Summary
CRISPR-Cas er en kraftfuld teknologi til ingeniør komplekse genomer af planter og dyr. Vi detalje her, en protokol til effektivt redigere det menneskelige genom ved hjælp af forskellige Cas endonucleases. Vi fremhæve vigtige overvejelser og design parametre til at optimere redigering effektivitet.
Abstract
Klyngesystem regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) funktioner naturligt i bakteriel adaptive immunitet, men har været succesfuldt repurposed for genom engineering i mange forskellige levende organismer. Mest almindeligt, vildtype CRISPR forbundet 9 (Cas9) eller Cas12a liv1975 bruges til at kløve specifikke steder i genomet, hvorefter DNA dobbelt-strenget pause er repareret via ikke-homologe slutningen at deltage (NHEJ) vej eller homologi-instrueret reparation ( HDR) pathway afhængigt af om en donor skabelon er fraværende eller præsentere henholdsvis. Til dato, har CRISPR systemer fra forskellige bakteriearter vist sig at være i stand til at udføre genom-redigering i pattedyrsceller. Men trods den tilsyneladende enkelhed af teknologien, flere konstruktionsparametre skal betragtes, som ofte lader brugere forvirret om, hvordan du bedst til at udføre deres genom-redigering eksperimenter. Her beskriver vi en komplet workflow fra eksperimentelle design for identifikation af celle kloner, der bærer ønskede DNA ændringer, med mål at fremme vellykket gennemførelse af genom-redigering eksperimenter i pattedyr cellelinjer. Vi fremhæve vigtige overvejelser for brugerne at tage til efterretning, herunder valg af CRISPR system, spacer længde og udformningen af en enkelt-strenget oligodeoxynucleotide (ssODN) donor skabelon. Vi forestiller os, at denne arbejdsproces vil være nyttig for gen knockout undersøgelser, sygdom modellering indsats, eller generation af reporter cellelinjer.
Introduction
Evnen til at ingeniør genomet af alle levende organisme har mange biomedicinske og bioteknologiske applikationer, såsom korrektion af sygdom-forårsager mutationer, opførelsen af præcise cellulære modeller for sygdom undersøgelser eller generation af landbruget afgrøder med ønskværdige egenskaber. Siden århundredeskiftet, forskellige teknologier er udviklet til genom engineering i pattedyrceller, herunder meganucleases1,2,3, zink finger nukleaser4,5, eller transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs)6,7,8,9. Men disse tidligere teknologier er enten svært at programmet eller kedelig at samle, dermed hæmmer deres udbredt vedtagelse i forskningen og industrien.
I de seneste år, de klynger interspaced regelmæssigt korte palindromiske gentagelser (CRISPR) - CRISPR-forbundet (Cas) system er opstået som en kraftfulde nye genom engineering technology10,11. Oprindeligt en adaptive immunsystem i bakterier, det har været succesfuldt implementeret for genom ændring i planter og dyr, herunder mennesker. Den primære årsag, hvorfor CRISPR-Cas har opnået så stor popularitet på så kort tid er der det element, der bringer de vigtigste Cas endonuklease, såsom Cas9 eller Cas12a (også kendt som Cpf1), til den korrekte placering i genomet er blot et kort stykke af kimære enkelt guide RN A (sgRNA), som er ligetil at design og billigt at syntetisere. Efter at blive rekrutteret til mål-webstedet, Cas enzym fungerer som et par af molekylære sakse og kløver det bundne DNA med sin RuvC, HNH eller Nuc domæner12,13,14. Den resulterende dobbelt strandede pause (DSB) er efterfølgende repareres af celler via enten ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) eller homologi-instrueret reparation (HDR) pathway. I mangel af en reparation skabelon, er DSB repareret af den fejlbehæftede NHEJ vej, der kan give anledning til pseudo-tilfældige indsættelse eller deletion af nukleotider (indels) på webstedet cut, potentielt forårsager frameshift mutationer i gener, protein-kodning. Men i nærværelse af en donor-skabelon, der indeholder de ønskede DNA ændringer, DSB er repareret af high fidelity HDR pathway. Almindelige typer af donor skabeloner omfatter enkeltstrenget oligonukleotider (ssODNs) og plasmider. Førstnævnte bruges typisk, hvis de påtænkte DNA ændringer er små (f.eks. ændring af en enkelt basepar), mens sidstnævnte er typisk bruges hvis man ønsker at indsætte en relativt lang sekvens (f.eks den kodende sekvens af en grøn fluorescerende proteiner eller Normal god landbrugspraksis) i target locus.
Liv1975 aktivitet af Cas protein kræver tilstedeværelsen af et protospacer tilstødende motiv (PAM) på målet site15. PAM Cas9 er ultimo 3' protospacer, mens PAM Cas12a (også kaldet Cpf1) er på 5'-enden i stedet16. Cas-guide RNA komplekse er ude af stand til at indføre en DSB, hvis PAM er fraværende17. Derfor, PAM placerer en begrænsning på de genomisk steder hvor en særlig Cas nukleasen er stand til at kløve. Heldigvis, Cas nukleaser fra forskellige bakteriearter typisk udviser forskellige PAM krav. Derfor, ved at integrere forskellige CRISPR-Cas systemer i vores engineering værktøjskasse, kan vi udvide antallet af websteder, der kan være målrettet i en genom. Desuden kan en naturlig Cas enzym manipuleret eller udviklet sig til at genkende alternative PAM sekvenser, yderligere udvide anvendelsesområdet for genomisk mål tilgængelige for manipulation18,19,20.
Selv om flere CRISPR-Cas systemer er tilgængelige for genom engineering formål, har de fleste brugere af teknologien påberåbt sig hovedsageligt Cas9 nukleasen fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) af flere årsager. Først, det kræver en forholdsvis simpelthen NGG PAM i modsætning til mange andre Cas proteiner, der kan kun kløver i overværelse af mere komplekse PAMs. For det andet, det er den første Cas liv1975 implementeres med succes i humane celler21,22,23,24. For det tredje er SpCas9 langt de bedst karakteriserede enzym til dato. Hvis en forsker ønsker at bruge en anden Cas nukleasen, vil han eller hun ofte være uklart, om hvordan man bedst at designe eksperimentet og hvor godt andre enzymer vil udføre i forskellige biologiske sammenhænge i forhold til SpCas9.
For at skabe klarhed for den relative resultater af forskellige CRISPR-Cas systemer, har vi for nylig udført en systematisk sammenligning af fem Cas endonucleases-SpCas9, Cas9 enzymet fra Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzymet fra Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzymet fra Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), og Cas12a enzymet fra Lachnospiraceae bakterie ND2006 (LbCas12a)25. Vi vurderet til en fair sammenligning, de forskellige Cas nukleaser bruger det samme sæt af målwebsteder og andre forsøgsbetingelser. Undersøgelsen også afgrænset design parametre for hver CRISPR-Cas-system, som ville tjene som en nyttig reference for brugere af teknologien. Her, for bedre at kunne sætte forskerne til at gøre brug af CRISPR-Cas-system, vi leverer en trinvis protokol for optimal genom engineering med forskellige Cas9 og Cas12a enzymer (Se figur 1). Protokollen ikke kun omfatter eksperimentelle detaljer men også vigtige Designovervejelser at maksimere sandsynligheden for en vellykket genom engineering resultatet i pattedyrsceller.
