Summary
CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.
Abstract
클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 시스템 세균성 적응 면역에 자연스럽 게 작동 하지만 성공적으로 많은 다른 살아있는 유기 체에 있는 게놈 엔지니어링에 대 한 용도가 변경 되었습니다. 가장 일반적으로, CRISPR wildtype 관련 9 (Cas9) 또는 Cas12a endonuclease 게놈, DNA 이중 가닥 휴식 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 또는 상 동 감독 수리 (를 통해 복구 후에 특정 사이트를 쪼개 다 하는 데 사용 됩니다. HDR) 통로 기증자 서식 파일 인지에 따라 결 석 또는 각각 제시. 날짜 하려면, 다른 세균 종에서 CRISPR 시스템 게놈 포유류 세포에서 편집을 수행 할 수 표시 되었습니다. 그러나, 기술의 명백한 단순에도 불구 하 고 여러 설계 매개 변수 필요 간주, 종종 그들의 게놈 편집 실험 수행에 최고의 방법에 대 한 당황 하 게 하는 사용자를 떠나. 여기, 우리가 원하는 DNA 수정, 편집 하는 포유류 세포에 실험 하는 게놈의 성공적인 실행을 촉진의 목표를 수행 하는 세포 클론의 식별에 실험적인 디자인의 완벽 한 워크플로우를 설명 합니다. 우리는 사용자의를 위한 주요 고려 사항 선택 CRISPR 시스템, 공백 길이 그리고 단일 가닥 oligodeoxynucleotide (ssODN) 기증자 서식 파일의 디자인을 포함 하 여 강조 표시 합니다. 우리는이 워크플로 유전자 녹아웃 연구, 모델링 노력, 질병에 대 한 도움이 될 것입니다 또는 기자 생성 세포 라인을 구상.
Introduction
어떤 생명체의 게놈 엔지니어링 능력은 많은 생물 의학 및 바이오 응용 프로그램, 질병 발생의 수정 같은 돌연변이, 질병 연구에 대 한 정확한 휴대 전화 모델의 건설 또는 농업 생성 바람직한 특성을 가진 작물입니다. 세기의 차례 이후 다양 한 기술 개발 되었으며, meganucleases,12,3을 포함 한 포유류 세포에서 게놈 엔지니어링, 아연 손가락 nucleases4,5또는 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)6,7,,89. 그러나, 이러한 이전 기술을 어려운 프로그램 또는 조립, 지루한 연구 및 업계에서 광범위 하 게 채택 함으로써 방해.
최근 몇 년 동안에는 클러스터 된 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced-CRISPR 관련 (Cas) 시스템 엔지니어링 기술10,11강력한 새로운 게놈으로 떠오르고 있다. 원래 박테리아에 적응 면역 체계, 되었습니다 성공적으로 식물과 동물, 인간을 포함 한 게놈 수정에 대 한 배포. CRISPR-Cas 같은 짧은 시간에 너무 많은 인기를 얻고 있다 왜 주된 이유 주요 Cas endonuclease, Cas9 또는 Cas12a (Cpf1 라고도 함) 등을 제공 하는 요소, 게놈에 있는 정확한 위치는 단순히 공상 단일 가이드 RN의 짧은 조각 (SgRNA), A는 디자인을 간단 하 고 저렴 한 합성. 대상 사이트에 보충 되 고, 후 Ca 효소 분자가 위 한 쌍으로 하 고 그것의 RuvC, 트, 또는 Nuc 도메인12,,1314바인딩된 DNA를 앞. 결과 두 배 좌초 휴식 (DSB)은 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR) 통로 통해 세포에 의해 연속적으로 복구 됩니다. 복구 서식 파일의 부재, DSB 단백질 코딩 유전자에 frameshift 돌연변이 일으키는 잠재적으로 야기할 수 있는 난수 삽입 또는 삭제 컷된 사이트에 뉴클레오티드 (indels), 오류가 NHEJ 통로 의해 수리는. 그러나, 원하는 DNA 변화를 포함 하는 기증자 템플릿을, 존재 DSB 고화질 HDR 통로 의해 수리는. 기증자 서식 파일의 일반적인 종류 단일 가닥 oligonucleotides (ssODNs) 및 플라스 미드 포함 됩니다. 전 반면 후자는 일반적으로 사용 하나 비교적 긴 시퀀스를 삽입 하고자 하는 경우 원하는 DNA 변경 (예: 단일 기본적인 쌍의) 작은 경우에 일반적으로 사용 됩니다 (예를 들어 녹색 형광 단백질의 코딩 순서 또는 GFP) 대상 장소에.
Cas 단백질의 endonuclease 활동 대상 사이트15에 protospacer 인접 한 모티프 (PAM)의 존재를 요구 한다. Cas9의 팸은 protospacer의 3' 끝에는 PAM의 Cas12a (Cpf1 라고도 함)는 5' 끝에 대신 하는 동안16. Cas-가이드 복잡 한 RNA는 PAM은17에 결 석 하는 경우는 DSB 소개 하 수 없습니다. 따라서, PAM 특정 Ca nuclease 쪼개 다 수가 게놈 위치에 제약 조건을 배치 합니다. 다행히, 다른 세균 종에서 Cas nucleases 일반적으로 다른 팸 요구를 전시 한다. 따라서, 우리의 엔지니어링 도구 상자에 다양 한 CRISPR Cas 시스템을 통합, 우리는 게놈에 타겟이 될 수 있습니다 사이트의 범위를 확장할 수 있습니다. 또한, 자연 Ca 효소 설계 수 있습니다 또는 대체 팸 시퀀스, 게놈 목표 조작18,,1920에 액세스할 수의 범위를 더욱 확대 인식 진화.
여러 CRISPR Cas 시스템 게놈 기술 설계 목적을 위해 사용할 수 있지만, 기술의 대부분의 사용자는 여러 이유로 주로 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 nuclease에 의존 했습니다. 첫째,이 상대적으로 단순히 NGG 팸, 더 복잡 한 PAMs 존재만 쪼개 다 수 다른 많은 Ca 단백질 달리 필요 합니다. 둘째, 인간의 세포21,,2223,24에 성공적으로 배포 하는 첫 번째 Ca endonuclease 이다. 셋째, SpCas9까지 날짜에 최고의 특징이 효소 이다. 연구자 다른 Cas nuclease 사용 하고자 하는 경우 그 또는 그녀가 종종 것 디자인 실험 및 다른 효소 SpCas9에 비해 다른 생물학 문맥에서 얼마나 잘 수행 하는 최선의 방법에 대 한 명확한.
다른 CRISPR Cas 시스템의 상대적인 성능에 선명도 제공 하려면 우리 최근 포도 상 구 균 (SaCas9), 에서 Cas9 효소에서에서 Cas9 효소 5 개의 Ca endonucleases-SpCas9의 체계적인 비교를 수행 했습니다. Neisseria meningitidis (NmCas9) (AsCas12a)에 Acidaminococcus sp. BV3L6에서에서 Cas12a의 효소 및 Cas12a 효소 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006에서에서 (LbCas12a)25. 공정한 비교를 위해 우리는 다른 실험 조건 및 대상 사이트의 동일한 세트를 사용 하 여 다양 한 Cas nucleases 평가. 연구 또한 delineated 디자인 매개 변수 각 CRISPR Cas 시스템 기술의 사용자를 위한 유용한 참고 자료 역할을. 여기, 더 나은 CRISPR Cas 사용 하도록 연구 활성화 시스템, 다른 Cas9 및 Cas12a 효소 ( 그림 1참조)로 최적의 게놈 엔지니어링에 대 한 단계별 프로토콜 제공. 프로토콜 뿐만 아니라 포유류 세포에서 게놈 성공적인 엔지니어링 결과의 가능성을 최대화 하기 또한 중요 한 디자인 고려 하지만 실험 내용을 포함 합니다.
그림 1 : 게놈을 생성 하는 워크플로 개요 편집 인간의 세포 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
1입니다. sgRNAs의 디자인
- 적절 한 CRISPR-Cas 시스템을 선택 합니다.
