Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59086
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas er en kraftig teknologi til ingeniør komplekse genomer av planter og dyr. Her, detalj vi en protokoll effektivt redigere det menneskelige genomet bruker forskjellige Cas-endonucleases. Vi markere viktige hensyn og design parametere for å optimalisere redigering effektivitet.

Abstract

Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) systemet fungerer naturlig bakteriell adaptiv immunitet, men har blitt vellykket repurposed genomet Engineering i mange forskjellige levende organismer. Oftest wildtype CRISPR tilknyttet 9 (Cas9) eller Cas12a endonuclease brukes til å holde seg bestemte nettsteder i genomet, hvoretter DNA double-strandet pause repareres via ikke-homologe slutten å bli (NHEJ) veien eller homologi-rettet reparasjon ( HDR) sti avhengig av om en giver mal er fraværende eller presentere henholdsvis. Hittil har CRISPR systemer fra ulike bakterie-art vist å kunne utføre genomet redigering i pattedyrceller. Men til tross for den tilsynelatende enkelheten av teknologi må flere design parametere vurderes, som ofte lar brukerne rådvill om hvordan best for å utføre sine genom redigering eksperimenter. Her beskriver vi en komplett arbeidsflyt fra experimental design til identifikasjon av cellen kloner som bærer DNA endringer, med mål om å tilrettelegge vellykket gjennomføring av genomet redigering eksperimenter i pattedyr linjer. Vi markere nøkkelfaktorer for brukere å merke, inkludert valg av CRISPR system, hvor mellomrom og utformingen av en enkelt-strandet oligodeoxynucleotide (ssODN) giver mal. Vi forventer at denne arbeidsflyten vil være nyttig for genet knockout studier, sykdom modellering innsats, eller generering av reporteren cellelinjer.

Introduction

Muligheten til å ingeniør genomet av enhver levende organisme har mange biomedisinsk og bioteknologisk programmer, for eksempel korrigering av sykdomsfremkallende mutasjoner, bygging av nøyaktige mobilnettet modeller for sykdom studier eller generering av landbruket vekster med ønskelig egenskaper. Siden begynnelsen av århundret, ulike teknologier er utviklet for genomet engineering i pattedyrceller, inkludert meganucleases1,2,3, sink finger nucleases4,5, eller transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs)6,7,8,9. Men er disse tidligere teknologiene vanskelig å programmet eller kjedelig å montere, og dermed hindrer deres utbredt adopsjon i forskning og industri.

De siste årene, de klynget interspaced regelmessig kort palindromic gjentar (CRISPR) - CRISPR-assosiert (Cas) systemet har dukket opp som en kraftig ny genomet engineering teknologi10,11. Opprinnelig en adaptive immunsystemet i bakterier, det har blitt deployert for genomet endring i planter og dyr, inkludert mennesker. Hovedårsak hvorfor CRISPR-Cas har fått så mye popularitet i så kort tid er at elementet som bringer den viktigste Cas-endonuclease, som Cas9 eller Cas12a (også kjent som Cpf1), til riktig sted i genomet er bare et kort stykke chimeric enkelt støttelinje RN En (sgRNA), som er enkelt å utforme og billig å syntetisere. Etter blir rekruttert til målområdet, Cas enzymet fungerer som et par molekylær saks og innstiftet bundet DNA med sin RuvC, HNH eller Nuc domener12,13,14. Resulterende dobbel strandet pause (DSB) repareres senere av cellene via enten ikke-homologe slutten med (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR) veien. I fravær av en reparasjon mal repareres DSB av feilutsatte NHEJ veien, som kan gi opphav til pseudo-tilfeldige innsetting eller sletting av nukleotider (indeler) på webområdet kutt, potensielt forårsake frameshift mutasjoner i protein-koding gener. Men i nærvær av en donor mal som inneholder endringene i DNA, er DSB reparert av Hi-Fi HDR veien. Vanlige typer donor maler inkluderer enkelt-strandet oligonucleotides (ssODNs) og plasmider. Tidligere brukes vanligvis hvis tiltenkte DNA endringene er små (for eksempel endring av en enkelt base-par), mens sistnevnte brukes vanligvis hvis man ønsker å sette inn en relativt lang sekvens (for eksempel koding sekvensen av en grønn fluorescerende protein eller GFP) i målet locus.