Figur 1 : En oversigt over arbejdsproces til at generere genom redigeret menneskelige cellelinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design af sgRNAs
- Vælg et passende CRISPR-Cas-system.
- Først inspicere målområde for PAM sekvenser af alle Cas9 og Cas12a nukleaser, der har vist sig at være funktionelle i pattedyrceller16,21-32. Fem hyppigt anvendte enzymer er givet i tabel 1 sammen med deres respektive PAMs.
Bemærk: Udover endonucleases anført i tabel 1, der er andre mindre almindeligt anvendte Cas enzymer, der har været med succes indsat i pattedyrceller samt, såsom en Cas9 nukleasen fra Streptococcus thermophilus (St1Cas9), genkender PAM NNAGAAW. Hvis ønskede mål-webstedet ikke indeholder en kendt PAM, ville derefter man ikke kunne bruge CRISPR-Cas-system for genom engineering. - For det andet overveje eventuelle kendte egenskaber hos target genomisk locus eller genet. Nogle egenskaber for at tage hensyn til omfatter gen expression niveauer eller kromatin tilgængelighed og om der er andre nært relaterede sekvenser samt.
Bemærk: Visse enzymer er bedre egnet til særlige biologiske sammenhænge. For eksempel, hvis du vil redigere en gentagne genomisk locus eller et gen med flere andre tæt paralogs, det anbefales at bruge enten AsCas12a (på grund af dets lavere tolerance for uoverensstemmelser mellem sgRNA og target-DNA end SpCas9 og LbCas12a) eller SaCas9 (grund sin kravet om længere afstandsklodser, hvilket giver højere målretning specificitet)25.
- Først inspicere målområde for PAM sekvenser af alle Cas9 og Cas12a nukleaser, der har vist sig at være funktionelle i pattedyrceller16,21-32. Fem hyppigt anvendte enzymer er givet i tabel 1 sammen med deres respektive PAMs.
| CAS Liv1975 | PAM | Optimal spacer længde |
| SpCas9 | NGG | 17-22 nt inclusive |
| SaCas9 | NNGRRT | ≥ 21 nt |
| NmCas9 | NNNNGATT | ≥ 19 nt |
| AsCas12a og LbCas12a | TTTV | ≥ 19 nt |
Tabel 1: nogle almindeligt anvendte Cas enzymer med deres beslægtet PAMs og optimale sgRNA længder. N = enhver nukleotid (A, T, G eller C); R = A eller G; V = A, C eller G.
- Vælg en egnet spacer sekvens. Identificere så enestående en sekvens som muligt for at minimere risikoen for off-target kavalergang begivenheder, enten ved at undersøge mål genomet med BLAST33 eller ved hjælp af flere frit tilgængelige online værktøjer, såsom: (a) Program fra Feng Zhang laboratorium34 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); c E-sprød36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas-OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
Bemærk: Den optimale længde af spacer kan variere fra 17 til 25 nukleotider (nt) inclusive, afhængigt af hvilke Cas enzym bruges (Se tabel 1). For Cas9, at spacer er opstrøms af PAM, mens det for Cas12a, spacer er neden for PAM. Desuden, HDR effektivitet falder hurtigt med stigende afstand fra webstedet cut. Derfor, for præcis redigering af DNA, placere sgRNA så tæt som muligt til den påtænkte ændring site. - Syntetisere DNA oligonukleotider med passende udhæng for CRISPR plasmid, der bliver brugt.
- Tilføje en G nukleotid foran en spacer, hvis den første position i guiden ikke er en G. Bestem den omvendte supplerende sekvens af spacer. Tilføj i de nødvendige udhæng for kloning formål.
Bemærk: Illustration for plasmider bruges i vores evaluering undersøgelse25, oligonukleotider at være syntetiseret er vist i tabel 2. Bruge eksemplet i figur 2 som en guide, hvis det er nødvendigt. Mange CRISPR plasmider er tilgængelige fra kommercielle kilder (f.eks. Addgene). Nogle af de mere populære plasmider er givet i Tabel af materialer.
- Tilføje en G nukleotid foran en spacer, hvis den første position i guiden ikke er en G. Bestem den omvendte supplerende sekvens af spacer. Tilføj i de nødvendige udhæng for kloning formål.
| CRISPR Plasmid | Sekvens |
| pSpCas9 og pSaCas9 | Betydning: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' Antisensstoffer: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5' |
| pNmCas9 | Betydning: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' Antisensstoffer: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5' |
| pAsCas12a og pLbCas12a | Betydning: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' Antisensstoffer: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5' |
Tabel 2: oligonukleotider kræves for kloning sgRNA sekvenser i CRISPR plasmider bruges i en nylig evaluering studere25. Udhæng er kursiv.
Figur 2 : Et eksempel illustrerer hvordan man vælge målwebsteder og designe oligonukleotider for kloning til CRISPR plasmider. Target genomisk locus her er exon 45 af menneskelige CACNA1D genet. PAMs for SpCas9 og SaCas9 henholdsvis NGG og NNGRRT og er markeret med rødt, mens PAM for AsCas12a og LbCas12a er TTTN og er markeret med grønt. Den røde vandrette linje angiver protospacer for SpCas9 og SaCas9, mens den grønne vandrette linje angiver protospacer for de to Cas12a enzymer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. kloning af oligonukleotider i en rygrad vektor
- Phosphorylate og anneal følelse og antisensstoffer oligonukleotider.
- Hvis oligonukleotider er frysetørret, resuspend dem til en 100 µM koncentration i tris-ethylendiamintetra syre (EDTA) (TE buffer, se Tabel af materialer) eller ddH2O.
- Forberede en 10 µL reaktion blanding indeholdende 1 µL af forstand oligonukleotid, 1 µL af antisense oligonukleotid, 1 µL af T4 DNA ligase buffer (10 x), 1 µL af T4 polynucleotide kinase (PNK) og 6 µL af Hedeselskabet2O. Mix godt af pipettering og placere mastermix i en termisk cy Cler ved hjælp af følgende parametre: 37 ° C i 30 min, 95 ° C i 5 min, og rampe ned til 25 ° C ved 6 ° C/min..
- Fortynd reaktion mix 1: 100 i ddH2O (f.eks. 2 µL mastermix + 198 µL ddH2O).
Figur 3 : Et eksempel på en CRISPR plasmid. (en) A kort med angivelse af forskellige vigtige elementer af plasmidet. Her, drev EF-1a promotor udtryk for Cas9, mens U6 promotor drev udtryk for sgRNA. Amp(R) angiver en ampicillin-resistens gen i plasmidet. (b) sekvensen af "BbsI-BplI kloning websted" i plasmidet. Anerkendelse sekvensen af BbsI er GAAGAC og er angivet med rødt, mens anerkendelse sekvensen af BplI er GAG-N5- CTC og angives i grøn. (c) primere, der kan bruges til kolonien PCR til at kontrollere, om sgRNA sekvens har været succesfuldt klonet ind i plasmid. HU6_forward primer er angivet med en lilla pil på plasmidet kort, mens den universelle M13R(-20) primer er angivet med en pink pil på kortet plasmid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Fordøje CRISPR plasmid med en passende begrænsning enzym.