- 첫째, 모든 Cas9 및 Cas12a nucleases 포유류 세포16,21-32에 작동 표시 되어의 팸 시퀀스에 대 한 대상 영역을 검사 합니다. 5 자주 사용된 효소 그들의 각각 PAMs 함께 표 1 에 주어진 다.
참고: 외는 endonucleases 성공적으로 배포 된 포유류 세포 뿐만 아니라, 연쇄 상 구 균 thermophilus (St1Cas9)에서 Cas9 nuclease 같은 다른 보다 적게 일반적으로 사용 되 Ca 효소는 표 1에 나열 된, 그 PAM NNAGAAW를 인식합니다. 원하는 대상 사이트 알려진된 팸 포함 되어 있지 않으면, 다음 하나 것 없을 게놈 엔지니어링에 대 한 CRISPR-Cas 시스템을 사용 하 여. - 둘째, 대상 게놈 소재 시 또는 유전자의 알려진된 속성을 고려 하십시오. 유전자 표현 수준이 나 chromatin 접근성 고려 일부 속성 포함 하 고 있는지 다른 밀접 하 게 관련 시퀀스 뿐만.
참고: 특정 효소는 더 나은 특정 생물 학적 상황에 적합 합니다. 예를 들어 반복 genomic 소재 시 또는 여러 다른 가까운 paralogs 가진 유전자를 편집 하려면 것이 좋습니다 (SpCas9와 LbCas12a 보다는 sgRNA와 표적 DNA 사이의 불일치에 대 한 낮은 관용) 때문에 어느 AsCas12a를 사용 하 여 또는 SaCas9 (때문에 그 더 높은 대상 특이성을 제공 하 긴 공백에 대 한 요구)25.
- 첫째, 모든 Cas9 및 Cas12a nucleases 포유류 세포16,21-32에 작동 표시 되어의 팸 시퀀스에 대 한 대상 영역을 검사 합니다. 5 자주 사용된 효소 그들의 각각 PAMs 함께 표 1 에 주어진 다.
| Cas Endonuclease | 팸 | 최적의 공백 길이 |
| SpCas9 | NGG | 17-22 nt 포함 |
| SaCas9 | NNGRRT | ≥ 21 nt |
| NmCas9 | NNNNGATT | ≥ 19 nt |
| AsCas12a 및 LbCas12a | TTTV | ≥ 19 nt |
표 1: 일부는 일반적으로 그들의 동족 PAMs와 최적의 sgRNA 길이 Ca 효소를 사용. N = 모든 뉴클레오티드 (A, T, G, 또는 C); R = A 또는 G; V = A, C, 또는 g.
- 적당 한 공백 시퀀스를 선택 합니다. 식별 가능한 폭발33 와 대상 게놈을 검사 하거나 여러 자유롭게 사용 가능한 온라인 도구를 사용 하 여 대상에서 분열 이벤트의 위험을 최소화 하는 독특한 시퀀스: Feng 장 연구소34에서에서 (a) 프로그램 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (c) 전자-선명36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
참고: 최적의 길이 스페이서의 17 25 뉴클레오티드 (nt) 포함 하는 Ca에 따라 효소는에서 다를 수 있습니다 ( 표 1참조). Cas9는 스페이서, PAM의 상류는 Cas12a에 스페이서는 또한 PAM.의 하류, HDR 효율 컷된 사이트에서 거리 증가 함께 급속 하 게 떨어진다. 따라서, 정확한 DNA 편집, sgRNA 의도 수정 사이트에 최대한 가까이 배치 합니다. - 사용 중인 CRISPR 플라스 미드에 대 한 적절 한 돌출부와 DNA oligonucleotides 음성 합성.
- 가이드의 첫 번째 위치는 스페이서의 역방향 보완 시퀀스 G. 확인 하지 않으면는 스페이서 앞 G 뉴클레오티드를 추가 합니다. 목적으로 복제에 대 한 필요한 돌출부에 추가 합니다.
참고: 그림, 우리의 평가 연구25에서 사용 되는 플라스 미드를 통해 합성을 oligonucleotides 표 2에 표시 됩니다. 가이드로, 그림 2 에서 예제를 사용 하 여 필요한 경우. 많은 CRISPR 플라스 미드 상용 소스 (예: Addgene)에서 사용할 수 있습니다. 일부는 더 인기 있는 플라스 미드의 재료의 테이블에에서 부여 됩니다.
- 가이드의 첫 번째 위치는 스페이서의 역방향 보완 시퀀스 G. 확인 하지 않으면는 스페이서 앞 G 뉴클레오티드를 추가 합니다. 목적으로 복제에 대 한 필요한 돌출부에 추가 합니다.
| CRISPR 플라스 미드 | 시퀀스 |
| pSpCas9 및 pSaCas9 | 감각: 5 '-CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' Antisense: 3 '-(C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5' |
| pNmCas9 | 감각: 5 '-CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' Antisense: 3 '-(C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC-5' |
| pAsCas12a 및 pLbCas12a | 감각: 5 '-AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' Antisense: 3 '-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA-5' |
표 2: Oligonucleotides sgRNA 시퀀스는 최근 평가에 사용 되는 CRISPR 플라스 미드에 클로닝에 필요한 연구25. 돌출부는 이탤릭체는.
그림 2 : 대상 사이트를 선택 하 고 디자인 oligonucleotides CRISPR 플라스 미드로 복제 하는 방법을 보여주는 예. 대상 게놈 소재 시 여기 인간 CACNA1D 유전자의 엑손 45입니다. PAMs SpCas9 및 SaCas9은 각각 NGG 및 NNGRRT AsCas12a에 대 한 PAM 동안 빨간색으로 강조 표시 됩니다와 LbCas12a TTTN 이며 녹색으로 강조 표시 됩니다. 빨간색 가로 막대가 녹색 수평 막대 나타냅니다 두 Cas12a 효소에 대 한 protospacer SpCas9 및 SaCas9는 protospacer를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 복제 oligonucleotides 백본 벡터에의
- Phosphorylate 고 감각과 antisense oligonucleotides anneal.
- 경우는 oligonucleotides는 동결 건조 된, 트리 스-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 100 µ M 농도에 그들을 resuspend (TE 버퍼 테이블의 자료를 참조 하십시오) 또는 ddH2o.
- 10 µ L 반응 혼합 감각 oligonucleotide, 센스 oligonucleotide의 1 µ L, T4 DNA 리가 버퍼 (10 배), T4 polynucleotide 키 니 아 제 (PNK)의 1 µ L 그리고 ddH2오 믹스의 6 µ L의 1 µ L의 1 µ L를 포함 하는 pipetting에 의해 잘 준비 하 고 반응 혼합 열 사이에 배치 다음 매개 변수를 사용 하 여 cler: 30 분, 5 분 및 경사 6 ° C/min에서 25 ° c 95 ° C에 대 한 37 ° C.
- 반응 혼합 1: 100 ddH2O (예를 들어, 2 µ L 반응 혼합 + 198 µ L ddH2O)를 희석.
그림 3 : CRISPR 플라스 미드의 예. (한) A 지도 플라스 미드의 다른 중요 한 특징을 나타내는. 여기, EF-1a 발기인 U6 발기인은 sgRNA의 식을 하는 동안 Cas9의 식을 드라이브. Amp(R)는 플라스 미드에는 암 피 실린-저항 유전자를 나타냅니다. (b) 플라스 미드에 "BbsI BplI 복제 사이트"의 순서. BbsI 인식 순서 GAAGAC 이며 BplI의 인식 순서는 개 그-N5하는 동안 빨간색으로 표시 됩니다-CTC 녹색으로 표시 됩니다. (c) sgRNA 시퀀스 플라스 미드에 성공적으로 복제 되었습니다 여부를 확인 하려면 식민지 PCR에 사용 될 수 있는 뇌관. 보편적인 M13R(-20) 뇌관 플라스 미드에 분홍색 화살표로 표시 됩니다 동안 hU6_forward 뇌관 플라스 미드 지도에 보라색 화살표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- CRISPR 플라스 미드는 적절 한 제한 효소로 다이제스트.
