대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 2 배 폐색 마우스 모델

Summary

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 마우스 모델 선의 이상 조사를 설립 하다. 우리는 distally 오른쪽 중간 대뇌 동맥과 바로 일반적인 경 동맥 선 하 고 국 소 빈 혈의 10 또는 40 분 후 혈액 흐름을 복원.

Abstract

이 연구에서 중간 대뇌 동맥 (MCA) 폐색 마우스 모델 연구 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 채택 된다. 재현 가능 하 고 안정적인 마우스 모델은 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 이상 조사 하 고 뇌졸중 환자에 대 한 잠재적인 치료 전략을 결정 하는 데 유용 합니다. 윌리스의 C57BL/6 마우스의 해부학에 있는 변이 대뇌 허 혈 유발 부상 후 그들의 경색 볼륨을 영향을 줍니다. 연구 그 원심 MCA 폐색 (MCAO) 수 있습니다이 문제를 극복 하 고 안정적인 경색 크기에 결과 표시 했습니다. 이 연구에서 우리는 오른쪽 MCA에 혈액 흐름의 중단을 통해 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 2 배 폐색 마우스 모델을 설정합니다. 우리는 distally 오른쪽 MCA와 바로 일반적인 경 동맥 (CCA) 선 하 고 국 소 빈 혈의 일정 기간 후 혈액 흐름을 복원. 이 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 안정적인 크기와 행동 적자의 경색을 유도합니다. 주변 면역 세포는 24 h 침투 기간 내 허 혈 성 뇌를 침투. 또한, 대뇌 피 질의 영역에서 신경 손실 더 reperfusion 동안 작습니다. 따라서,이 두 혈관 폐색 모델은 면역 반응 및 신경 복구 후 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 기간 동안 조사 적합 합니다.

Introduction

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 마우스 모델 허 혈 유발 뇌 부상¹이상 조사를 위한 가장 널리 사용 되 실험 방법 중 하나입니다. 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 주변 면역 체계를 활성화 하기 때문에 주변 면역 세포가 허 혈 성 뇌에 침투 하 고 원인 신경 손상². 따라서, 안정적이 고 재현 가능한 마우스 모델을 모방한 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 이해 선의 이상 필요 합니다.

C57BL/6J (B6) 마우스는 선 실험에서 가장 일반적으로 사용 되 긴장 때문에 그들은 쉽게 유전자 조작 될 수 있습니다. 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 상태를 모방 MCAO/reperfusion의 두 가지 일반적인 모델 사용할 수 있습니다. 첫 번째는 실리콘 코팅 필 라 멘 트 intravascularly MCA;에 혈액 흐름을 막다 하 고용은 인접 MCAO의 intraluminal 필 라 멘 트 모델 occluding 필 라 멘 트를 복원 혈액 흐름³이후에 제거 됩니다. 더 이상 폐색 기간 외피와 subcortical 지역에서 경색 원인 반면 짧은 폐색 기간 바꾸어 지역의 병 변에서 발생 합니다. 두 번째 모델은 extravascular 결 찰 후 혈액 흐름 봉합 및 동맥 류 클립⁴의 제거를 통해 복원 MCA 통해 혈액의 흐름을 줄이기 위해 MCA CCA의 포함 한다 원심 MCAO의 결 찰 모델. 이 모델에는 경색은 대뇌 피 질의 영역에서 발생 하 고 사망률은 낮다. MCAO/reperfusion 모델의 결 찰 원심 MCA의 사이트를 노출 하는 craniectomy를 해야 하므로 사이트를 쉽게 확인 될 수 있다, 그리고 원심 MCA에 혈액의 흐름 절차 동안 중단 여부를 검토 하는 것은 간단 합니다.

B6 쥐 윌리스;의 원형의 해부학에 있는 상당한 변이 전시 이 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion^5,,67다음 경색 볼륨에 영향을 수 있습니다. 현재,이 문제는 원심 MCA⁸의 결 찰을 통해 극복할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 MCA 혈액 흐름을 경색 및 허 혈의 미리 결정된 한 기간 후 reperfusion를 활성화 하는 방법을 설정 합니다. 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 모델의 2 배 폐색 혈액의 흐름 허 혈의 일정 기간 후 복원으로 바로 원심 MCA와 오른쪽 CCA의 결 찰을 통해 MCA 영토의 일시적인 허 혈을 유도 합니다. 이 MCAO/reperfusion 모델 대뇌 허 혈-reperfusion⁴후 안정적인 크기, 허 혈 성 두뇌와 행동 적자에 뇌에 침투 하는 면역 세포의 대부분의 경색을 유도합니다.