Endonuclease aktiviteten til Cas protein krever tilstedeværelse av en protospacer tilstøtende motiv (PAM) mål område15. PAM Cas9 er på 3 slutten av protospacer, PAM Cas12a (også kalt Cpf1) er på 5' slutten i stedet16. Cas-guiden RNA komplekse er ikke innføre en DSB hvis PAM er fraværende17. Derfor plasserer PAM en begrensning på genomisk stedene der en bestemt Cas-nuclease er i stand til å holde seg. Heldigvis viser Cas nucleases fra ulike bakterie-art vanligvis ulike PAM krav. Ved å integrere ulike CRISPR-Cas systemer i våre tekniske verktøykassen, kan vi derfor utvide omfanget av nettsteder som kan målrettes i et genom. Videre kan et naturlig Cas enzym være konstruert eller utviklet for å gjenkjenne alternativ PAM sekvenser, ytterligere utvide omfanget av genomisk mål tilgjengelig for manipulasjon18,19,20.

Selv om flere CRISPR-Cas-systemer finnes genomet engineering formål, har de fleste brukere av teknologi stolt på Cas9 nuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) av flere grunner. Først krever det en relativt enkelt NGG PAM, i motsetning til mange andre sertifiseringsinstanser proteiner som kan bare holde seg i nærvær av mer komplekse PAMs. Det andre er den første Cas endonuclease å bli distribuert i menneskeceller21,22,23,24. Tredje er SpCas9 langt den beste preget enzymet hittil. Hvis en forsker ønsker å bruke en annen Cas nuclease, vil han eller hun ofte være uklart om hvordan best å utforme eksperimentet og hvor godt andre enzymer vil opptre i ulike biologiske sammenhenger i forhold til SpCas9.

For å utdype den relative ytelsen til forskjellige CRISPR-Cas-systemer, har vi nylig utførte en systematisk Sammenlikning av fem Cas endonucleases-SpCas9, Cas9 enzymet fra Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzymet fra Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzymet fra Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) og Cas12a enzymet fra Lachnospiraceae bakterie ND2006 (LbCas12a)25. For en rettferdig sammenligning vurdert vi de ulike Cas nucleases bruker samme sett med målområder og andre eksperimentelle forhold. Studien også avgrenset design parameterne for hver CRISPR-Cas-system, som ville tjene som en nyttig referanse for brukere av teknologi. Her, bedre aktiverer forskere å bruke CRISPR-Cas system, gir vi en trinnvis protokoll for optimal genomet engineering med forskjellige Cas9 og Cas12a enzymer (se figur 1). Protokollen inkluderer ikke bare eksperimentelle detaljer men også viktige Utformingshensyn å maksimere sannsynligheten for et vellykket genomet engineering resultat i pattedyrceller.

Figure 1
Figur 1 : En oversikt over arbeidsflyten skal generere genomet endret humane cellelinjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design av sgRNAs

  1. Velg en passende CRISPR-Cas-system.
    1. Først inspisere målregion for PAM sekvensene av alle Cas9 og Cas12a nucleases som har vist seg å fungere i pattedyrceller16,21-32. Fem brukte enzymer er gitt i tabell 1 sammen med deres respektive PAMs.
      Merk: i tillegg til endonucleases oppført i tabell 1, det finnes andre mindre brukte Cas enzymer som har blitt distribuert i pattedyrceller også, som en Cas9 nuclease fra Streptococcus thermophilus (St1Cas9) som gjenkjenner PAM NNAGAAW. Hvis ønsket målområdet ikke inneholder en kjent PAM, ville en ikke lenger kunne bruke CRISPR-Cas systemet genomet engineering.
    2. Andre vurdere noen kjente egenskaper av målet genomisk locus eller genet. Noen egenskaper ta hensyn inkluderer gene expression nivåer eller chromatin tilgjengelighet og om det er andre tett knyttet sekvenser også.
      Merk: Visse enzymer er bedre egnet for bestemte biologiske sammenhenger. For eksempel for å redigere et repeterende genomisk locus eller et gen med flere andre nær paralogs, er det anbefalt å bruke enten AsCas12a (på grunn av sin lavere toleranse for uoverensstemmelser mellom sgRNA og målet DNA enn SpCas9 og LbCas12a) eller SaCas9 (grunn sin krav for lengre avstandsstykker, som gir høyere målretting spesifisitet)25.
CAS Endonuclease PAM Optimal spacer lengde
SpCas9 NGG 17-22 nt inkluderende
SaCas9 NNGRRT ≥ 21 nt
NmCas9 NNNNGATT ≥ 19 nt
AsCas12a og LbCas12a TTTV ≥ 19 nt

Tabell 1: noen brukte Cas enzymer med beslektet PAMs og optimal sgRNA lengder. N = alle nukleotid (A, T, G eller C); R = A eller G; V = A, C og G.