참고: IIs 제한 효소 타입으로 골든 게이트 어셈블리에 의존 일반적으로 sgRNAs의 클로닝. 다른 효소는 다른 CRISPR 플라스 미드에 대 한 사용할 수 있습니다. PSpCas9, BbsI 또는 BplI 사용 ( 그림 3참조). PSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a, 및 pLbCas12a, BsmBI를 사용 합니다.- 포함 하는 원형 플라스 미드 벡터의 1 µ g 20 µ L 반응 믹스를 준비, 버퍼 (10 배)의 2 µ L, 1 µ L의 제한 효소 (예: BbsI, BplI, 또는 BsmBI), 그리고 ddH2O 20 µ L의 최종 볼륨을 품 어 2.5 h에 대 한 37 ° C에서 반응.
- 새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SAP)의 1 µ L, 반응에 추가 하 고 다른 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- DNA 로드 x 6의 5 µ L을 추가 하 여 반응 끄다 염색 ( 재료의 표참조), 혼합, 그리고 해결 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼 x 1와 0.8 %agarose 젤에 반응. 그런 다음 삭제할 올바른 밴드 하 고 젤을 선형화 벡터를 정화.
- 단련된 oligonucleotides 소화 CRISPR 플라스 미드에 선.
- 10 µ L 반응 혼합 준비: 50 선형화 벡터, 희석된 단련된 oligonucleotides의 1 µ L, T4 DNA 리가 버퍼 (10 배)의 1 µ L, T4 DNA 리가 및 ddH2O 10 µ L의 최종 볼륨을 1 µ L의 ng ( 재료의 표참조). 반응에서 16 ° C 하룻밤 또는 2 h에 대 한 실 온에서 품 어.
참고: 프로세스의 속도를 내 고, 집중된 T4 DNA 리가 사용을 15 분 동안 실 온에서 반응 혼합물을 품 어 ( 재료의 표참조).
- 10 µ L 반응 혼합 준비: 50 선형화 벡터, 희석된 단련된 oligonucleotides의 1 µ L, T4 DNA 리가 버퍼 (10 배)의 1 µ L, T4 DNA 리가 및 ddH2O 10 µ L의 최종 볼륨을 1 µ L의 ng ( 재료의 표참조). 반응에서 16 ° C 하룻밤 또는 2 h에 대 한 실 온에서 품 어.
- 화학적으로 유능한 대장균 으로 합자 제품 변형 세포 ( 보조 파일 1참조). 100 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 한 천 배지에서 변형 된 세균성 세포 확산.
- 식민지 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 박테리아를 식별 하기 위해 삽입 수행 합니다.
- 살 균 PCR 스트립 튜브의 두 세트를 준비 합니다. 설정 1에서 ddH2세트 2에서 O의 4.7 µ L을 추가, 적절 한 항생제 (예, 100 µ g/mL 암 피 실린)와 파운드 국물의 50 µ L을 추가.
- 살 균 피 펫 팁, 접시에서 식민지를 선택 하 고 설정 1 관에서 짧게 슬쩍 팁 설정 2 관에서. 때마다 다른 PCR 튜브를 사용 하는 몇 가지 식민지를 반복 합니다.
참고: 일반적으로 4 개의 식민지를 상영은 충분 합니다. 그러나,이 복제 효율에 따라 달라질 수 있습니다. - 다음 시 약 각 설정 1 튜브 (는 10 µ L PCR)에 대 한 추가: 2 x PCR 마스터 믹스의 5 µ L (염료를 로드 테이블의 자료참조), 감각 또는 antisense oligonucleotide (100 µ M), 뇌관 (100 µ M) CRISPR 플라스 미드 하류를 대상으로 또는 최대 0.15 µ L의 0.15 µ L sgRNA 카세트의 스트림 각각 ( 그림 3참조).
참고: PCR 제품 이상적으로 대략 150의 제품 크기를 산출 해야 한다 혈압 또는 더 큰, 모든 긍정적인 밴드는 뇌관 이합체로 착각 하지. - PCRs 다음 매개 변수를 사용 하 여 열 cycler에서 실행: 95 ° C 30에 대 일 분 동안 95 ° C 30에 대 한 60 ° C (2 단계), s s (3 단계), 72 ° C 30에 대 한 s (단계 4), 또 다른 34 주기를 5 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124를 반복 4 ° c.에서 개최
참고: 60 ° C의 어 닐 링 온도 뇌관 설계에 대 한 최적화를 할 수 있습니다. 30의 신장 시간 s 예상된 PCR amplicon 크기와 사용 하는 DNA 중 합 효소에 따라 다를 수 있습니다. - 해결 1 x TAE 버퍼를 사용 하 여 1 %agarose 젤에 반응.
- 적절 한 항생제와 5 mL 파운드를 포함 하는 더 큰 원뿔 관으로 해당 설정 2 관에서 그것의 문화의 50 µ L를 전송 하 여 PCR에 긍정적인 밴드를 생성 하는 식민지 접종 문화 인큐베이터 통 37 ° C에 하룻밤 성장 하자.
- 플라스 미드는 하룻밤 문화는 miniprep ( 재료의 표참조) 키트와 사용 감각 또는 antisense oligonucleotide (hU6_forward 또는 M13R(-20) 그림3에서)은 식민지 PCR 뇌관을 사용 하 여 샘플 시퀀스를 격리 합니다.
참고: 필요한 경우 다운스트림 실험에 대 한 더 큰 금액을 얻기 위해 시퀀스 확인 CRISPR 플라스 미드의 maxiprep를 수행 합니다.
3. 디자인의 복구 템플릿 및 합성
참고: 정밀 게놈 엔지니어링에 대 한 템플릿을 지정 하 여 원하는 DNA 수정 CRISPR 시 약 함께 제공 될 필요 합니다. 단일 뉴클레오티드의 변경 같은 작은 DNA 편집을 위해 가장 적합 한 (섹션 3.1 참조)는 ssODN 기증자 템플릿. 5' 또는 3' 특정 단백질 코딩 유전자의 태그는 GFP의 삽입 등 더 큰 DNA 편집에 대 한, 플라스 미드 기증자 템플릿은 가장 적합 한 (섹션 3.2 참조).
- 설계 및 합성 ssODN 기증자 템플릿 ( 그림 4참조).
- 올바른 물가 템플릿을 따라야 그 순서를 결정 합니다.
참고: Cas12a 전시 비 대상 가닥 시퀀스의 ssODNs에 대 한 선호 대상 가닥의 ssODNs 시퀀스 대신25 에 대 한 특혜를 전시 하는 Cas9 동안 (참조 그림 4는). - 복구 순서는 대상 선택한 Ca nuclease에 의해 다시 확인 합니다. 예를 들어 아미노산 변화는 같은 방식으로 PAM을 변형 또는 기능 결과 경우 기증자 템플릿에서 팸을 제거. 그림 4b 에 가이드로, 주어진 예제를 사용 하 여 필요한 경우.
- 대칭 또는 비대칭 기증 템플릿을 원하는 경우 결정 합니다. 대칭 기증자에 대 한 각 상 동 팔 DNA 수정 사이트 측면에 서는 적어도 17 nt 긴25확인 합니다. 비대칭 기증 서식 파일에 대 한 원하는 DNA 변화를 (참조 그림 4는)의 더 긴 팔 5 '를 사용 합니다. 중요 한 것은, 짧은 팔 약 37 인지 확인 길이, 다른 상 동 팔은 약 77 nt nt 길이25,39.
- 단일 가닥 DNA의 조각으로 디자인 된 서식 파일을 음성 합성.
참고: 비대칭 ssODNs 수 있습니다, 하지만 항상 안, 대칭 ssODNs 보다 높은 HDR 효율성을 전시. 일반적으로 비대칭 기증자는 일반적으로 적어도 대칭 기증자 뿐만 아니라 때 수행 올바르게 설계 합니다. 그러나, 비대칭 템플릿 오래 이며 따라서 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 정화 또는 특별 한 합성 절차를 필요로 하기 때문에 훨씬 더 많은 비용. 일상적인 유전자 녹아웃 보통 NHEJ 복구 경로에 의존 하 고 복구 서식 파일을 필요 하지 않습니다. 그러나 녹아웃 효율 낮은 경우 frameshift 돌연변이 포함 하 고 적어도 120 ssODN 기증자 서식 파일을 디자인 하는, 길이25,40에서 nt.