Bemærk: Kloning af sgRNAs typisk stole på Golden Gate forsamling med type IIs-restriktionsenzymer. Forskellige enzymer kan anvendes til forskellige CRISPR plasmider. For pSpCas9, bruge BbsI eller BplI (Se figur 3). For pSaCas9 bruger pNmCas9, pAsCas12a og pLbCas12a, BsmBI.- Forberede en 20 µL reaktion blanding indeholdende 1 µg af cirkulære plasmid vektor, 2 µL af buffer (10 x), 1 µL af begrænsning enzym (f.eks. BbsI, BplI eller BsmBI), og Hedeselskabet2O til en endelige mængden af 20 µL. Inkuber reaktion ved 37 ° C i 2,5 h.
- Tilføj 1 µL af rejer alkalisk fosfatase (SAP) til reaktionen, og der inkuberes ved 37 ° C i en anden 30 min.
- Dæmpning reaktion ved at tilføje 5 µL af 6 x DNA lastning farvestof (Se Tabel af materialer), bland godt, og løse reaktion på en 0,8%-agarosegel med 1 x tris-acetat-EDTA (TAE) buffer. Derefter, punktafgifter den korrekte band og gå videre til gel rense den lineariseret vektor.
- Ligate de udglødet oligonukleotider i den nedbrudte CRISPR plasmid.
- Forberede en 10 µL mastermix: 50 ng af lineariseret vektor, 1 µL fortyndede udglødet oligonukleotider, 1 µL af T4 DNA ligase buffer (10 x), 1 µL af T4 DNA ligase, og Hedeselskabet2O til en endelige mængden af 10 µL (Se Tabel af materialer). Inkuber reaktion på 16 ° C natten over eller ved stuetemperatur i 2 timer.
Bemærk: For at fremskynde ligatur, bruge koncentreret T4 DNA ligase og inkuberes mastermix ved stuetemperatur i 15 min. (Se Tabel af materialer).
- Forberede en 10 µL mastermix: 50 ng af lineariseret vektor, 1 µL fortyndede udglødet oligonukleotider, 1 µL af T4 DNA ligase buffer (10 x), 1 µL af T4 DNA ligase, og Hedeselskabet2O til en endelige mængden af 10 µL (Se Tabel af materialer). Inkuber reaktion på 16 ° C natten over eller ved stuetemperatur i 2 timer.
- Omdanne kemisk kompetente E. coli sammenskrevne produkter celler (Se supplerende fil 1). Spred de transformerede bakterieceller på en LB-agar plade med 100 µg/mL ampicillin.
- Udføre koloni Polymerasekædereaktionen (PCR) til at identificere bakterierne med insert.
- Forbered to sæt af sterile PCR strip rør. I sæt 1, tilføje 4,7 µL af Hedeselskabet2O, mens i sæt 2, tilsæt 50 µL af LB bouillon med passende antibiotika (fx 100 µg/mL ampicillin).
- Med en steril pipette tip, vælge en koloni fra pladen, stryg det kortvarigt i et sæt 1 rør og forlader aflæsse i et sæt 2 rør. Gentag for et par kolonier, og sørg for at bruge forskellige PCR rør hver gang.
Bemærk: Typisk screening fire kolonier er tilstrækkelig. Dette kan dog variere afhængigt af kloning effektivitet. - Tilføj de følgende reagenser til hvert sæt 1 tube (for en 10 µL PCR): 5 µL af 2 x PCR master mix (med lastning farvestof, se Tabel af materialer), 0,15 µL af følelse eller antisensstoffer oligonukleotid (100 µM), 0,15 µL af primer (100 µM) rettet mod CRISPR plasmidet nedstrøms eller op strøm af sgRNA kassette hhv (Se figur 3).
Bemærk: PCR produktet bør ideelt udbytte en produktstørrelse på ca 150 bp eller større, så at enhver positiv bands er ikke fejl som primer dimerer. - Kør PCR'er i en termisk cycler ved hjælp af følgende parametre: 95 ° C i 3 min, 95 ° C til 30 s (trin 2), 60 ° C i 30 s (trin 3), 72 ° C i 30 s (trin 4), Gentag trin 2\u20124 for en anden 34 cyklusser, 72 ° C i 5 min , og hold på 4 ° C.
Bemærk: Den udgloedning temperatur på 60 ° C kan skal være optimeret til primere designet. Brudforlængelse tid 30 s kan også variere afhængigt af den forventede PCR-amplikon størrelse og DNA polymerase anvendes. - Løse reaktioner på en 1% agarosegel ved hjælp af 1 x TAE buffer.
- Podes en koloni, der giver en positiv band i PCR ved at overføre 50 µL af sin kultur fra det tilsvarende sæt 2 rør ind i en større koniske rør, der indeholder 5 mL LB med en passende antibiotikaet. Lad kulturen vokse natten over i et 37 ° C inkubator-shaker.
- Isolere plasmider fra den overnight kultur ved hjælp af en miniprep kit (Se Tabel af materialer) og sekvens prøven ved hjælp af den koloni PCR primer, der ikke er den følelse eller antisensstoffer oligonukleotid (hU6_forward eller M13R(-20) i figur 3).
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, udføre en maxiprep af sekvens-kontrolleret CRISPR plasmid at opnå et større beløb for downstream eksperimenter.
3. design og syntese af reparation skabeloner
Bemærk: For genom finmekanik, skabelon angive de ønskede DNA ændringer skal ydes sammen med CRISPR-reagenser. For små DNA ændringer såsom ændring af en enkelt nukleotid er ssODN donor skabeloner mest egnede (Se afsnit 3.1). For større DNA redigeringer som indsættelse af en normal god landbrugspraksis tag 5' eller 3' af et bestemt protein-kodning gen, plasmid donor skabeloner er mest egnede (Se afsnit 3.2).
- Designe og syntetisere en ssODN donor skabelon (Se figur 4).
- Bestemme den korrekte strand hvis sekvensen skabelonen bør følge.
Bemærk: Cas12a udstiller en præference for ssODNs af ikke-målarter strand sekvens, mens Cas9 udstiller en præference for ssODNs af target streng sekvens i stedet25 (Se figur 4en). - Sikre at den reparerede sekvens ikke er markedssegment af den valgte Cas nukleasen igen. For eksempel, mutere PAM på en sådan måde, at der er ingen aminosyre ændring eller fjerne PAM fra skabelonen donor, hvis det har ingen funktionel konsekvens. Bruge eksemplet i figur 4b som en guide, hvis det er nødvendigt.
- Beslutte, hvis en symmetrisk eller asymmetrisk donor skabelon ønskes. Symmetrisk donorer, sikre at hver homologi arm flankerende DNA ændring site er mindst 17 nt lang25. For asymmetriske donor skabeloner, skal du bruge længere arme 5 ' af de ønskede DNA ændringer (Se figur 4en). Vigtigere, sikre at den kortere arm er omkring 37 nt i længden, mens de andre homologi arm er omkring 77 nt i længden25,39.
- Syntetisere skabelonen designet som et stykke enkeltstrenget DNA.
Bemærk: Asymmetriske ssODNs kan, men ikke altid, udviser højere HDR effektivitet end symmetrisk ssODNs. Generelt udfører en asymmetrisk donor typisk mindst samt en symmetrisk donor, når udformet korrekt. Men den asymmetriske skabelon koster meget mere fordi det er længere og dermed kræver polyacrylamid gel elektroforese (side) rensning eller en særlig syntese procedure. Rutinemæssig gen knockouts normalt stole på NHEJ reparation pathway og kræver ikke en reparation skabelon. Men hvis knockout effektivitet er lav, designe en ssODN donor skabelon, der indeholder en frameshift mutation og er mindst 120 nt i længden25,40.