  1. Velg en passende avstand sekvens. Identifisere like unik en sekvens som mulig for å minimere risikoen for off-målet cleavage hendelser, enten ved å undersøke målet genomet med BLAST33 eller flere fritt tilgjengelig online verktøy, som: (a) programmet fra Feng Zhang laboratory34 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (c) E-skarp36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas-OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
    Merk: Optimale lengden på avstandsstykket kan variere fra 17 til 25 nukleotider (nt) inkluderende, avhengig av hvilken Cas enzym brukes (se tabell 1). For Cas9, avstandsstykket er over PAM, mens for Cas12a, avstandsstykket er downstream for PAM. i tillegg, HDR effektivitet faller raskt med økende avstand fra webområdet kutt. Derfor for presis DNA redigering, plasser sgRNA så nær som mulig til beregnet endre området.
  2. Syntetisere DNA oligonucleotides med riktige overheng for CRISPR plasmider som brukes.
    1. Legge til en G nukleotid foran avstandsstykket hvis første posisjon av guiden ikke er en G. fastslå omvendt komplementære rekkefølgen for mellomlegget. Legge i nødvendig overheng for kloning formål.
      Merk: Form av illustrasjon, for plasmider brukes i våre evalueringen studien25, oligonucleotides til syntetiseres er vist i tabell 2. Bruk eksempelet i figur 2 som en guide, om nødvendig. Mange CRISPR plasmider er tilgjengelig fra kommersielle kilder (f.eks Addgene). Noen av de mer populære plasmider er gitt i Tabellen for materiale.
CRISPR plasmider Sekvens
pSpCas9 og pSaCas9 Mening: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3
Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'
pNmCas9 Mening: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3
Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5'
pAsCas12a og pLbCas12a Mening: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3
Antisense: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5'

Tabell 2: Oligonucleotides kreves for kloning sgRNA sekvenser i CRISPR plasmider brukes i en fersk evaluering studere25. Overheng er kursiv.

Figure 2
Figur 2 : Et eksempel illustrerer hvordan du velger målområder og utforme oligonucleotides for kloning i CRISPR plasmider. Målet genomisk locus her er ekson 45 av menneskelig CACNA1D genet. PAMs for SpCas9 og SaCas9 er NGG og NNGRRT henholdsvis og utheves med rødt, mens PAM for AsCas12a og LbCas12a er TTTN og er uthevet i grønt. Den røde vannrette linjen indikerer protospacer for SpCas9 og SaCas9, mens den grønne vannrette linjen angir protospacer for to Cas12a enzymer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. kloning av oligonucleotides i en ryggrad vektor

  1. Phosphorylate og anneal følelse og antisense oligonucleotides.
    1. Hvis oligonucleotides er lyofiliserte, resuspend dem til en 100 µM konsentrasjon i tris-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (TE buffer, se Tabellen for materiale) eller ddH2O.
    2. Forberede en 10 µL reaksjonen blanding som inneholder 1 µL av fornuftig oligonucleotide, 1 µL av antisense oligonucleotide, 1 µL av T4 DNA ligase buffer (10 x), 1 µL av T4 polynucleotide kinase (PNK) og 6 µL ddH2O. Mix godt av pipettering og plassere reaksjonen blanding i en termisk cy Cler med følgende parametere: 37 ° C i 30 min, 95 ° C i 5 min og rampe ned 25 ° C på 6 ° C/min.
    3. Fortynne den reaksjonen blanding 1: 100 i ddH2O (f.eks 2 µL reaksjonen blanding + 198 µL ddH2O).