- 올바른 물가 템플릿을 따라야 그 순서를 결정 합니다.
그림 4 : SsODN 기증자 서식 파일의 디자인. (a) 다양 한 가능한 디자인을 보여주는 회로도. 빨간 가로 사각형 파란색 사각형 표시 대상 (T) 가닥 동안 비 대상 (NT) 가닥을 나타냅니다. 또한, 작은 녹색 사각형 나타냅니다 (예: 단일 뉴클레오티드 변화) 원하는 DNA 수정. 각 상 동 팔의 최소 길이 최소한 17 이어야 한다 대칭 ssODN을 사용 하는 경우 nt (하지만 더 이상 있을 수 있습니다). 비대칭 ssODNs에 대 한 37/77 T ssODN 77/37 NT ssODN Cas12a 유도 HDR에 대 한 최적의 나타납니다 동안 SpCas9 유도 HDR에 대 한 최적의 것 처럼 보인다. L = 왼쪽된 상 동 팔; R = 오른쪽 상 동 팔. (b) ssODN 서식 파일을 디자인 하는 방법을 보여 주는 구체적인 예 를. 여기, 대상 게놈 소재 시 exon 인간 CACNA1D 유전자의 45입니다. PAM은 Cas9는 분홍색과 밑줄, Cas12a 갈색을 위한 PAM을 동안 및 밑줄. 목표 (아르기닌 인코딩) AGG에 AGU (떠들고 인코딩) 변환 하 여 missense 돌연변이 (에서 강조 표시 된 녹색)를 만드는 것입니다. 를 방지 하기 위해 Cas12a에 의해 재 타겟팅 TTTC 팸 CTTC에 돌연변이 이다. Note는 (UAU 및 UAC 모두 코드 티로신) 아미노산에 변화가 없습니다. 추가 방지 하기 위해 Cas9에 의해 재 타겟팅 AGU codon (굵게), UCC codon 바뀝니다 떠들고에 대 한 코드의 둘 다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 디자인과 적절 한 플라스 미드 기증자 서식 파일 복제. 예를 들어 그것은 동종 대상 게놈 소재 시에는 긴 팔을가지고 있는 GFP 시퀀스를 포함할 수 있습니다 ( 그림 5참조).
- 수정 된 시퀀스는 선택한 Ca nuclease에 의해 대상 다시 확인 합니다. 예를 들어 protospacer는 삽입된 (GFP) 태그에 의해 분할 수 있습니다. 또는, PAM 돌연변이 수 있습니다 하거나 유전자 기능에는 영향을 주지 않는 방식으로 기증자 서식 파일에서 제거 합니다.
- 게놈 DNA는 PCR를 사용 하 여에서 상 동 팔을 증폭. 각 상 동 팔의 길이 일반적으로 1000 1500 bp입니다.
참고: 복제를 촉진 하기 위하여 있는지 확인 전달 뇌관 homology 왼쪽된 팔과 오른쪽 상 동에 대 한 역방향 뇌관 각 팔에 대 한 최소 20 nt 선택한 벡터 백본이 있는 시퀀스를 중복. 또한, 왼쪽된 상 동 팔 역 뇌관과 오른쪽 상 동 팔 앞으로 뇌관은 또한에 피토 프 태그와 일부 겹치는 시퀀스 확인 합니다. - 두 상 동 팔, (GFP) 태그 깁슨 어셈블리41 을 사용 하 여 벡터 등뼈에 복제 ( 재료의 표참조). 생어 시퀀싱 앞으로 사용 하 여 플라스 미드를 확인 하 고는 업스트림 및 다운스트림 기증자 서식 파일의 각각 뇌관을 역방향.
참고: 생어 시퀀싱은 광범위 하 고 저렴 하 게 사용할 수 있는 상업적인 서비스. 서비스 공급자를 시퀀싱 뇌관 함께 플라스 미드의 약 수를 보냅니다. - 만 한 번 왼쪽된 상 동 팔의 업스트림 또는 다운스트림 오른쪽 상 동 팔의 플라스 미드를 인하 하는 제한 효소와 기증자 서식 파일 선형화
참고: 최근에, sgRNA-PAM 시퀀스에 의해 형벌 이다, 분열 후 해당 Ca nuclease 플라스 미드에서 발표 되는 더블 컷 기증자 표시 되었습니다 HDR 효율42증가. SgRNA-PAM 시퀀스 상류 삽입 됩니다 (예를 들어 깁슨 어셈블리)에 의해 각각 왼쪽 및 오른쪽 homology의 다운스트림 팔 때 상 동 팔 길이 300을 줄일 수 있습니다 혈압 그리고 플라스 미드를 선형화를 필요가 없습니다.
그림 5 : 설계 및 플라스 미드 기증자 템플릿의 복제. (한)이 목표 구체적인 예 P2A-GFP CLTA 단백질의 C-말단에 융합 하입니다. 빨간색 가로 사각형 오른쪽 상 동 팔을 나타냅니다 파란색 가로 사각형 왼쪽된 상 동 팔을 나타냅니다. 대문자 소문자 비 코딩 시퀀스를 표시 하는 동안 단백질 코딩 시퀀스를 나타냅니다. SpCas9 및 Cas12a PAMs 이탤릭체 고 밑줄. (b) 플라스 미드 기증자 endogenously P2A GFP CLTA의 C-말단에 태그를 사용할 수 있는 템플릿. 제공 된 뇌관 시퀀스 깁슨 어셈블리에서 플라스 미드 복제를 사용할 수 있습니다. PCR 조건은 다음과 같습니다: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 63 ° C 30에 대 한 s (3 단계), 72 ° C 1 분 (4 단계)에 대 한 또 다른 34 주기, 3 분, 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124를 반복 하 고 4 ° c.에서 개최 벡터 시퀀스에 해당 하는 검은 글자, 왼쪽된 상 동 팔에 해당 하는 파란색 글자, P2A GFP에 해당 하는 녹색 편지 그리고 오른쪽 상 동 팔에 해당 하는 붉은 글자. P2A GFP 인코딩 시퀀스는 성공적으로 대상 로커 스에 통합 되어, 일단 SpCas9 여 재 타겟팅 되지 것입니다, 유일한 9 이후는 protospacer (GTGCACCAG)의 nt는 그대로 남아 있을 것입니다. 또한, Cas12a, 3 basepairs에 의해 재 타겟팅 하는 것을 막기 위해 즉시 중지점의 다운스트림 (굵게)에 codon 플라스 미드 시퀀스에서 삭제 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
4. 세포 transfection
참고: 프로토콜의 나머지 부분은 마음에 HEK293T 세포로 작성 됩니다. 문화 매체 사용의 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 4.5 g/L 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 m L-글루타민, m과 0.1% 페니실린/스 보충 구성 됩니다. 프로토콜의 다른 단계는 사용 하는 실제 셀 라인에 따라 수정할 할 수 있습니다. 모든 셀 문화 작업 살 균 작업 환경을 보장 하려면 클래스 2 Biosafety 내각에서 이루어집니다.
- 24-잘 조직 문화 접시 한 전날 transfection에에서 시드 1.8 × 105 셀.
- 미디어를 발음 150 µ L을 0.25% 추가 하 여 셀을 해리 트립 신-EDTA 잘 당. 2 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
- 세포 배양의 150 µ L (또는 1 x 볼륨)를 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 5 분 동안 1000 x g 에서 벤치 가기 원심 분리기에 셀 아래로 회전 합니다.
- 상쾌한, 발음 그리고 세포 배양의 5 mL와 함께 resuspend. 별도 원심 분리기 튜브, 0.4 %trypan 블루 솔루션의 aliquot 10 µ L에서. 그런 다음 단계의 4.1.2 10 µ L resuspended 셀에 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
- (셀 + trypan blue) 혼합물의 10 µ L를 hemocytometer로 플라스틱. 수동으로 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 셀로 이동 합니다.
- 24-잘 조직 배양 접시의 한 잘에 시드 1.8 × 105 셀.
