO/reperfusión. Los datos se presentan como media ± SEM; n = 4; p < 0.05.
Figura 4: el volumen de infarto no es diferente entre lesiones MCAO - y reperfusión-inducido MCAO. (A) representante TTC manchas de rebanadas del cerebro de los ratones, 24 h después de la MCAO. En el grupo experimental de MCAO, MCA derecha permanentemente se truncó con un cauterizador de buque, considerando que el CCA derecha fue transitoriamente ligado durante 40 minutos. En el grupo experimental de MCAO/reperfusión (MCAO/Rep), el procedimiento fue como se describe en la sección 1 del protocolo. La duración de la MCAO fue 40 minutos (B) cuantificación del volumen del infarto. Los datos se presentan como media ± SEM; n = 7.
Tabla 1: comparación del volumen del infarto y la variabilidad de experimentos diferentes. El volumen del infarto se determinó en 24 h después de la MCAO/reperfusión de tres experimentos independientes. La duración de la MCAO fue 40 minutos SD = desviación estándar. n = número de ratones utilizados por experimento.
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Discussion
El modelo de ratón MCAO/reperfusión es un modelo animal empleado comúnmente para mímico isquemia transitoria en los seres humanos. Este modelo animal puede aplicarse a las cepas de ratones transgénicos y knockout para investigar la patofisiología del accidente cerebrovascular. Varios pasos en el protocolo son especialmente críticos. (1) la microperforadora debe utilizarse con cuidado cuando se crea un agujero en el cráneo, con inadecuado acción fácilmente, lo que causa hemorragia de la MCA. (2) el MCA no debe ser dañado, y sangrado debe evitarse antes y después del procedimiento de la ligadura. Daño a la MCA afecta el nivel de la reperfusión en el cerebro isquémico7. Se comprobará el estado de reperfusión MCA después la MCAO. La oclusión y la restauración del flujo de sangre a la MCA pueden ser analizadas mediante el uso de un láser Doppler. (3) el CCA no debe sangrar durante el aislamiento de la CCA. (4) nervio vago no debe dañarse durante el aislamiento de CCA porque esto podría aumentar el tamaño del infarto y la probabilidad de mortalidad. (5) la temperatura del cuerpo del ratón debe mantenerse a 36,5 ± 0,5 ° C. La hipertermia aumenta el tamaño del infarto y la probabilidad de mortalidad11. La hipotermia disminuye el volumen de infarto después de isquemia cerebral12.
La importancia de este modelo MCAO/reperfusión es que pueden crear infartos corticales altamente reproducibles y déficit conductual4. En comparación con modelos MCAO, tales como la hipoxia isquémica (H / I) modelo de movimiento como se describe en un anterior estudio8, este modelo de oclusión de los vasos dos induce una variabilidad relativamente pequeña en el volumen de infarto (el coeficiente de variación entre 0.11-0.17) (tabla 1). Modelos de movimiento alternativo, tales como el modelo de filamento intramural, podrían producir un volumen de infarto impredecible debido a la situación incierta de la condición de oclusión y reperfusión después de la cirugía13. En comparación con los tres vasos MCAO modelo (ligadura del derecho MCA y CCAs de derecha e izquierdas)14, el modelo propuesto consiste en la ligadura de dos vasos (derecho MCA y CCA derecha) para lograr la isquemia cerebral. En consecuencia, un menor tiempo de cirugía se requiere que en el modelo MCAO tres vasos. La principal limitación de este modelo MCAO/reperfusión es que requiere craniectomía para realizar ligadura MCA. Un estudio indica que la craneotomía provoca cambios transcripcionales en el cerebro15. Por lo tanto, un control simulado es necesaria para determinar los efectos de MCAO/reperfusión sobre la expresión génica.
La pérdida neuronal en el área cortical es menor cuando se emplea una duración más larga de la reperfusión. Los estudios han demostrado que el área de MAP2-negativa es menor después de 7 días de la reperfusión, en comparación con 2 días de reperfusión4,16. Sin embargo, este efecto de recuperación es poco probable que en un cerebro con isquemia inducida por un modelo de monofilamento intramural de MCAO17,18. Además, el modelo de monofilamento intramural de MCAO puede mantener el tamaño del infarto durante al menos 7 días.
Ratones B6 tienen extensa colateralización entre la arteria cerebral anterior y la MCA19. Cuando permanentemente trunca la MCA en el cerebro isquémico, encontramos que el volumen de infarto no fue significativamente diferente de los ratones con un MCA reperfusión a las 24 h después de MCAO (figura 4). Por lo tanto, sugerimos que el flujo sanguíneo de las colaterales de la arteria cerebral anterior puede compensar los efectos de la isquemia del territorio MCA cuando el MCA distal está obstruido permanentemente.
En este estudio, el modelo MCAO/reperfusión dos vasos creó una isquemia-reperfusión y causado las células inmunes periféricas para infiltrarse en el cerebro isquémico. Este modelo puede ser empleado para investigar la interacción entre el cerebro y el sistema inmunológico. Además, puede utilizarse para probar posibles neuroprotectants o fármacos que modulan la respuesta inmune tras la reperfusión de la isquemia cerebral.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán (más 106-2320-B-038-024 105-2221-E-038-007-MY3 más y más 104-2320-B-424-001) y Taipei Medical University Hospital (107TMUH-SP-01). Este manuscrito fue editado por Wallace de edición académica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone rongeur | Diener | Friedman | |
| Buprenorphine | Sigma | B-044 | |
| Cefazolin | Sigma | 1097603 | |
| Chloral hydrate | Sigma | C8383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Electric clippers | Petpro | ||
| 10% formalin | Sigma | F5304 | |
| Germinator dry bead sterilizer | Braintree Scientific | ||
| Iris Forceps | Karl Klappenecker | 10 cm | |
| Iris Scissors | Diener | 9 cm | |
| Iris Scissors STR | Karl Klappenecker | 11 cm | |
| Microdrill | Stoelting | FOREEDOM K.1070 | |
| Micro-scissors-Vannas | HEISS | H-4240 | blade 7mm, 8 cm |
| Mouse brain matrix | World Precision Instruments | ||
| Non-invasive blood pressure system | Muromachi | MK-2000ST | |
| Operating Scissors STR | Karl Klappenecker | 14 cm | |
| Physiological Monitoring System | Harvard Apparatus | ||
| Razor blades | Ever-Ready | ||
| Stoelting Rodent Warmers | Stoelting | 53810 | Heating pad |
| Suture clip | Stoelting | ||
| Tweezers | IDEALTEK | No.3 | |
| Vetbond | 3M | 15672 | Surgical glue |
| 10-0 suture | UNIK | NT0410 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 |
References
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