Protocol

제도 동물 보호와 사용 위원회 학계 Sinica와 타이베이 의과대학의 실험 동물의 사용을 위해이 프로토콜을 승인 했다.

1. MCAO/reperfusion 모델

1. 수술까지 쥐 물과 차에 대 한 무료 액세스를 제공 합니다.
2. 압력솥에 수술 도구와 수술 및 장비 70% 에탄올을 사용 하 여 청소. 수술 용 마스크와 멸 균 장갑을 착용 하십시오. 비드 건조 살 균 기를 사용 하 여 여러 마우스 수술 한 실험 실시 됩니다 경우 수술 도구를 resterilize.
3. 8 월에 12 주 된 마우스 anesthetize (대량: 25-30 g) 0.8 %chloral 하이드 레이트, 복 주사를 통해를 사용 하 여. 마 취 마우스는 페달 반사 (로 회사 발가락 핀치를 사용 하 여 테스트) 후에 anesthetization 다는 것을 확인 하십시오.
4. 수 의사 연 고를 사용 하 여 마 취 동안 마우스에 대 한 눈 건조를 방지 하기 위해.
5. 비 침 투 적인 혈액 압력 시스템을 사용 하 여 마우스의 혈압을 모니터링.
6. 생리 적 모니터링 시스템을 사용 하 여 그것의 직장 온도 및 동맥 혈 가스 모니터링. 36.5 ±에서 체온 유지 0.5 ° c.
7. 예방 항생제 (25 mg/kg cefazolin)⁸마우스를 피하 주사.
8. 난방 장치 패드에서 부정사 위치에 마우스를 놓습니다.
9. 전기 면도기를 사용 하 여 마우스의 모피 오른쪽 눈과 오른쪽 귀 사이 지역에서 뿐만 아니라 복 부 목 지역에 면도 하 여 피부를 노출.
10. 제 모 크림을 사용 하 여 마우스의 시체에서 모피를 취소 하 고 scrbus povidione-요오드와 70% 에탄올을 번갈아 수술 부위의 소독.
11. 아이리스가 위를 사용 하 여 목에 1 cm 긴 중간 절 개를 잘라.
12. 홍 채 집게를 사용 하 여 신중 하 게 신체 상해를 일으키는 원인이 되기 없이 미주 신경에서 CCA를 해 부.
13. CCA을 5-0 비단 봉합을 사용 합니다.
14. 오른쪽 눈과 오른쪽 귀 사이 중간점에서 두 피에서 0.3 cm 절 개를 확인 합니다.
15. Microscissors를 사용 하 여 zygomatic과 squamosal 뼈 노출 temporalis 근육을 잘라.
16. 해 스테레오 현미경 오른쪽 원심 MCA에 직접 2 m m 직경 구멍을 생성 하는 microdrill를 사용 합니다.
17. 10-0 봉합 사를 사용 하 여 오른쪽 원심 MCA의 트렁크 선
18. Nontraumatic 동맥 류 클립을 사용 하 여 오른쪽 CCA 막다
19. 허 혈의 10 또는 40 분, 후 동맥 류 클립 및 MCA와 CCA에 혈액 흐름을 복원에 봉합 사를 제거 합니다.
20. 봉합 클립을 사용 하 여 머리에 피부 절 개를 봉인.
21. 하나의 봉합 사 봉합 사 또는 물림 쇠⁹목 피부를 폐쇄 하 여 다음을 사용 하 여 자 궁 경부 피부 절 개를 봉인.
22. 피하 주사 통증 릴리프⁹에 대 한 buprenorphine (0.1 mg/kg).
23. 그것은 완전히 마 취에서 복구 될 때까지 마우스의 체 온도 36.5 ± 0.5 ° C에 난방 패드를 유지 합니다. 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 수술을 겪고 있다 동물을 반환 하지 않습니다. 두지 마십시오 동물 무인 충분 한 의식 회복 될 때까지.
24. 자유롭게 물에 액세스 하 고 완은 후 밥 수 압력가 마로 소독으로 마우스를 놓습니다.