- Transfection 믹스 중 500을 포함 준비 (NHEJ 중재 편집)에 대 한 CRISPR 플라스 미드 또는 300의 ng CRISPR 플라스 미드 및 300의 ng ng transfection 시 약 (참조 함께 제공 된 지침에 따라 (편집을 위해 HDR-중재), 기증자 서식 파일의 재료의 표). (일반적으로 주위에 10\u201220 분) 권장된 시간 동안 실 온에서 품 어.
- Transfection 믹스 dropwise 패션 셀에 추가 하 고 부드럽게 후 접시에 소용돌이.
- 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 공기 인큐베이터 (NHEJ 기반 실험)에 대 한 24 시간 또는 72 h (HDR 기반 실험)에 대 한.
5. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)의 transfected 세포
- 미디어를 발음 잘 당 0.25% trypsin EDTA의 150 µ L 추가 하 여 세포를 분리. 2 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
- 세포 배양의 150 µ L (또는 1 x 볼륨)를 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 235 x g 5 분에서 microcentrifuge에 셀 아래로 회전 합니다.
- 상쾌한 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 셀을 resuspend. 30 µ m 메쉬를 통해 셀 필터링 또는 여과기 5 mL FACS 튜브에 세포.
- 약 100 µ L 문화 미디어 또는 2% 다른 원심 분리기 튜브 준비 FBS 셀의 컬렉션에 대 한 PBS에.
- 교류 cytometer에서 부정적인 제어로 비 페 셀과 셀 게이트. 정렬 하 고 있는 형광에 따르면 마커 사용 CRISPR 플라스 미드에 존재 하는 transfected 세포를 수집 합니다. 예를 들어 만약 플라스 미드 mCherry 유전자 운반, RFP 긍정적인 세포에 대 한 정렬.
참고: 다른 CRISPR 플라스 미드 다른 선택 가능한 마커를 있을 것 이다. 플라스 미드 (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1, 및 pLbCpf1)이 평가 연구에 사용 된 세트 오렌지 형광 성 단백질 (OFP) 또는 mCherry 유전자를 나 른 다.
6입니다. 개별 클론의 확장
- 정렬된 셀 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 최대 속도 (18000 x g) 벤치 가기 원심 분리기에 원심 고 300 µ L 문화 미디어와 펠 릿을 resuspend. 24-잘 조직 문화 접시에 200 µ L 셀 씨와 37 ° C 배양 기에서 몇 일 동안 복구 하자. 섹션 7에 대 한 나머지 100 µ L 셀을 계속.
- 일단 셀 confluent 되기 시작, 단계 4.1.1\u20124.1.3에 따르면 그들을 통과. 개별 식민지 성장을 위한 충분 한 공간이 있도록 100 m m 조직 문화 접시에 띄엄띄엄 셀 씨. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 공기 인큐베이터.
참고: 다양 한 희석을 보십시오. 단일 셀 개별 식민지로 성장에 충분 한 공간이 필요 합니다. 그러나, 그들은 또한 수 없습니다 지나치게 부족으로 일부 셀 라인 셀의 수는 부족 하는 때에 잘 성장 하지 않는다. - 일단 식민지 시작 양식, (4 배 확대)와 현미경 아래에서 그들을 선택 하 고 각 복제 세포 배양을 포함 하는 24-잘 접시의 개별 잘 합니다. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 공기 인큐베이터까지 셀 confluent 되고있다.
참고: 직렬 희석 및 식민지 따기 하는 대신 cytometry 96 잘 접시로 단일 셀에 대 한 정렬 하는데 사용 하는. 그러나,이 하나의 셀만 있는 경우에 잘 성장 하지 않는 일부 셀 라인에 대 한 작동 하지 않을 수 있습니다.
7입니다. 편집 효율 평가
- 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 최대 속도 (18000 x g) 벤치 가기 원심 분리기에 (단계 6.1)에서 나머지 100 µ L 정렬 셀 centrifuging 여 genomic DNA를 추출 하 고 게놈 DNA 추출 킷 (참조 테이블의 사용 하 여 격리를 진행합니다 재료).
- T7 endonuclease 수행 (T7EI) 나 분열 분석 결과 ( 그림 6참조).
- 50 µ L PCR 반응 버퍼 (5 배), dNTP 믹스 (10mm), 사용자 정의 앞으로 뇌관 (10 µ M), 사용자 정의 반전 뇌관 (10 µ M), DNA 중 합 효소, (에 따라 얼마나 많은 세포 게놈 DNA 템플렛의 2\u20125 µ L의 0.5 µ L의 2.5 µ L의 2.5 µ L의 1 µ L의 10 µ L을 포함 하는 PCR 설정 되어 정렬), 다음 ddH2O 50 µ L까지 가기 ( 재료의 표참조).
참고: 뇌관 설계 되었습니다 T7EI 분석 결과의 결과 두 가지 밴드는 ag 대상 게놈 소재 시 및 수율의 PCR 제품 400\u2012700 bp. 보통 한 뇌관 주변 다른 뇌관 보다는 Ca 효소의 컷된 사이트에 가까이 위치를 측면을 젤을 일어났다 ( 그림 6참조). - 다음 매개 변수 열 cycler에서 PCR을 실행: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 63 ° C 30에 대 한 s (3 단계), 72 ° C 30에 대 한 s (단계 4), 또 다른 34 주기를 2 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124 반복 4 ° c.에서 개최
- 해결 1 x TAE 버퍼를 사용 하 여 2 %agarose 젤에 반응.
- 깨끗 하 고 날카로운 메스로 젤에서 PCR 제품 소비 세 하 고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 260 nm 흡 광도의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 PCR 제품의 농도 측정 ( 재료의 표참조).
- 200를 포함 하는 분석 결과 믹스를 준비 DNA, T7EI 반응의 2 µ L의 ng 버퍼 (10 배), 그리고 ddH2O 최대 19 µ L 돌파 ( 재료의 표참조).
- 다음 매개 변수를 사용 하 여 열 cycler에 PCR 제품을 다시 anneal: 95 ° C 5 분, 25 ° c에서 6 ° C/분, 램프에 대 한 다음 4 ° c.에서 개최
- 다시 단련된 PCR 제품을 5 U T7EI를 추가 하 고 pipetting, 잘 혼합 일 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 1 x TAE 버퍼를 사용 하 여 2.5 %agarose 젤에 T7EI 소화 DNA를 해결.
- 젤 이미지, 계량 ImageJ를 사용 하 여 밴드 농도 및 indel 형성 다음 수식을 사용 하 여 계산:
어디는 나타내는 그대로 PCR 제품 및 b와 c의 강도 분열 제품43의 농도에 해당 합니다.- ImageJ에 밴드의 강도 계량, 먼저 가능한 경계 주변으로 밴드 주위 직사각형 상자를 그립니다. 둘째, 분석 하 고 측정 설정클릭 합니다. 지역, 회색 값을 의미, 그리고 통합된 밀도 옵션 체크 확인 하십시오. 확인을 클릭 하 여 설정 창을 종료 합니다. 셋째, 클릭 분석 및 측정. 평균 또는 RawIntDen 값 밴드 강도 사용 됩니다.
- 50 µ L PCR 반응 버퍼 (5 배), dNTP 믹스 (10mm), 사용자 정의 앞으로 뇌관 (10 µ M), 사용자 정의 반전 뇌관 (10 µ M), DNA 중 합 효소, (에 따라 얼마나 많은 세포 게놈 DNA 템플렛의 2\u20125 µ L의 0.5 µ L의 2.5 µ L의 2.5 µ L의 1 µ L의 10 µ L을 포함 하는 PCR 설정 되어 정렬), 다음 ddH2O 50 µ L까지 가기 ( 재료의 표참조).