- Bestemme den korrekte strand hvis sekvensen skabelonen bør følge.
Figur 4 : Design af ssODN donor skabeloner. (en) skematiske illustrerer forskellige mulige designs. De røde vandrette rektangler angiver ikke-målarter (NT) strand, mens de blå rektangler angiver målet (T) strand. Desuden, angiver de små grønne rektangler de ønskede DNA ændringer (f.eks. enkelt nucleotid ændringer). Når en symmetrisk ssODN er brugt, den mindste længde af hver homologi arm skal være mindst 17 nt (men kan være længere). For asymmetriske ssODNs synes 37/77 T ssODN at være optimal for SpCas9-induceret HDR, mens 77/37 NT ssODN synes at være optimal for Cas12a-induceret HDR. L = venstre homologi arm; R = højre homologi arm. (b) en konkret eksempel at demonstrere, hvordan at designe ssODN skabeloner. Her er målet genomisk locus exon 45 af menneskelige CACNA1D genet. PAM for Cas9 er pink og understreget, mens PAM for Cas12a er brune og understreget. Målet er at skabe en missense mutation (fremhævet i grøn) ved at konvertere AGU (kodning Serin) til AGG (kodning Arginin). For at undgå fornyet målretning af Cas12a, er TTTC PAM muteret til CTTC. Bemærk, at der er ingen ændring i aminosyre (UAU- og UAC-både kode til tyrosin). For at forhindre yderligere fornyet målretning af Cas9, en AGU codon er erstattet med en UCC codon (fed), begge som kode for serin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Design og klone en passende plasmid donor skabelon. For eksempel, det kan indeholde en normal god landbrugspraksis sekvens flankeret af lange arme, der er homologe til target genomisk locus (Se figur 5).
- Sikre, at den ændrede rækkefølge ikke er markedssegment af den valgte Cas nukleasen igen. For eksempel, kan protospacer opdeles af koden indsatte (NGL). Alternativt kan PAM muteret eller fjernet fra skabelonen donor på en sådan måde, der ikke påvirker genfunktion.
- Forstærke homologi våben fra genomisk DNA ved hjælp af PCR. Længden af hver homologi arm er typisk 1000 til 1500 bp.
Bemærk: For at lette kloning, sikre at den fremskudte primer for venstre homologi arm og den omvendte primer for de rigtige homologi arm hver har mindst 20 nt overlappende sekvens med en valgte vektor rygrad. Derudover sikre, at den omvendte primer til venstre homologi arm og den fremad primer for de rigtige homologi arm har nogle overlappende sekvenser med koden epitop. - Klon to homologi armene og (NGL) tag til vektor rygraden ved hjælp af Gibson forsamling41 (Se Tabel af materialer). Kontrollere plasmid af Sanger sekventering bruger frem og bak primere, der er henholdsvis opstrøms og nedstrøms for skabelonen donor.
Bemærk: Sanger sekventering er bredt og billigt tilgængelig som en kommerciel tjeneste. Send en alikvot af plasmid sammen med sekventering primere til en internetudbyder. - Linearize skabelonen donor med en restriktion enzym, der skærer plasmidet kun én gang enten opstrøms af venstre homologi arm eller nedstrøms for den rigtige homologi arm.
Bemærk: For nylig, en dobbelt-cut donor, som er flankeret af sgRNA-PAM sekvenser og er frigivet fra plasmidet efter spaltning af den tilsvarende Cas nukleasen, har vist sig at øge HDR effektivitet42. Når sgRNA-PAM-sekvenser er indsat opstrøms og nedstrøms for den venstre og højre homologi arme henholdsvis (for eksempel ved Gibson forsamling), homologi arm længde kan reduceres til 300 bp og der er ingen grund til at linearize plasmidet.
Figur 5 : Design og kloning af et plasmid donor skabelon. (et) mål i dette specifikke eksempel er at sammensmelte P2A-NGL til C-terminus CLTA protein. Den blå vandret rektangel angiver venstre homologi arm, mens den røde vandret rektangel viser den rigtige homologi arm. Store bogstaver angiver protein-kodning sekvenser, mens små bogstaver angiver ikke-kodende sekvenser. PAMs for SpCas9 og Cas12a er kursiv og understreget. (b) en plasmid donor skabelon, der kan bruges til at tag endogent P2A-NGL C-endepunktet for CLTA. De medfølgende primer sekvenser kan bruges til at klone plasmidet Gibson forsamling. PCR betingelser er som følger: 98 ° C i 3 min, 98 ° C til 30 s (trin 2), 63 ° C til 30 s (trin 3), 72 ° C i 1 minut (trin 4), Gentag trin 2\u20124 for en anden 34 cyklusser, 72 ° C i 3 min, og holde ved 4 ° C. Sorte bogstaver svarer til vektor sekvenser, blå bogstaver svarer til venstre homologi arm, grønne bogstaver svarer til P2A-normal god landbrugspraksis og røde bogstaver svarer til den rigtige homologi arm. Bemærk, at når sekvensen kodning P2A-normal god landbrugspraksis er succesfuldt integreret i target locus, fornyet målretning af SpCas9 ikke vil være muligt, da kun 9 nt af dets protospacer (GTGCACCAG) vil være overladt intakt. Desuden, for at undgå fornyet målretning af Cas12a, tre basepairs umiddelbart efter STOP codon (med fed) er slettet fra plasmid sekvens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. celle Transfektion
Bemærk: De resterende dele af protokollen er skrevet med HEK293T celler i tankerne. Næringssubstratet bruges består af Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 4,5 g/L glukose, 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 0,1% penicillin/streptomycin. Forskellige trin i protokollen skal være tilpasset de faktiske cellelinie anvendes. Alle celle kultur arbejde sker i en klasse II biosikkerhed kabinet til at sikre et sterilt arbejdsmiljø.
- Frø 1,8 x 105 celler i en 24-godt vævskultur plade en dag før Transfektion.
- Adskille cellerne ved sugning medierne og derefter tilføje 150 µL 0,25% Trypsin-EDTA pr. brønd. Inkuber celler ved 37 ° C i 2 min.
- Neutralisere trypsin ved at tilføje 150 µL (eller 1 x volume) celle kultur medier. Overføre cellesuspension til en konisk slange. Spin ned celler i en bænk top centrifugeres ved 1000 x g i 5 min.
- Opsug supernatanten, og pelleten med 5 mL af celle kultur medier. I en separat centrifugeglas, alikvot 10 µL af 0,4% trypan blå løsning. Derefter tilsættes i 10 µL genopslemmes celler fra trin 4.1.2 og blandes grundigt.
- Der afpipetteres 10 µL af blandingen (trypan blå + celler) i en hemocytometer. Gå videre til at tælle cellerne manuelt eller ved hjælp af en automatiseret celle counter.
- Frø 1,8 x 105 celler i en brønd på en 24-godt vævskultur plade.