Figure 3
Figur 3 : Et eksempel på en CRISPR plasmider. (en) A kart som viser forskjellige viktige funksjoner av plasmider. Her, driver EF-1a selskapet uttrykk for Cas9, mens U6 Selskapet driver uttrykk for sgRNA. Amp(R) angir en ampicillin-motstand genet i plasmider. (b) en rekke "BbsI-BplI kloning området" i plasmider. Anerkjennelse sekvensen av BbsI er GAAGAC og er merket med rødt, mens anerkjennelse sekvensen av BplI er GAG-N5- CTC og vises i grønt. (c) primer som kan brukes til koloni PCR for å sjekke om den sgRNA sekvensen har vært er fullført i plasmider. HU6_forward primer angis av en lilla pil på plasmider kartet, mens den universelle M13R(-20) primeren angis med en rosa pilen på plasmider kartet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Fordøye det CRISPR plasmider med et passende begrensning enzym.
    Merk: Kloning av sgRNAs vanligvis stole på Golden Gate montering med type IIs begrensning enzymer. Forskjellige enzymer kan brukes til forskjellige CRISPR plasmider. PSpCas9, bruke BbsI eller BplI (se fig. 3). For pSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a og pLbCas12a, bruker du BsmBI.
    1. Forberede en 20 µL reaksjonen blanding som inneholder 1 µg av sirkulære plasmider vektor, 2 µL bufferen (10 x), 1 µL begrensning enzym (f.eks BbsI, BplI eller BsmBI) og ddH2O til en endelig mengde 20 µL. ruge reaksjonen på 37 ° C for 2,5 t.
    2. Legger 1 µL av reker alkalisk fosfatase (SAP) reaksjon og ruge på 37 ° C for en annen 30 min.
    3. Slukke reaksjonen ved å legge til 5 µL av 6 x DNA laste fargestoff (se Tabell for materiale), bland godt og løse reaksjonen på en 0,8% agarose gel med 1 x tris-acetate-EDTA (TAE) buffer. Deretter avgiftsdirektoratet riktig bandet og fortsette å gel rense linearisert vektoren.
  2. Ligate de glødet oligonucleotides i fordøyd CRISPR plasmider.
    1. Forberede en 10 µL reaksjonen blanding: 50 ng linearisert vektor, 1 µL av utvannet glødet oligonucleotides, 1 µL av T4 DNA ligase buffer (10 x), 1 µL av T4 DNA ligase og ddH2O til en endelig mengde 10 µL (se Tabell for materiale). Inkuber reaksjonen på 16 ° C over natten eller ved romtemperatur for 2T.
      Merk: for å fremskynde ligation prosessen, bruke konsentrert T4 DNA ligase og Inkuber reaksjonen blanding i romtemperatur i 15 min (se Tabell for materiale).
  3. Forvandle samskrevet produkter til kjemisk kompetent E. coli celler (se utfyllende fil 1). Spre transformert bakterieceller på en LB agar plate med 100 µg/mL ampicillin.
  4. Utføre koloni polymerasekjedereaksjons (PCR) å identifisere bakterier med inn.
    1. Forberede to sett av sterile PCR stripe rør. I sett 1, Legg 4.7 µL av ddH2O, mens i 2, legge til 50 µL av LB buljong med aktuelle antibiotika (f.eks, 100 µg/mL ampicillin).
    2. Med et sterilt pipette tips, plukke en koloni av platen, dra den kort i et sett 1 rør og forlater tips i et sett 2 rør. Gjenta for noen kolonier, slik at du bruker forskjellige PCR rør hver gang.
      Merk: Vanligvis screening fire koloniene er tilstrekkelig. Dette kan imidlertid variere avhengig av kloning effektiviteten.
    3. Legg til følgende reagenser til hvert sett 1 tube (for en 10 µL PCR): 5 µL av 2 x PCR master mix (med lasting fargestoff, se Tabellen for materiale), 0,15 µL av følelse eller antisense oligonucleotide (100 µM), 0,15 µL av primer (100 µM) målretting CRISPR plasmider nedstrøms eller opp strøm av sgRNA kassetten henholdsvis (se fig. 3).
      Merk: PCR produktet bør ideelt gi et produkt størrelsen på ca 150 bp eller større, så at noen positive band er ikke feilaktig som primer dimers.
    4. Kjøre PCRene i en termisk cycler bruker følgende parametere: 95 ° C i 3 minutter, 95 ° C for 30 s (trinn 2), 60 ° C for 30 s (trinn 3), 72 ° C for 30 s (trinn 4), Gjenta trinn 2\u20124 for en annen 34 sykluser, 72 ° C i 5 min , og hold på 4 ° C.
      Merk: Annealing temperaturen på 60 ° C må være optimalisert for primerne designet. Forlengelse tiden 30 s kan også variere avhengig av den forventede PCR amplicon størrelsen og DNA polymerase brukes.
    5. Løse reaksjonene på en 1% agarose gel med 1 x TAE buffer.
    6. Vaksinere en koloni som gir et positivt band i PCR ved å overføre 50 µL av sin kultur fra tilsvarende sett 2 røret til en større konisk rør som inneholder 5 mL LB med en passende antibiotikumet. La kulturen vokse over natten i en 37 ° C inkubator-shaker.
    7. Isolere plasmider fra den natten kultur bruker en miniprep kit (se Tabell for materiale) og sekvens prøven ved hjelp av kolonien PCR primer som ikke er fornuftig eller antisense oligonucleotide (hU6_forward eller M13R(-20) i Figur 3).
      Merk: Eventuelt utføre en maxiprep av sekvens-verifiserte CRISPR plasmider å få et større beløp for nedstrøms eksperimenter.