그림 6 : 성공적인 게놈 편집 결과 대 한 셀을 확인. 2 일반적으로 설명 (a) A 회로도 분석 실험을 사용, 즉 불일치 분열 분석 결과 T7 endonuclease와 나 (T7EI) 효소와 다음 세대 시퀀싱 (NGS) 또는 타겟된 amplicon 시퀀싱 합니다. 파란색 가로 사각형 DNA와 노란색 원 표시 수정 CRISPR Cas 시스템에 의해 유도 된 나타냅니다. NGS amplicons 생성을 위한 프라이 머는 빨간색으로 표시 하는 동안 T7E1 분석 결과 대 한 프라이 머는 녹색으로 표시 됩니다. (b) 뇌관 설계의 시퀀스 및 NGS T7EI 분열 분석 결과 대 한. 여기, 대상 게놈 소재 시 exon 인간 CACNA1D 유전자의 45입니다. 원하는 수정 사이트는 별표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 타겟된 amplicon 시퀀싱을 수행 ( 그림 6참조).
- 대상 게놈 소재 시 증폭 PCR 뇌관 디자인. 100 미만 뇌관 중 하나 위치 20 개 이상 하지만 bp bp는 protospacer에서.
참고: 일반적으로, 총 PCR 제품의 크기는 수 있도록 설계 되었습니다 150\u2012300 bp 주위 ( 그림 6참조). - 뇌관에 다음과 같이 추가 시퀀스를 추가: (a) 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC-NNNN-[앞으로]-뇌관 3'; (b) 5'-GTGCTCTTCCGATCT-[반전 뇌관]-3 '.
- PCR 반응 버퍼 (5 배), dNTP (10 m m)의 1 µ L, 뇌관 (10 µ M), 뇌관 b (10 µ M), 0.5 µ L DNA 중 합 효소, (에 따라 얼마나 많은 셀 정렬 되었습니다) 2\u20125 µ L genomic DNA 템플렛의 5 µ L의 5 µ L 10 µ L를 포함 된 50 µ L PCR 반응 혼합 설정 다음 50 µ L ddH20 탑.
- 다음 매개 변수 열 cycler에서 PCR을 실행: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 63 ° C 30에 대 한 s (3 단계), 72 ° C 15에 대 한 s (단계 4), 또 다른 34 주기를 2 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124 반복 4 ° c.에서 개최
- 해결 2 %agarose 젤에 반응 하 고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화. 260 nm 흡 광도의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA를 계량 ( 재료의 표참조).
- 2 PCR 뇌관 라운드 다음 합성: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3 (c) 5' \u2012'; (d) 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[바코드]-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
- 설정 20 µ L PCR 반응 혼합 포함 4 µ L PCR 반응 버퍼 (5 배), dNTP (10 m m), 뇌관 c (10 µ M), 뇌관 d (10 µ M), DNA 중 합 효소, DNA 템플릿 (단계 7.3.5 오디오의 2 µ L의 0.2 µ L의 2 µ L의 2 µ L의 0.4 µ L의 1: 100 희석), 및 9.4 µ L ddH2o.
참고: DNA 템플렛에 대 한 희석 비율의 원래 농도 따라 달라질 수 있습니다. 농도 20\u201240 ng / µ L 주위, 1: 100 희석 비율을 사용 합니다. 또한, 경우 각 실험 샘플에 대 한 다른 바코드를 선택 같은 뇌관은 뇌관 b 단계 7.3.3에서에서 사용 됩니다. - 다음 매개 변수 열 cycler에서 PCR을 실행: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 30 위한 65 ° C s (3 단계), 72 ° C 30에 대 한 s (단계 4), 또 다른 14 주기를 2 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124 반복 그리고 개최 4 ° C.
- 5 µ L를 확인 하는 PCRs. 결합의 성공 모든 샘플 함께 (가정 다른 바코드 각 샘플에 대 한 사용 되었습니다) 2 %agarose 젤에 각 반응의 해결 및 제조 업체의에 따르면 PCR 정화 키트를 사용 하 여 풀링된 DNA를 정리 지침입니다. PCRs의 일부 전시 이상의 악대 (일반적인 제품의 존재를 나타내는), 만약 추가 젤 추출 단계를 수행 합니다.
- 높은 처리량 시퀀싱 악기에 라이브러리 순서 ( 재료의 표참조) 짝된 151 bp 읽기를 생산 하는 제조업체의 지침에 따라. 읽기 1 시퀀싱 뇌관 사용자 정의 설계 이며 별도로 제공 될 수 있다. 그 순서는 다음과 같습니다: Read1_seq: 5'-CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'. 읽기 2 시퀀싱 뇌관 및 인덱스 시퀀싱 뇌관 표준 및 시 약 카트리지에서 제공 됩니다.
참고: T7EI 분석 결과 및 타겟된 amplicon 시퀀싱 통용 된다 게놈 편집의 효율성을 확인 하. 그러나, 다른 실험은 DNA 수정 도입의 종류에 따라 편집 효율성 평가를 수행할 수 있습니다. 예를 들어 제한 사이트에 대상 사이트를 만든 경우 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP) 분석 결과 수행할 수 있습니다. 그것 비슷합니다 T7EI 분석 결과 제외 하 고 금지 endonuclease PCR 제품을 대신 소화 하는 데 사용 됩니다.
- 대상 게놈 소재 시 증폭 PCR 뇌관 디자인. 100 미만 뇌관 중 하나 위치 20 개 이상 하지만 bp bp는 protospacer에서.
8입니다. 개별 클론의 심사
- 6.3 단계에서 일단 confluent 받기 시작 셀을 분할 합니다. 각 개별 복제에 대 한 나머지를 수집 하 고 단계 7.1에 따라 genomic DNA를 추출 합니다.
- 한 수정 제외 섹션 7.2에 따라 모든 개별 클론에 대 한 T7EI 분석 결과 수행 합니다. Wildtype 셀에서 대상 게놈 소재 시를 증폭 하 고 200를 사용 하는 대신 7.2.5 단계에서 테스트 DNA만 100 테스트 DNA의 믹스 100 ng ng ng wildtype DNA의.
참고: 수정된 단계에 대 한 이유는 그 어떤 클론 성공적인 biallelic 변환 받은 있을 수 있습니다 고 homozygous 돌연변이. 그러한 경우에 있을 것입니다 아무 분열 밴드 T7EI 분석 결과에서 wildtype DNA 혼합 되지 경우. - 시퀀스 T7EI 분석 결과에서 분열 밴드 하는 클론에 대상 사이트입니다.
- 증폭 단계 7.2.1–7.2.4에 따르면 수정된 genomic 소재 시.
- 다음 복제 반응 설정: PCR 제품, 소금 솔루션의 1 µ L, 이동 벡터의 1 µ L의 4 µ L ( 재료의 표참조).
- Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 적어도 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 화학적으로 유능한 대장균 반응 혼합의 3 µ L 변환 (예: TOP10 또는 Stbl3) 세포 ( 보조 파일 1참조). 50 μ g/mL 대와 파운드 한 천 배지에서 변형 된 세균성 세포 확산.
- 다음 날, 접종 파운드 액체 미디어 포함 50 μ g/mL 대 이상 10 식민지.
- 세균성 문화는 탁, 격리는 miniprep를 사용 하 여 플라스 미드 키트 ( 재료의 표참조) 하 고 앞으로 표준 M13 또는 M13 역방향 뇌관을 사용 하 여 시퀀스.
- 서쪽 오 점 (일컬어 immunoblot) (실험을 편집 하는 게놈 frameshift 돌연변이 통해 단백질 코딩 유전자에 밖으로 두드리는 포함) 하는 경우 부재 또는 타겟된 단백질의 존재를 결정을 수행 합니다. 보조 파일 1을참조 하십시오.
참고: 원하는 게놈 수정 들고 복제를 식별 하는 다른 실험을 수행할 수 있습니다. 예를 들어 phenotypic 분석 결과 세포 행동에 특정 변화를 일으키는 것으로 알려져은 특정 유전자를 노크 하는 경우 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
실험, 관심 소재 시 복제 될 필요가 타겟팅 sgRNA 표현 CRISPR 플라스 미드를 편집 하는 게놈을 수행 합니다. 첫째, 플라스 미드는 그것을 선형화 하는 제한 효소 (일반적으로 타입 IIs 효소)로 소화 된다. 완전 하 고 부분 소화 사이 구별 하는 소화 되지 않은 플라스 미드와 함께 1 %agarose 젤에 소화 제품을 확인 하는 것이 좋습니다. 소화 되지 않은 플라스 미드는 supercoiled, 그들은 선형화 (참조 그림 7는) 보다 더 빠르게 실행 하는 경향이. 둘째, 해야는 sgRNA에 대 한 두 개의 oligonucleotides을 단련 컷된 플라스 미드에 출혈. oligonucleotides CRISPR 플라스 미드 등뼈로 성공적으로 복제 된 경우 확인 하려면 식민지 PCR ( 그림 7b참조) 수행 됩니다. 긍정적인 복제품은 플라스 미드 추출 하 고 생어에 전송 하기 전에 접종 다음는 연속.