2. 2,3,5-triphenyltetrazolium 염화와 얼룩

1. 복 주사를 통해 0.8 %chloral 하이드 레이트와 마우스 anesthetize
2. 운영가 위를 사용 하 여 동물을 목을 벨.
3. 머리의 피부에 절 개를 만들기 위해 아이리스가 위를 사용 하 여 두개골을 노출 합니다.
4. 운영가 위를 사용 하 여 정면 뼈의 앞쪽을.
5. 아이리스가 위를 사용 하 여 화살 봉합을 따라 두개골을 잘라.
6. 뼈 rongeur를 사용 하 여 우선 정면 그리고 정수 리 뼈와 뇌를 노출.
7. 홍 채 집게를 사용 하 여 뇌를 해 부.
8. 2mm 코로나 슬라이스를 마우스 뇌 매트릭스와 면도날을 사용 합니다.
9. 인산 염 버퍼 염 분 x 1에서 2 %2,3,5-triphenyltetrazolium 염화 (TTC) 37 ° C에서 10 분 동안 뇌 조각 얼룩.
10. 2 뇌를 씻어 x 10% 포 르 말린.
11. 24 h에 대 한 실 온에서 10% 포 르 말린에 뇌를 수정 합니다.

3입니다. 경색 크기의 측정

1. 깨끗 한 플라스틱 슬라이드에 섹션을 정렬 하 고 오리엔트는 섹션 rostral 꼬리.
2. 스캐너를 사용 하 여 슬라이드를 검사 합니다. 메트릭 눈금자 놓고 스캔 한 이미지에 표시 되어 있는지 확인 합니다. 슬라이드를 뒤집어 하 고 뒷면을 스캔.
3. ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 각 섹션의 경색 영역을 계산 합니다.
   1. 이미지 파일 열고 이미지에 대 한 규모를 설정 합니다.
   2. 경색 영역을 선택 하려면 자유형 선택을 사용 합니다.
   3. 관심 (ROI) 관리자의 영역을 사용 하 여 관심 영역을 측정.
4. 각 섹션에 대 한 경색 영역을 합계 하 고 섹션 두께 총 경색 볼륨 추정 결과 곱하십시오.

4. 통계 분석

1. GraphPad Prism 6를 사용 하 여 학생의 t통계적 의미를 확인-테스트.
   참고: 막대 그래프에 오차 막대 (SEMs) 의미의 표준 오류를 나타냅니다.
2. 사용 G * 전원 3.1 적절 한 샘플 크기를 계산 하 여 전력 분석¹⁰를 수행.

Representative Results

MCAO/reperfusion 이렇게 오른쪽 MCA 주변 피 질 경색 생산과 행동 적자 발생. 허 혈 유발 경색 볼륨 (그림 1AB) 및 (그림 1 cD) 신경 손실의 다른도 결 찰 기간 증가 통해 오른쪽 MCA 영역의 대뇌 피 질에서 창조 되었다. 이 MCAO/reperfusion 상해 MCAO/reperfusion (그림 2) 후 48 h에 동물의 운동 활동을 감소. 주변 면역 세포 (CD45^높은 세포)의 대량은 또한 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion (그림 3) 후 허 혈 성 뇌 (동측 반구)를 침투. 또한, 우리 MCAO 모델이 2 배 폐색 모델을 비교 하 고이 두 모델의 경색 볼륨 크게 다른 (그림 4) 없었다 발견. 사망 율은 낮은 (< 5%) 에 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 2 배 폐색 마우스 모델. 우리는 제외 하는 쥐 수술 하는 동안 발생 했다 과도 한 출혈 하는 경우에 추가 분석에서. 수술 절차 했다 제대로 뒤에 때 craniectomy 또는 MCA에서 과도 한 출혈로 인해 동물 제외의 비율은 15% 미만 했다. 오른쪽 MCA 또는 CCA 혼자의 폐색 경색을 발생 하지 않았다.