3. design og syntese av reparasjon maler

Merk: For genomet ingeniørkunst, mal angir DNA endringene må angis sammen med CRISPR reagenser. For små DNA endringer som endring av en single nukleotid er ssODN donor maler mest passende (se avsnitt 3.1). For større DNA redigering for eksempel innsetting av en GFP kode 5' eller 3' med et bestemt protein-koding, plasmider donor maler egnede (se kapittel 3.2).

  1. Design og syntetisere ssODN donor mal (se Figur 4).
    1. Bestemme riktig tråd som sekvens malen skal følge.
      Merk: Cas12a viser en preferanse for ssODNs av ikke-mål strand sekvensen, mens Cas9 en preferanse for ssODNs målet strand sekvens i stedet25 (se Figur 4en).
    2. Kontroller at reparerte sekvensen ikke er targetable av den valgte Cas nuclease igjen. For eksempel mutere PAM slik at det er ingen aminosyre endring eller eliminere PAM fra malen giver hvis det er ingen funksjonell konsekvens. Bruk eksempelet i Figur 4b som en guide, om nødvendig.
    3. Avgjøre hvis en symmetrisk eller asymmetrisk donor mal er ønskelig. For symmetrisk givere, sørge for at hver homologi arm flankert DNA endring området er minst 17 nt lang25. Asymmetrisk donor maler, bruke lengre armer 5 ' ønsket DNA endringene (se Figur 4en). Viktigere, sikre at kortere armen er rundt 37 nt i lengde, mens andre homologi armen rundt 77 nt i lengde25,39.
    4. Syntetisere malen utformet som en del av enkelt-strandet DNA.
      Merk: Asymmetrisk ssODNs kan, men ikke alltid, viser høyere HDR effektivitet enn symmetrisk ssODNs. Generelt, utfører en asymmetrisk giver vanligvis minst samt en symmetrisk donor, når utformet på riktig måte. Malen asymmetrisk koster imidlertid mye mer fordi det er lengre og dermed krever polyakrylamid gel geleelektroforese (side) rensing eller en spesiell syntese prosedyre. Rutinemessig genet fortrenging vanligvis avhengige NHEJ reparasjon veien og krever ikke en reparasjon mal. Men hvis knockout effektivitet er lav, design ssODN donor mal som inneholder en frameshift mutasjon og er minst 120 nt i lengde25,40.