- Forberede en Transfektion blanding indeholdende enten 500 ng CRISPR plasmid (til NHEJ-medieret redigering) eller 300 ng CRISPR plasmid og 300 ng af donor skabelon (til HDR-medieret redigering), ifølge vejledningen med Transfektion reagens (Se Tabel af materialer). Inkuber ved stuetemperatur i den anbefalede tid varighed (typisk omkring 10\u201220 min).
- Tilføje Transfektion mix til celler i en dråbevis mode, og forsigtigt swirl plade efter.
- Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 air inkubator i 24 timer (for NHEJ-baserede eksperimenter) eller 72 h (for HDR-baserede eksperimenter).
5. fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) af transfekteret celler
- Adskille cellerne ved sugning medierne og derefter tilføje 150 µL af 0,25% trypsin-EDTA pr. brønd. Inkuber celler ved 37 ° C i 2 min.
- Neutralisere trypsin ved at tilføje 150 µL (eller 1 x volume) celle kultur medier. Overføre cellesuspension til et centrifugeglas. Spin ned celler i en microcentrifuge på 235 x g i 5 min.
- Opsug supernatanten og resuspend celler med 2% føtal bovint serum (FBS) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Filtrer celler gennem en 30 µm mesh eller celle si i 5 mL FACS rør.
- Forberede et andet centrifugeglas med ca. 100 µL Kulturmedier eller 2% FBS i PBS for indsamling af celler.
- Gate celler med ikke-transfekteret celler som en negativ kontrol på forskellige flow. Sortere og indsamle de transfected celler, ifølge hvilke fluorescens markør er til stede på det CRISPR plasmid brugt. For eksempel, hvis plasmidet bærer en mCherry gen, sortere for RFP-positive celler.
Bemærk: Forskellige CRISPR plasmider vil have forskellige valgbare markører. Sæt af plasmider (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1 og pLbCpf1) bruges i denne evalueringsundersøgelse bære enten den orange fluorescerende proteiner (OFP) eller mCherry-genet.
6. udvidelse af de enkelte kloner
- Centrifugeres de sorterede celler i en bænk top centrifugeres ved maksimal hastighed (18.000 x g) i 5 min. aspirat supernatanten og resuspenderes med 300 µL kultur medier. Frø 200 µL celler i en 24-godt vævskultur tallerken og lad dem inddrive for et par dage i et 37 ° C inkubator. Holde de resterende 100 µL celler for afsnit 7.
- Når cellerne begynder at blive sammenflydende, passage dem ifølge trin 4.1.1\u20124.1.3. Frø celler tyndt i en 100 mm vævskultur parabol til at give tilstrækkelig plads til enkelte kolonier til at vokse. Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 air inkubator.
Bemærk: Prøv forskellige fortyndinger. Enkelt celler har brug for tilstrækkelig plads til at vokse som enkelte kolonier. Men, de også kan ikke være alt for sparsomme, som nogle cellelinjer ikke vokser godt, når antallet af celler er alt for få. - Når kolonierne, der begyndt at danne, samle dem under mikroskop (med en 4 x forstørrelse) og placere hver klon i en individuel godt af en 24-godt plade, der indeholder celle Kulturmedier. Der inkuberes ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 air inkubator indtil cellerne bliver sammenflydende.
Bemærk: Et alternativ til serielle fortyndinger og koloni plukke er at bruge flowcytometri for at sortere for enkelte celler i en 96-brønd plade. Dog kan dette ikke arbejde for nogle cellelinjer, der ikke dyrker godt når én celle er til stede.
7. evaluering af redigering effektivitet
- Uddrag genomisk DNA ved centrifugering de resterende 100 µL sorteret celler (fra trin 6.1) i en bænk top centrifugeres ved maksimal hastighed (18.000 x g) i 5 min. aspirat supernatanten og gå videre til at isolere genomisk DNA ved hjælp af en udvinding kit (Se tabel af Materialer).
- Udføre T7 liv1975 jeg (T7EI) kavalergang assay (Se figur 6).
- Oprette en 50 µL PCR indeholdende 10 µL PCR reaktion buffer (5 x), 1 µL af dNTP mix (10 mM), 2,5 µL af brugerdefinerede fremad primer (10 µM), 2,5 µL af brugerdefinerede omvendt primer (10 µM), 0,5 µL af DNA polymerase, 2\u20125 µL af genomisk DNA skabelon (afhængigt af hvor mange celler har blevet sorteret), derefter top op til 50 µL med ddH2O (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Primere er designet til at flankere target genomisk locus og udbytte en PCR produkt af omkring 400\u2012700 bp. normalt en primer er placeret tættere til webstedet snit af Cas enzym end anden primeren, således at resultatet af T7EI analyse er to forskellige bands på en ag opstod gel (Se figur 6). - Køre PCR i en termisk cycler med følgende parametre: 98 ° C i 3 min, 98 ° C til 30 s (trin 2), 63 ° C til 30 s (trin 3), 72 ° C i 30 s (trin 4), Gentag trin 2\u20124 for en anden 34 cyklusser, 72 ° C i 2 min , og hold på 4 ° C.
- Løse reaktion på en 2% agarosegel ved hjælp af 1 x TAE buffer.
- Punktafgifter PCR produktet fra gel med en rene, skarpe skalpel og rense DNA ved hjælp af en gel udvinding kit, ifølge producentens anvisninger. Måler koncentrationen af PCR produkt ved hjælp af en spektrofotometeret ved en bølgelængde på 260 nm absorbans (Se Tabel af materialer).
- Forberede en assay blanding indeholdende 200 ng af DNA, 2 µL af T7EI reaktion buffer (10 x), og toppet op til 19 µL med ddH2O (Se Tabel af materialer).
- Re at anneal PCR produktet i en termisk cycler ved hjælp af følgende parametre: 95 ° C i 5 min, rampe ned til 25 ° C ved 6 ° C/min., derefter holde ved 4 ° C.
- Tilføj 5 U T7EI re udglødet PCR produktet, bland godt af pipettering og inkuberes ved 37 ° C i 50 min.
- Løse T7EI-fordøjet DNA på en 2,5%-agarosegel, ved hjælp af 1 x TAE buffer.
- Billede gel og kvantificere band intensitet ved hjælp af ImageJ beregne i indel dannelse ved hjælp af følgende formel:
hvor en repræsenterer intensiteten af intakt PCR produkt og b og c svarer til intensiteten af kavalergang produkter43.- For at måle intensiteten af et band i ImageJ, først tegne en rektangulær kasse omkring bandet som tæt på grænsen som muligt. Det andet Klik på analyser og derefter Indstille målinger. Sikre, at indstillingerne område, mener grå værdiog integreret tætheden kontrolleres. Afslutte indstillingsvinduet ved at klikke på ok. Tredje, klik på analyser og derefter foranstaltning. Middelværdi eller RawIntDen værdi bruges som band intensitet.
- Oprette en 50 µL PCR indeholdende 10 µL PCR reaktion buffer (5 x), 1 µL af dNTP mix (10 mM), 2,5 µL af brugerdefinerede fremad primer (10 µM), 2,5 µL af brugerdefinerede omvendt primer (10 µM), 0,5 µL af DNA polymerase, 2\u20125 µL af genomisk DNA skabelon (afhængigt af hvor mange celler har blevet sorteret), derefter top op til 50 µL med ddH2O (Se Tabel af materialer).