그림 7 : SgRNA 표현 CRISPR 플라스 미드의 클로닝. (한) 이미지 보여주는 소화 하 고 젤 전기 이동 법 후 소화 되지 않은 플라스 미드. 레인 1\u20123 BbsI에 의해 완전히 선형화 된 플라스 미드를 보여줍니다. 레인 4는 원래 소화 되지 않은 플라스 미드, supercoiled 이며 따라서 빨리는 agarose 젤에 마이그레이션합니다. (b) 대표 젤 식민지 PCR 제품의 이미지. 긍정적인 복제품 부정 하면서 녹색 틱 (oligonucleotides 있다 벡터 등뼈로 성공적으로 출혈 된 나타내는)에 의해 표시 된다 클론 붉은 십자가 의해 표시 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
구문 순서 확인 되었습니다, 일단 그들은 원하는 셀 라인 (HEK293T) 등으로 불리고 있습니다. CRISPR 플라스 미드는 종종 그로 인하여 성공적으로 불리고 셀을 선택할 수 있도록 선택 가능한 마커 (예를 들어, 한 mCherry 유전자), 수행. 형광 현미경 (참조 그림 8는) 플라스 미드의 성공적인 배달 시 쉽게 구상 될 수 있다. 셀은 24\u201272 주위 cytometry로 분류 되어 h 후 transfection. 게이트는 페 비 컨트롤 기반으로 설정 됩니다 ( 그림 8b참조). 정렬 된 세포의 일부는 복구 수 있도록 조직 문화 접시에 시드.
그림 8 : 인간의 세포에 CRISPR 시 약의 소개. HEK293T 세포의 현미경 이미지 (a) 대표는 성공적으로 mCherry 마커 베어링 CRISPR 플라스 미드와 페 ( 재료의 표참조). Transfection 효율 빨간색 형광 표시 셀의 비율에 의해 추정 될 수 있습니다. 10 배 확대, 눈금 막대 200 µ m. (b) 대표 FACS 플롯을 나타냅니다. Transfected 세포 (오른쪽 패널)는 페 비 제어 (왼쪽된 패널)에 대 한 문이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
정렬 된 세포를 복구 하는 동안 편집 효율 실험을 계속 해야 합니다 여부를 결정 하기 위해 평가 됩니다. 게놈 DNA (gDNA) 나머지 취소 도금된 셀에서 격리 됩니다. T7EI 분석 결과 agarose에 관찰 하는 밴드의 강도에서 계산 된 분열 효율성 확인 수행 됩니다 (참조 그림 9는) 젤. 또한, 경우 HDR 기반 실험 대상 장소에 제한 사이트를 통합 하도록 설계 되었습니다, RFLP 분석 결과 수행할 수 있습니다 해당 제한 효소 ( 그림 9b참조).
그림 9 : 게놈 편집의 범위 평가. (한) 대표 젤 이미지 T7E1 분석 결과의 결과 보여주는. 레인 1\u20128 다른 실험 샘플을 나타냅니다. 각 샘플에 대 한 상위 밴드 하단 두 밴드 분열 제품을 표시 하는 동안 포경된 DNA를 나타냅니다. NHEJ 효율성을 다양 한 샘플 중 관찰할 수 있습니다. PCR amplicons 비 transfected 세포에서의 소화 부정적인 제어로 사용 되 고에 의해 표시 되는 "-". (b) 대표 젤 이미지 RFLP 분석 결과의 결과 보여주는. 레인 1\u20126 다른 실험 샘플을 나타냅니다. 각 샘플에 대 한 상위 밴드 하단 두 밴드 제한 다이제스트 후 분열 제품을 표시 하는 동안 포경된 DNA를 나타냅니다. 샘플 중 HDR 효율성 변화를 관찰할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
편집 효율은 허용 하는 경우 (예를 들어, 적어도 5%는 T7EI 시험), 우리가 원하는 DNA 수정 작업을 수행 하는 개별 클론 식별을 진행. 복구에 남아 있다, 도금된 셀 개별 식민지 성장을 위해 띄엄띄엄 시드 있습니다. 그 후, 개별 식민지 포착 하 고 gDNA 이러한 개별 클론에서 분리 하기 전에 확장 됩니다. T7EI 분석 결과의 또 다른 라운드 대상 사이트에서 수정 된 dna 클론을 식별 하기 위해 수행 됩니다. TOPO 클로닝 및 생어 시퀀싱 다음 모든 대립 유전자의 정확한 순서를 결정 하기 위해 수행 됩니다. 이상적으로, 유전자 녹아웃에는 indels 해서는 안됩니다 (참조 그림 10는) frameshift 돌연변이 발생 하지 않는 3의 배수. 더 서쪽 오 점 없는 타겟된 단백질 존재 있도록 밖으로 실행 될 수 있다, 단백질 코딩 유전자 성공적으로 활성화 되었습니다를 확인 하기 위해 ( 그림 10b참조).
그림 10 : 유전자 녹아웃에 대 한 심사. (한) 대표 생어 시퀀싱 데이터입니다. 원래 수정 되지 않은 DNA 순서 (맨 윗줄) 시퀀싱 결과 받은 (아래쪽 행) 수정이 자리를 차지 하 고 있는지 여부를 확인 하 정렬 될 수 있습니다. 여기, 1 bp 삽입 및 7 bp 삭제 대상 사이트 (같이 맞춤 간격을 대표 하는 빨간 상자에 의해)에 있다. (b) 대표 서쪽 오 점 이미지. 여기, 여러 클론 (단일 셀에서 확장) GLUL 단백질의 유무에 대 한 상영 됩니다. 빨간색 화살표는 어디 GLUL 유전자는 성공적으로 넉 다운 된 클론을 나타냅니다. "WT" wildtype 셀, GLUL 표현 매우 의미 합니다. ACTB (β-말라) 역할을 로드 컨트롤 ( 테이블의 자료를 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
CRISPR-Cas 시스템 엔지니어 유전자 및 식물 및 동물의 transcriptomes 강력 하 고 혁신적인 기술입니다. 많은 세균성 종의 게놈 및 transcriptome 목적44엔지니어링에 대 한 적응 수 있습니다 CRISPR Cas 시스템을 포함 하도록 발견 되었습니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 endonuclease은 배포할 성공적으로 인간 세포21,22,,2324, 다른 박테리아에서 효소를 첫 번째 효소 종, 표 1에 표시 된을 포함 하 여 또한 인간의16,26,,2728엔지니어링 도구로 잘 작동 하도록 표시 되었습니다. 따라서, 연구자는 기술을 사용 하 여 예리한 확실 하지 않은 자주 그들의 일 및 최적의 결과 대 한 그들의 실험을 디자인 하는 방법에 대 한 선택 하는 시스템.
여기, 우리는 기술의 그들의 사용을 극대화에 CRISPR 사용자를 지원 하기 위해 추구 합니다. 모든 게놈을 기본 편집 실험은 선택 하 고 대상에 대 한 적절 한 sgRNA의 클로닝. 우리와 다른 사람에 의해 수행 작업 다른 CRISPR Cas 시스템은 다른 공백 길이 ( 표 1참조)에 최적의 활성 공개25. 또한, 연구원 대상 사이트의 지식에 기반으로 사용 하는 시스템을 선택 해야 합니다. 일반적으로 효소는 우리의 평가 연구에서 테스트, 중 SpCas9와 LbCas12a 아마도 더 개방적이 고 접근 chromatin 결과로 더 높게 표현 된 유전자에 특히 높은 절단 효율성을 전시. 따라서,이 두 효소 실험을 편집 하는 일상적인 게놈에 대 한 권장 합니다. 그러나, 우리는 모두 nucleases AsCas12a 보다 sgRNA 및 타겟된 DNA 간의 불일치에 대 한 더 높은 허용 오차를 전시 발견 했다. 따라서, 연구원은 여러 밀접 하 게 관련된 homologs 또는 게놈의 반복 영역 유전자를 대상으로, 대상 오프 효과 최소화 하기 위해 AsCas12a를 사용 하 여 것이 좋습니다. 또는, SaCas9 수 있습니다 또한 활용할 수 강력한 활동에 대 한 긴 공백 길이 필요로 함으로써 SpCas9와 LbCas12a 보다 높은 본질적인 특이성을 제공 하.