Figure 4
Figur 4 : Design ssODN donor maler. (en) skjematisk illustrerer ulike mulige design. De røde vannrette rektanglene indikerer ikke mål (NT) Peasmarsh, mens blå rektanglene angi målet (T)-strand. I tillegg angi til små grønne rektangler endringene DNA (som single nukleotid endringer). Når en symmetrisk ssODN, Minimumslengden på hver homologi arm bør være minst 17 nt (men kan være lengre). For asymmetrisk ssODNs synes 37/77 T ssODN å være optimal for SpCas9-indusert HDR, mens 77/37 NT ssODN synes å være optimal for Cas12a-indusert HDR. L = venstre homologi arm. R = høyre homologi arm. (b) et konkret eksempel å utforme ssODN maler. Her er målet genomisk locus ekson 45 av menneskelig CACNA1D genet. PAM for Cas9 er rosa og understreket, mens PAM for Cas12a er brun og understreket. Målet er å skape en eks. missense mutasjon (fremhevet inne grønn) ved å konvertere AGU (koding serine) til AGG (koding arginine). For å hindre ny målretting av Cas12a, er TTTC PAM mutert til CTTC. Merk at det er ingen endring i aminosyre (Hvis du UAU- og UAC-både koden for tyrosin). For å forhindre ny målretting av Cas9, en AGU codon er erstattet med en UCC codon (fet skrift), begge som kode for serine. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Design og klone en passende plasmider donor mal. Det kan for eksempel inneholde en GFP sekvens flankert av lange armer som er homologe til målet genomisk locus (se figur 5).
    1. Kontroller at endret rekkefølgen ikke er targetable av den valgte Cas nuclease igjen. Protospacer kan for eksempel deles av innsatte (GFP) koden. PAM kan eventuelt mutert eller fjernet fra donor malen på en slik måte som ikke påvirker gen funksjon.
    2. Forsterke homologi armene fra genomisk DNA bruker PCR. Lengden på hver homologi arm er vanligvis 1000 til 1500 bp.
      Merk: For å lette kloning, kontroller at frem primer for venstre homologi armen og omvendt primer for den høyre homologi arm hver har minst 20 nt overlappende sekvens med en valgte vektor ryggrad. I tillegg sikre at omvendt primer for venstre homologi armen og videresende primer for høyre homologi armen har noen overlappende sekvenser med epitope koden også.
    3. Klone to homologi armene og (GFP)-koden i vektor ryggraden med Gibson montering41 (se Tabell for materiale). Kontroller plasmider av Sanger sekvensering bruker frem og reversere primer som er oppstrøms og nedstrøms malen donor henholdsvis.
      Merk: Sanger sekvensering er vidt og billig tilgjengelig som et trykkeri. Sende en aliquot av plasmider sammen med sekvensering primerne til en leverandør.
    4. Linearize giver malen med en begrensning enzym som kutter plasmider bare en gang over venstre homologi armen eller nedstrøms høyre homologi armen.
      Merk: Nylig, en doble kutt donor, som er flankert av sgRNA-PAM sekvenser og frigis fra plasmider etter spalting av den tilsvarende Cas-nuclease, har vist seg å øke HDR effektivitet42. Når sgRNA-PAM sekvensene settes oppstrøms og nedstrøms til venstre og høyre homologi armer henholdsvis (for eksempel ved Gibson forsamlingen), homologi arm lengde kan reduseres til 300 bp og det er ikke nødvendig å linearize plasmider.

Figure 5
Figur 5 : Design og kloning av plasmider donor mal. (en) målet i dette bestemte eksempel er å fusjonere P2A-GFP til C-terminus av CLTA protein. Det blå vannrett rektanglet angir venstre homologi armen, mens det røde vannrett rektangelet angir riktig homologi armen. Store bokstaver angir protein-koding sekvenser, mens små bokstaver angi ikke-koding sekvenser. PAMs for SpCas9 og Cas12a er i kursiv og understreket. (b) en plasmider donor mal som kan brukes til å kode endogenously P2A-GFP på C-terminus av CLTA. Den angitte primer sekvenser kan brukes å klone av plasmider av Gibson montering. PCR forholdene er som følger: 98 ° C i 3 minutter, 98 ° C for 30 s (trinn 2), 63 ° C for 30 s (trinn 3), 72 ° C i 1 min (trinn 4), Gjenta trinn 2\u20124 for en annen 34 sykluser, 72 ° C i 3 minutter, og hold på 4 ° C. Svarte bokstaver tilsvarer vektor sekvenser, blå bokstaver tilsvarer venstre homologi armen, grønne bokstaver tilsvarer P2A-GFP og røde bokstaver tilsvarer høyre homologi armen. Merk at når sekvensen koding P2A-GFP er vellykket integrert i målet locus, ny målretting av SpCas9 ikke vil være mulig, siden bare 9 nt av sin protospacer (GTGCACCAG) vil være intakt. Videre, for å hindre ny målretting av Cas12a, tre basepairs umiddelbart nedstrøms stopp codon (i fet skrift) slettes fra plasmider sekvensen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. celle transfection

Merk: De gjenværende delene av protokollen er skrevet med HEK293T celler i tankene. Kultur medium brukes består av Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) med 4,5 finans glukose, 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 0,1% penicillin/streptomycin. Forskjellige trinnene av protokollen må endres i henhold til selve cellen linjen brukes. Alle celle kultur arbeid er gjort i en klasse II Biosafety regjering å sikre et sterilt arbeidsmiljø.