Figur 6 : Kontrol af celler for vellykket genom-redigering resultater. (en) A skematisk illustrerer to almindeligt anvendte assays, nemlig uoverensstemmelse kavalergang assay med T7 liv1975 jeg (T7EI) enzymet og næste generation sequencing (NGS) eller målrettet amplikon sekvensering. De blå vandrette rektangler angiver DNA og de gule cirkler angive ændringer foranlediget af CRISPR-Cas-system. Primere for T7E1 assay er angivet med grønt, mens primere til at generere amplikoner for NGS er markeret med rødt. (b) Design af primer sekvenser for T7EI spaltning assayet og NGS. Her er målet genomisk locus exon 45 af menneskelige CACNA1D genet. Den påtænkte ændring site er angivet med en asterisk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Udføre målrettede amplikon sekventering (Se figur 6).
- Design PCR primere til at forstærke target genomisk locus. Placer en af primere til at være mindre end 100 bp men mere end 20 bp fra protospacer.
Bemærk: Typisk, den samlede PCR produktstørrelse er designet til at være omkring 150\u2012300 bp (Se figur 6). - Føj flere sekvenser til primere som følger: a 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC - NNNN-[frem Primer] – 3'; (b) 5' - GTGCTCTTCCGATCT-[omvendt Primer] –3'.
- Oprette en 50 µL PCR-mastermix indeholdende 10 µL PCR reaktion buffer (5 x), 1 µL af dNTP (10 mM), 5 µL af primer en (10 µM), 5 µL af primer b (10 µM), 0,5 µL DNA polymerase, 2\u20125 µL genomisk DNA skabelon (afhængigt af hvor mange celler er blevet sorteret) , så toppen op til 50 µL med ddH20.
- Køre PCR i en termisk cycler med følgende parametre: 98 ° C i 3 min, 98 ° C til 30 s (trin 2), 63 ° C til 30 s (trin 3), 72 ° C i 15 s (trin 4), Gentag trin 2\u20124 for en anden 34 cyklusser, 72 ° C i 2 min , og hold på 4 ° C.
- Løse reaktion på 2%-agarosegel og rense PCR produkt ved hjælp af en gel udvinding kit ifølge producentens anvisninger. Kvantificere DNA ved hjælp af en spektrofotometeret ved en bølgelængde på 260 nm absorbans (Se Tabel af materialer).
- Syntetisere følgende runde 2 PCR primere: (c) 5' \u2012 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'; d 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[stregkode] - GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
- Oprettet en 20 µL PCR reaktionen mix indeholdende 4 µL PCR reaktion buffer (5 x), 0,4 µL af dNTP (10 mM), 2 µL af primer c (10 µM), 2 µL af primer d (10 µM), 0,2 µL DNA polymerase, 2 µL af DNA skabelon (fra trin 7.3.5 fortyndet 1: 100), og 9,4 µL af Hedeselskabet2O.
Bemærk: Fortyndingsfaktoren for skabelonen DNA kan variere afhængigt af dets oprindelige koncentration. Hvis koncentrationen er omkring 20\u201240 ng/µL, skal du bruge en 1: 100 fortyndingsfaktoren. Derudover vælge et andet stregkode til hver eksperimentel prøve, hvis den samme primer en og primer b bruges i trin 7.3.3. - Køre PCR i en termisk cycler med følgende parametre: 98 ° C i 3 min, 98 ° C til 30 s (trin 2), 65 ° C i 30 s (trin 3), 72 ° C i 30 s (trin 4), Gentag trin 2\u20124 til en anden 14 cykler, 72 ° C i 2 min , og 4 ° C hold.
- Løse 5 µL af hver reaktion på en 2%-agarosegel at bestemme succes af PCR'er. Kombiner alle prøver sammen (forudsat at en forskellige stregkode har været brugt i hver enkelt prøve) og rydde op i de poolede DNA ved hjælp af en PCR rensning kit ifølge producentens instruktioner. Hvis nogle af PCR'er udviser mere end et band (indikerer tilstedeværelsen af ikke-specifikke produkter), udføre en yderligere gel ekstraktionstrinet.
- Sekvens bibliotek på en høj overførselshastighed sekventering instrument (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger til at producere parrede 151 bp læser. Læs 1 sekventering primer er special designet og har leveres separat. Dens sekvens er som følger: Read1_seq: 5'-CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'. Læs 2 sekventering primer og indeks sekventering primer er standard og leveres i reagens patron.
Bemærk: T7EI analyse og målrettede amplikon sekventering er almindeligt anvendt til at kontrollere effektiviteten af genom-redigering. Andre eksperimenter kan dog udføres for at vurdere redigering effektivitet, afhængigt af DNA ændringer indført. For eksempel, hvis en restriktion site er lavet på mål-webstedet, kan en restriktion fragment længde polymorfisme (RFLP) assay udføres. Det er svarer til T7EI analysen, bortset fra at en restriktion liv1975 bruges til at fordøje PCR produktet i stedet.
- Design PCR primere til at forstærke target genomisk locus. Placer en af primere til at være mindre end 100 bp men mere end 20 bp fra protospacer.
8. screening af de enkelte kloner
- Fra trin 6.3, opdele celler når de begynder at få sammenflydende. For hver enkelte klon, indsamle de resterende celler og udtrække genomisk DNA ifølge trin 7.1.
- Udføre T7EI analysen for alle de enkelte kloner efter punkt 7.2, bortset fra en ændring. Forstærke target genomisk locus fra vildtype celler og i trin 7.2.5, stedet for at bruge 200 ng af test DNA kun, mix 100 ng af test DNA med 100 ng af vildtype DNA.
Bemærk: Årsagen til den ændrede skridt er at nogle kloner kan have gennemgået en vellykket biallelic konvertering og er homozygot mutanter. I sådanne tilfælde vil der ingen kavalergang bands i T7EI assay hvis vildtype DNA ikke er blandet. - Sekvens målwebstedet i kloner, der udviser kavalergang bands i T7EI assay.
- Forstærke den modificerede genomisk locus ifølge trin 7.2.1–7.2.4.
- Oprettet den følgende kloning reaktion: 4 µL PCR produkt, 1 µL af saltopløsning, 1 µL af TOPO vektor (Se Tabel af materialer).
- Bland forsigtigt af pipettering og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 5 min.
- Omdanne kemisk kompetente E. coli 3 µL af mastermix celler (f.eks TOP10 eller Stbl3) (Se supplerende fil 1). Spred de transformerede bakterieceller på en LB-agar plade med 50 μg/mL kanamycin.
- Den næste dag, podes mindst 10 kolonier i LB flydende medier indeholdende 50 μg/mL kanamycin.
- Når de bakterielle kulturer er grumset, isoleres plasmider ved hjælp af en miniprep kit (Se Tabel af materialer) og sekvens dem ved hjælp af standard M13 frem eller M13 omvendt primer.
- Udføre en vestlige skamplet (også kendt som immunblot) for at fastslå fravær eller tilstedeværelse af den målrettede protein (hvis den genom-redigering eksperiment indebærer udskære et protein-kodning gen via frameshift mutationer). Se supplerende fil 1.