Genomic 소재 시의 정확한 편집 CRISPR 시 약 함께 복구 서식 파일의 도입을 필요 합니다. 서식 파일 셀 HDR 통로 통해 더블-좌초 휴식을 복구 하는 방법에 게 설명서 역할을 합니다. 서식 파일의 두 가지 일반적인 형태는 ssODN 하는 플라스 미드. 이 선 서식 파일의 디자인은 최적의 HDR 효율25,39,42,45,,4647에 대 한 중요 한 단계 이다. SsODNs, 순서는 ssODN의 파생 된 DNA 가닥은 중요 하다. AsCas12a와 LbCas12a SpCas9 대신 대상 가닥 시퀀스의 ssODNs에 대 한 선호를 전시 하는 동안 비 대상 가닥 시퀀스의 ssODNs에 대 한 선호를 전시. 또한, HDR 효율성 잠재적으로 향상 시킬 수 있습니다 비대칭 기증자를 활용 하 여 더. 그러나, 연구원이는 상 동 팔이 확장된 ( 그림 2참조)의 주의 해야 합니다. 잘못 된 팔의 길이 늘리는 대신 HDR 효율 저하 종료 됩니다. 플라스 미드 기증자에 대 한 서식 파일은 제한 다이제스트 셀 변환 전에 오는지 자주. 또한, "더블 컷" 플라스 미드 기증자 스페이서-PAM 시퀀스 왼쪽 및 오른쪽 상 동 팔 전후 각각 배치는 어디 표시 되었습니다 추가 공백-PAM 없이 플라스 미드 기증자 보다 높은 HDR 효율 시퀀스 를 42.
또는 복구 템플릿 없이 필요한 CRISPR 시 약의 준비, 외 수정된 셀 라인 (예를 들어, 포함 된 특정 유전자 녹아웃)의 생성은 세포 변환, 단일 셀 확장, 및 개별 클론의 심사 또한 포함 한다. 프로토콜은 실험을 편집 하는 완전 한 게놈을 수행 하는 사용자가 모든 다운스트림 단계를 설명 합니다. 일부 내용은 셀 라인 전용 있습니다. 예를 들어 일부 셀 라인 transfect, 동안 다른 사람 다른 변환 메서드를 nucleofection, electroporation 등 광범위 한 최적화를 요구할 수 있습니다 쉽게 있을 수 있습니다. 중요 한 것은, 우리의 경험에서 중요 한 단계는 프로토콜에 복제 하는 단일 셀입니다. 그들이 잘, 단일 셀으로 아마도 성장 인자 분 비의 부족 때문에 시드는 때 특정 세포 유형 증식 하지 않을 수 있습니다. 예를 들어 인간 배아 줄기 세포와 많은 환자에서 파생 된 1 차 셀 라인 일반적으로 성장 고립 된 단일 세포로 매우 저조한. 따라서, 변환, 후 좋습니다 셀을 띄엄띄엄 도금 고 다음 접시에 개별 식민지 cytometry 96 잘 접시의 다른 우물으로 단일 셀을 정렬 하는데 사용 하 여. 또한 천연된 세포의 복구를 향상 시키기 위해 세포 배양의 바위 억제제48, 등을 프로 생존 요소를 추가할 필요가 있을 수 있습니다. 또한, 단일 세포 복제의 과정에서 두 개의 별도 셀에 서로 거의 아주 성장 하 고 병합, 하나의 식민지만의 거짓 모양을 주는 결국 경우 있을 수 있습니다. 이러한 상황에서 도입, 게놈 변이 결정의 단계 하나 될 수 3 개 이상의 뚜렷한 대립 유전자를 식별. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 띄엄띄엄이 세포를 다시 도금 고 다음 추가 개별 식민지 여 개별 클론을 복구할 수 있습니다.
끝으로, CRISPR-Cas 기술 생물 의학 및 바이오 연구를 혁명 이다. 그러나, 그것은 현재 유전자 치료를 포함 한 일부 응용 프로그램에 그것의 대폭적인 채용을 저해 (예: 제한 된 대상 범위와 큰 단백질 크기) 여러 한계에서 겪고 있다. 그럼에도 불구 하 고, 시간으로 진행 되는 동안, 더 많은 자연스럽 게 발생 하는 Ca 효소 미생물 종의 넓은 범위에서 발견 되 고 이러한 새로운 효소의 일부 기존 nucleases에 유리한 속성을가지고 있습니다. 상세한 학문 다음 게놈 및 transcriptome 엔지니어링 툴으로 배포 하는 경우 이러한 소설 CRISPR Cas 시스템의 설계 매개 변수를 제대로 이해 하기 위해 수행 해야 합니다. 따라서, 우리의 프로토콜 현재 게놈 편집 노력에 대 한 좋은 참고 자료로 제공, 그것은 등장으로 새로운 시스템에 대 한 최신 정보를 지속적으로 업데이트 해야 합니다.
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Disclosures
저자 경쟁 없는 금융 관심.
Acknowledgments
M.H.T.는 과학 기술 및 연구의 공동 위원회 사무실 그랜트 (1431AFG103)에 대 한 기관에 의해 지원 됩니다, 국가 의료 연구 위원회 (OFIRG/0017/2016) 부여, 국립 연구 재단 보조금 (NRF2013-THE001-046, NRF2013-THE001-093)는 교육부의 교육 1 단계 그랜트 (RG50/17 (S)), 난 양 기술 대학교, 난 양 기술 대학교에서 국제 유전자 공학 기계 (iGEM) 경쟁에 대 한 자금에서 시작 권한을 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | NEB | M0371 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X | 1st Base | BUF-3000-50X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA. |
| Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X | 1st Base | BUF-3020-10X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. |
| BbsI | NEB | R0539 | |
| BsmBI | NEB | R0580 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | 400,000 units/ml |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
| Rapid DNA Ligation Kit | Thermo Scientific | K1423 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit | Thermo Scientific | 451245 | The salt solution comes with the TOPO vector in the kit. |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Kit for Gibson assembly. |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
| LB Broth (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L3022 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
| LB Broth with Agar (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L2897 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
| SOC media | - | - | 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Biotechnology | A-301 | |
| REDiant 2X PCR Mastermix | 1st Base | BIO-5185 | |
| Agarose | 1st Base | BIO-1000 | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | |
| Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate |
| L-Glutamine, 200mM | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160 | FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min |
| Phosphate Buffered Saline, 1X | Gibco | 20012 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus Transfection | 114-75 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 | Epicentre | LUCG-QE09050 | |
| ISOLATE II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52067 | An alternative to QuickExtract |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | NEB | N0447 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA |
| Protease Inhibitor Cocktail, Set3 | Merck | 539134 | |
| Nitrocellulose membrane, 0.2µm | Bio-Rad | 1620112 | |
| Tris-glycine-SDS buffer, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS. |
| Tris-glycine buffer, 10X | 1st base | BUF-2020 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine. |
| Ponceau S solution | Sigma Aldrich | P7170 | |
| TBS, 20X | 1st base | BUF-3030 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl. |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Skim Milk for immunoassay | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
| WesternBright Sirius-femtogram HRP | Advansta | K12043 | |
| Antibody for β-actin (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Lot number: C0916 |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Qubit fluorometer | Thermo Scientific | Q33226 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Scientific | AMF4300 | |
| CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
| CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: hCas9 | Addgene | 41815 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
| CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
| CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
References
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