그림 1: 경색 볼륨 및 신경 손실의 혈관 폐색 길이와 긍정적으로 상관. (A) 대표 TTC 얼룩 쥐, MCAO/reperfusion 후 24 h에서에서 뇌 조각의. MCAO의 기간 10 또는 40 분 표시 되는 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 대표. (B) 경색 볼륨의 정량화. 오차 막대를 나타내는 SEMs; n = 8; p < 0.05입니다. (C)는 MAP2 MCAO/reperfusion 후 24 h b 6 두뇌 식 immunohistochemistry를 사용 하 여 결정 했다. MAP2 부정적인 지역 MAP2 뇌 섹션의 얼룩의 대표 이미지에서 파선으로 묶여있다. (D) 부 량 MAP2 부정적인 지역. MAP2 부정 영역 (%) = 동측 MAP2 부정적인 지역 / contralateral 반구 x 100; n = 3; * p < 0.05.

그림 2: 운동 활동 감소 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 후. (A) 운동 활동 MCAO/reperfusion 후 48 h를 분석 했다. MCAO의 기간 40 분 이었다입니다. 데이터는 오픈 필드 분석 결과에서 60 분 기록 했다. 마우스의 추적 거리 CleverSys TopScan 1.0을 사용 하 여 분석 되었다. 가짜 제어 그룹 MCA 또는 CCA의 폐색 없이 수술을 받은 했다 쥐 구성 되었습니다. 거리의 부 량 (B)는 가짜와 MCAO/reperfusion 마우스 이동. 데이터는 ± SEM; 의미 하는 대로 표시 됩니다. n = 7; p < 0.05입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 후 허 혈 성 뇌에 침투 하는 주변 면역 세포. (A) 뇌 infiltrating 면역 세포 (CD45^높은 셀) 동측 및 contralateral 반구 MCAO/reperfusion 후 24 시간에 flow cytometry에 의해 분석 되었다. 뇌에 침투 하는 면역 세포의 이전 연구⁴에서 설명 하고있다. MCAO의 기간 MCAO/reperfusion 후 40 분 (B) 뇌 침투 동측 및 contralateral 반구 24 h에 면역 세포의 정량화를 했다. 데이터는 ± SEM; 의미 하는 대로 표시 됩니다. n = 4; p < 0.05입니다.

그림 4: 경색 볼륨 MCAO-MCAO/reperfusion-유도 상해 사이 다른 되지 않습니다. 마우스는 MCAO 후 24 h에서 뇌 조각 (A) 대표 TTC 얼룩. MCAO 실험적인 그룹에서 오른쪽 MCA 영구적으로 잘렸습니다 배 cauterizer를 사용 하 여 오른쪽 CCA 40 분 정도 출혈 했다 반면. MCAO/reperfusion (MCAO/담당자) 실험적인 그룹에서 절차는 프로토콜의 섹션 1에서에서 설명한 대로 했다. MCAO의 지속 시간 40 분 (B)는 경색 볼륨의 정량화. 데이터는 ± SEM; 의미 하는 대로 표시 됩니다. n = 7.

표 1: 경색 볼륨 및 다른 실험에서 다양성의 비교. 경색 볼륨 MCAO/3 개의 독립적인 실험에서 reperfusion 후 24 시간에서 결정 되었다. MCAO의 기간 이었다 40 분 SD = 표준 편차; n = 쥐 실험 당 사용 수.

Discussion

MCAO/reperfusion 마우스 모델은 일반적으로 인간의 일시적인 허 혈을 모방 하기 위해 고용 하는 동물 모델. 이 동물 모델 조사 선의 이상 유전자 변형 및 녹아웃 쥐 계통에 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 여러 단계는 특히 중요 합니다. (1) microdrill 쉽게 MCA에서 출혈을 일으키는 부적절 한 행동으로, 두개골에 구멍을 만들 때 신중 하 게 사용 되어야 한다. (2) MCA 손상 되지 해야한다, 그리고 전과 결 찰 수술 후 출혈 피해 야 한다. MCA에 손상을⁷허 혈 성 뇌 reperfusion의 수준을 영향을 줍니다. MCA reperfusion 상태는 MCAO 후 확인 해야 합니다. 폐색 및 MCA 복원 혈액 흐름의 레이저 도플러를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. (3)는 CCA CCA 격리 동안 하지 출혈 한다. (이 경색 크기와 사망률의 확률을 높일 수 있기 때문에 CCA 격리 중 4) 미주 신경 손상 하지 해야 합니다. (5) 마우스의 체온 36.5 ±에 유지 한다 0.5 ° c. 고 열은 경색 크기 사망률¹¹의 확률을 증가 시킵니다. 저체온증 뇌 허 혈¹²후 경색 볼륨을 줄일 수 있습니다.