Bemærk: Andre eksperimenter kan udføres for at identificere klon transporterer de ønskede genomisk ændringer. For eksempel, kan en fænotypiske assay udføres hvis udskære et bestemt gen er kendt for at forårsage visse ændringer i cellulære adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til at udføre en genom-redigering eksperiment, en CRISPR plasmid udtrykker en sgRNA målretning locus af interesse skal klones. Først, plasmidet er fordøjet med en restriktion enzym (typisk en type IIs enzym) til at linearize det. Det anbefales at løse fordøjet produktet på en 1%-agarosegel sammen med en ufordøjet plasmid at skelne mellem en fuldstændig og delvis fordøjelsen. Som ufordøjet plasmider er supercoiled, de har tendens til at køre hurtigere end deres lineariseret modparter (Se figur 7en). Anden, to oligonukleotider for sgRNA skal være udglødet og forbundet til den cut plasmid. For at bestemme, hvis oligonukleotider klonet med succes i CRISPR plasmid rygraden, udføres koloni PCR (Se fig. 7b). Positive kloner podes derefter, før plasmider er pakket og sendt til Sanger sekvensering.
Figur 7 : Kloning af sgRNA-udtrykker CRISPR plasmider. (en) billede viser fordøjet og ufordøjede plasmider efter gelelektroforese. Baner 1\u20123 Vis plasmider, der har været lineariseret helt af BbsI. Lane 4 viser det oprindelige ufordøjet plasmidet, som er supercoiled og dermed trækker hurtigere på en agarosegel. (b) repræsentative gel billede af kolonien PCR produkter. Positive kloner er præget af et grønt kryds (indikerer at oligonukleotider har været succesfuldt forbundet til vektor rygraden), samtidig negativ kloner er markeret med et rødt kryds. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Når konstruktioner har været sekvens-verificeret, kan de være transduced til en ønskede cellelinje (såsom HEK293T). CRISPR plasmider bære ofte en valgbar markør (f.eks. en mCherry gen), hvorved med held transduced celler skal være markeret. Fluorescens kan visualiseres let under et mikroskop ved vellykket levering af plasmider (Se figur 8en). Cellerne er sorteret efter flowcytometri omkring 24\u201272 h efter Transfektion. Den gating er angivet baseret på en ikke-transfekteret kontrol (Se figur 8b). Del af sorterede cellerne udsås på vævskultur plade til recovery.
Figur 8 : Indførelsen af CRISPR reagenser i menneskeceller. (en) repræsentant mikroskopi billede af HEK293T celler med held transfekteret med en CRISPR plasmid forsynet med en mCherry markør (Se Tabel af materialer). Transfektion effektivitet kan vurderes af procentdelen af celler vise røde fluorescens. 10 x forstørrelse, skalalinjen repræsenterer 200 µm. (b) repræsentative FACS parceller. Transfekteret celler (højre panel) er gated mod en ikke-transfekteret kontrol (venstre panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Mens de sorterede celler er at inddrive, er redigering effektivitet evalueret for at afgøre, om forsøget videreføres. Genomisk DNA (gDNA) er isoleret fra de resterende un-forgyldte celler. En T7EI analyse udføres for at kontrollere kavalergang effektivitet, der er beregnet ud fra intensiteten af de bands observeret på en Agarosen gel (Se figur 9en). Desuden, hvis et HDR-baserede eksperiment er designet til at indarbejde en restriktion websted på target locus, en RFLP-analyse kan udføres med den tilsvarende begrænsning enzym (Se fig. 9b).
Figur 9 : Evaluere omfanget af genom-redigering. (en) repræsentative gel billede viser resultaterne af en T7E1 analyse. Baner 1\u20128 repræsenterer forskellige eksperimentelle prøver. For hver prøve angiver den øverste bånd uncut DNA, mens de nederste to bands angiver spaltningsprodukterne. Varierende NHEJ effektivitet kan iagttages blandt prøverne. Fordøjelsen af PCR-amplikoner fra ikke-transfekteret celler bruges som en negativ kontrol og er præget af et "-". (b) repræsentative gel billede viser resultaterne af en RFLP assay. Baner 1\u20126 repræsenterer forskellige eksperimentelle prøver. For hver prøve angiver den øverste bånd uncut DNA, mens de nederste to bands angiver spaltningsprodukterne efter begrænsning digest. Varierende HDR effektivitetsgevinster kan iagttages blandt prøverne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis redigering effektivitet er acceptabelt (fx, på mindst 5% af T7EI analyse), vi gå videre til at identificere enkelte kloner, der bærer de ønskede DNA ændringer. Forgyldt celler, som har været overladt til at inddrive, er seedet tyndt for at give mulighed for individuelle kolonier til at vokse. Efterfølgende er individuelle kolonier plukket og udvidet, før gDNA er isoleret fra disse enkelte kloner. En anden runde af T7EI analyse udføres for at identificere kloner med modificerede DNA på destinationsstedet. TOPO kloning og Sanger sekventering udføres derefter for at fastlægge de nøjagtige sekvenser af alle alleler. Ideelt, for gen knockouts, indels bør ikke være multiplum af tre, som ikke forårsager frameshift mutationer (Se figur 10en). Til yderligere validering af et protein-kodning gen har været succesfuldt inaktiveret, en western skamplet kan udføres til at sikre, at ingen målrettede protein er til stede (Se figur 10b).
Figur 10 : Screening for gen knockouts. (en) repræsentant Sanger sequencing data. Den oprindelige uændrede DNA-sekvens (øverste række) kan justeres med sekventering resultatet modtaget (nederste række) til at kontrollere, om eventuelle ændringer har fundet sted. Her er der en 1 bp isætning og en 7 bp sletning på mål-webstedet (som afbildet af de røde kasser, som repræsenterer huller i justeringen). (b) repræsentant vestlige skamplet billede. Her, er flere kloner (udvidet fra enkelt celler) screenet for tilstedeværelsen eller fraværet af GLUL proteinet. De røde pile angiver de kloner, hvor GLUL-gen har med held slået ud. "WT" står for vildtype celler, hvor GLUL udtrykkes meget. ACTB (β-actin) fungerer som en loading kontrol (Se Tabel af materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas-system er en kraftfuld, revolutionerende teknologi til ingeniør genomer og transcriptomes af planter og dyr. Talrige bakteriearter har vist sig for at indeholde CRISPR-Cas systemer, som potentielt kan være tilpasset til genom og transkriptom engineering formål44. Selv om Cas9 liv1975 fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) var det første enzym til implementeres med succes i humane celler21,22,23,24, enzymer fra andre bakterielle arter, herunder dem, der vises i tabel 1, har også vist sig at fungere godt som tekniske hjælpemidler i menneskelige16,26,27,28. Forskere opsat på at bruge teknologien er derfor ofte usikker på hvilket system man vælger til deres arbejde, og hvordan til at designe deres eksperimenter for optimale resultater.
Her, forsøger vi at hjælpe CRISPR brugere i at maksimere deres anvendelse af teknologien. Grundlæggende for enhver genom redigering eksperiment er udvælgelsen og kloning af en passende sgRNA for målretning. Arbejde udført af os og andre afslører, at forskellige CRISPR-Cas systemer er optimalt aktive på forskellige spacer længder (Se tabel 1)25. Forskeren bør derudover vælge, hvilket system du bruger baseret på kendskab til mål-webstedet. Generelt, blandt de enzymer, der er testet i vores evalueringsundersøgelse, SpCas9 og LbCas12a udstiller højeste kavalergang effektivitet, især i mere stærkt udtrykte gener formentlig som følge af mere åbne og tilgængelige kromatin. Derfor anbefaler vi disse to enzymer til rutinemæssig genom-redigering eksperimenter. Vi har dog konstateret, at begge nukleaser udviser større tolerance for uoverensstemmelser mellem sgRNA og målrettede DNA end AsCas12a. Hvis forskeren er rettet mod et gen med flere nært beslægtede homologs eller gentagne region af genomet, anbefaler vi derfor, bruge AsCas12a til at minimere off target effekter. Alternativt kan SaCas9 også udnyttes som det kræver længere spacer længder til robust aktivitet, derved give højere iboende specificitet end SpCas9 og LbCas12a.
Præcis redigering af en genomisk locus kræver indførelsen af en reparation skabelon sammen med CRISPR-reagenser. Skabelonen fungerer som en brugsanvisning til at fortælle cellerne hvor hen til lave den dobbelt-strenget pause via HDR pathway. To almindelige former for skabelon er en ssODN og et plasmid. Udformningen af denne reparation skabelon er et kritisk skridt for optimal HDR effektivitet25,39,42,45,46,47. For ssODNs er DNA streng sekvens af ssODN stammer fra som vigtigt. AsCas12a og LbCas12a udviser en præference for ssODNs af ikke-målarter strand sekvens, mens SpCas9 udstiller en præference for ssODNs af target strand sekvens i stedet. Derudover HDR effektivitetsgevinster kan potentielt forbedres yderligere ved at udnytte asymmetriske donorer. Dog har forskeren til at være forsigtig med hvilke homologi arm er udvidet (Se figur 2). Øge længden af den forkerte arm ender nedværdigende HDR effektivitet i stedet. Plasmid donorer, er skabelonen ofte linearisering af begrænsning digest før celle transduktion. Derudover har en "dobbelt-cut" plasmid donor, hvor spacer-PAM sekvenser er placeret før og efter venstre og højre homologi arme henholdsvis, vist sig at give en højere HDR effektivitet end en plasmid donor uden den ekstra spacer-PAM sekvenser 42.
Udover forberedelse af de nødvendige CRISPR-reagenser med eller uden en reparation skabelon indebærer generation af modificerede cellelinjer (f.eks., der indeholder bestemte gen knockouts) også celle transduktion, enkelt celle ekspansion og screening af de enkelte kloner. Protokollen skitserer alle downstream trin for at give brugerne mulighed at udføre en komplet genom-redigering eksperiment. Nogle detaljer er celle linjespecifikke. For eksempel, kan nogle cellelinjer være let at transfect, mens andre kan kræve omfattende optimering med forskellige transduktion metoder, herunder nucleofection og elektroporation. Vigtigere, er et kritisk skridt i protokollen fra vores erfaringer, encellede kloning. Visse celletyper kan ikke formere sig, når de er seedet som en enkelt celle i en brønd, måske på grund af en manglende udskilles vækstfaktorer. For eksempel, vokser menneskelige embryonale stamceller og mange patient-afledte primære cellelinjer typisk meget dårligt som isolerede enkelte celler. Derfor, efter transduktion, vi anbefaler plating celler sparsomt og derefter plukke enkelte kolonier på en plade ved hjælp af flowcytometri for at sortere enkelt celler i forskellige wells af en 96-brønd plade. Der kan også være behov for at tilføje Pro overlevelse faktorer til celle kultur medier, såsom ROCK hæmmer48, for at forbedre inddrivelsen af dissocierede celler. Desuden, i løbet af processen af encellede kloning, kan der være situationer, hvor to separate celler vokse meget tæt på hinanden og ender med at flette, hvorved det falske udseendet af en koloni kun. I sådanne situationer, kan en ende i faser af bestemmelse af de genomiske mutationer indført, at identificere tre eller flere forskellige alleler. Det er dog stadig muligt at inddrive individuelle kloner af tyndt plating disse celler igen og derefter plukke yderligere enkelte kolonier.
Afslutningsvis, er CRISPR-Cas-teknologien revolutionerende biomedicinske og bioteknologiske forskning. Men, det i øjeblikket lider under flere begrænsninger (f.eks. begrænset målretning rækkevidde og store protein størrelse), der hæmmer dens udbredt vedtagelse i nogle applikationer, herunder genterapi. Ikke desto mindre, som tiden skrider frem, mere og mere naturligt forekommende Cas enzymer vil blive opdaget i en bred vifte af mikrobielle arter og nogle af disse nye enzymer kan have fordelagtige egenskaber over eksisterende nukleaser. Detaljerede undersøgelser vil derefter skulle udføres for at korrekt forstå konstruktionsparametre i disse roman CRISPR-Cas-systemer, når de er implementeret som genom og transkriptom engineering værktøjer. Derfor, mens vores protokol fungerer som en god reference for nuværende genom redigering indsats, skal det blive løbende opdateret med de seneste oplysninger om de nye systemer, som de dukker op.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke konkurrerer finansielle interesser.
Acknowledgments
M.H.T. understøttes af et agentur for videnskab teknologi og forsknings fælles Rådet Office grant (1431AFG103), en National Medical Research Council tildele (OFIRG/0017/2016), Grundforskningsfond tilskud (NRF2013-THE001-046 og NRF2013-THE001-093), en Ministeriet for uddannelse Tier 1 tilskud (RG50/17 (S)), en start indrømmer Nanyang Technological University og midler for den internationale genetisk Engineering maskine (iGEM) konkurrence fra Nanyang Technological University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | NEB | M0371 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X | 1st Base | BUF-3000-50X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA. |
| Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X | 1st Base | BUF-3020-10X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. |
| BbsI | NEB | R0539 | |
| BsmBI | NEB | R0580 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | 400,000 units/ml |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
| Rapid DNA Ligation Kit | Thermo Scientific | K1423 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit | Thermo Scientific | 451245 | The salt solution comes with the TOPO vector in the kit. |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Kit for Gibson assembly. |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
| LB Broth (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L3022 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
| LB Broth with Agar (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L2897 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
| SOC media | - | - | 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Biotechnology | A-301 | |
| REDiant 2X PCR Mastermix | 1st Base | BIO-5185 | |
| Agarose | 1st Base | BIO-1000 | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | |
| Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate |
| L-Glutamine, 200mM | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160 | FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min |
| Phosphate Buffered Saline, 1X | Gibco | 20012 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus Transfection | 114-75 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 | Epicentre | LUCG-QE09050 | |
| ISOLATE II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52067 | An alternative to QuickExtract |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | NEB | N0447 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA |
| Protease Inhibitor Cocktail, Set3 | Merck | 539134 | |
| Nitrocellulose membrane, 0.2µm | Bio-Rad | 1620112 | |
| Tris-glycine-SDS buffer, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS. |
| Tris-glycine buffer, 10X | 1st base | BUF-2020 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine. |
| Ponceau S solution | Sigma Aldrich | P7170 | |
| TBS, 20X | 1st base | BUF-3030 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl. |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Skim Milk for immunoassay | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
| WesternBright Sirius-femtogram HRP | Advansta | K12043 | |
| Antibody for β-actin (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Lot number: C0916 |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit fluorometer | Thermo Scientific | Q33226 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Scientific | AMF4300 | |
| CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
| CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: hCas9 | Addgene | 41815 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
| CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
References
- Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
- Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
- Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
- Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
- Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
- Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
- Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
- Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
- Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
- Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
- Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