이 MCAO/reperfusion 모델의 중요성은 매우 재현할 수 피 질 경색 및 행동 적자⁴만들 수 있습니다. 산소 같은 다른 MCAO 모델에 비해 허 혈 성 (H / 나) 뇌졸중 모델은 이전에 설명 된 대로 공부⁸, 경색 볼륨 (변형 계수에서 원거리에서 상대적으로 작은 변화를 유도 하는이 두 혈관 폐색 모델 0.11 0.17) (표 1) 대체 선 모델, intraluminal 필 라 멘 트 모델 수술¹³후 폐색 및 reperfusion 조건의 미심쩍은 상태 때문에 예측할 수 없는 경색 볼륨에서 발생할 수 있습니다. 3 선박 MCAO 모델 (오른쪽 MCA의 결 찰 및 오른쪽 및 왼쪽 CCAs)¹⁴와 비교, 제안 된 모델 (오른쪽 MCA와 오른쪽 CCA) 대뇌 국 소 빈 혈을 달성 하기 위해 두 개의 혈관의 결 찰을 포함 한다. 따라서, 짧은 수술 시간 보다 3 배 MCAO 모델에 필요한입니다. 이 MCAO/reperfusion 모델의 주요 제한은 MCA 결 찰을 수행 하는 craniectomy 요구입니다. 한 연구는 craniotomy 뇌¹⁵에 transcriptional 변경 하면 표시. 따라서, 가짜 제어 유전자 발현에 MCAO/reperfusion의 효과 결정 하기 위해 필요 합니다.

대뇌 피 질의 영역에서 신경 손실 때 덜 긴 reperfusion 기간 채택 된다. 연구는 MAP2 부정적인 지역 reperfusion^4,16의 2 일에 비해 reperfusion의 7 일 후 작은 설명 했다. 그러나,이 복구 효과 가능성이 크다는 뇌에 허 혈 MCAO^17,18intraluminal monofilament 모델에 의해 유도 된와 함께. 또한, MCAO의 intraluminal monofilament 모델 적어도 7 일 동안 경색 크기를 유지할 수 있습니다.

B6 마우스 앞쪽에 대뇌 동맥 MCA¹⁹사이 광범위 한 담보를 있다. 우리는 영구적으로 허 혈 성 뇌에 MCA 잘리면, 우리 발견 경색 볼륨 했다 MCAO (그림 4) 후 24 시간에 reperfused MCA와 쥐에서 크게 다른 하지. 따라서, 원심 MCA 영구적으로 가려진 때 앞쪽에 대뇌 동맥 민간인에서 혈 MCA 영토의 허 혈 효과 대 한 보상 수도 있습니다 하는 것이 좋습니다.

이 연구에서 두 배 MCAO/reperfusion 모델 국 소 빈 혈 reperfusion 상해 만들어지고 주변 면역 세포를 허 혈 성 뇌에 침투 발생. 뇌와 면역계 사이의 상호 작용을 조사 하기 위해이 모델을 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 잠재적인 neuroprotectants 또는 대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion 후 면역 반응을 조절 하는 약물 테스트를 사용할 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone rongeur	Diener		Friedman
Buprenorphine	Sigma	B-044
Cefazolin	Sigma	1097603
Chloral hydrate	Sigma	C8383
Dissection microscope	Nikon	SMZ-745
Electric clippers	Petpro
10% formalin	Sigma	F5304
Germinator dry bead sterilizer	Braintree Scientific
Iris Forceps	Karl Klappenecker		10 cm
Iris Scissors	Diener		9 cm
Iris Scissors STR	Karl Klappenecker		11 cm
Microdrill	Stoelting	FOREEDOM K.1070
Micro-scissors-Vannas	HEISS	H-4240	blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrix	World Precision Instruments
Non-invasive blood pressure system	Muromachi	MK-2000ST
Operating Scissors STR	Karl Klappenecker		14 cm
Physiological Monitoring System	Harvard Apparatus
Razor blades	Ever-Ready
Stoelting Rodent Warmers	Stoelting	53810	Heating pad
Suture clip	Stoelting
Tweezers	IDEALTEK		No.3
Vetbond	3M	15672	Surgical glue
10-0 suture	UNIK	NT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877