  1. Frø 1.8 x 105 celler i en 24-og vev kultur plate én dag før transfection.
    1. Distansere cellene av aspirating media og deretter legge til 150 µL 0,25% Trypsin-EDTA per brønn. Inkuber cellene på 37 ° C i 2 minutter.
    2. Nøytralisere trypsin ved å legge 150 µL eller 1 x volum celle kultur medier. Overføre celle suspensjon slik konisk. Nedspinning cellene i en benk toppen centrifuge 1000 x g for 5 min.
    3. Sug opp nedbryting, og resuspend med 5 mL celle kultur medier. I en separat sentrifuge tube, aliquot 10 µL 0,4% trypan blå løsning. Deretter legge i 10 µL resuspended celler fra trinn 4.1.2 og bland godt.
    4. Pipetter 10 µL av blandingen (celler + trypan blå) i en hemocytometer. Fortsette å telle celler manuelt eller ved å bruke en automatisert celle teller.
    5. Frø 1.8 x 105 celler i en brønn av en 24-og vev kultur plate.
  2. Forberede en transfection blanding som inneholder enten 500 ng CRISPR plasmider (for NHEJ-mediert redigering) eller 300 ng CRISPR plasmider og 300 ng donor mal (for HDR-mediert redigering), i henhold til instruksjonene med transfection reagensen (se Tabell over materialer). Inkuber ved romtemperatur for den anbefalte tid varigheten (vanligvis rundt 10\u201220 min).
  3. Legg transfection blandingen til cellene i en dropwise måte, og forsiktig snurr den etter.
  4. Ruge på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 air inkubator for 24 h (for NHEJ-basert eksperimenter) eller 72 h (for HDR-baserte eksperimenter).

5. fluorescens aktivert celle sortering (FACS) av transfekterte celler

  1. Distansere cellene av aspirating media og deretter legge til 150 µL av 0,25% trypsin-EDTA per brønn. Inkuber cellene på 37 ° C i 2 minutter.
  2. Nøytralisere trypsin ved å legge 150 µL eller 1 x volum celle kultur medier. Overføre celle suspensjon slik sentrifuge. Nedspinning cellene i en microcentrifuge på 235 x g i 5 min.
  3. Sug opp nedbryting og resuspend cellene med 2% fosterets bovin serum (FBS) i fosfat-bufret saltvann (PBS). Filtrere cellene til en 30 µm maske eller celle sil i et 5 mL FACS rør.
  4. Forberede en sentrifuge rør med ca 100 µL kultur medier eller 2% FBS i PBS for samling av celler.
  5. På flyt-cytometer gate cellene med ikke-transfekterte celler som en negativ kontroll. Sortere og samle de transfekterte cellene, ifølge som fluorescens markør finnes på CRISPR plasmider brukes. For eksempel hvis plasmider bærer en mCherry genet, sortere for RFP-positive celler.
    Merk: Ulike CRISPR plasmider vil ha forskjellige valgbar markører. Settet med plasmider (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1 og pLbCpf1) brukes i denne evalueringen studien bærer oransje fluorescerende protein (OFP) eller mCherry genet.

6. utvidelse av personlige kloner

  1. Sentrifuge sorterte cellene i en benk toppen sentrifuge med maksimal hastighet (18 000 x g) for 5 min. leveringstanken nedbryting og resuspend pellets med 300 µL kultur medier. Frø 200 µL celler i en 24-og vev kultur plate og la dem for et par dager i en 37 ° C inkubator. Holde resterende 100 µL celler for del 7.
  2. Når cellene begynner å bli confluent, passasje dem ifølge trinn 4.1.1\u20124.1.3. Ætt cellene tynt i en 100 mm vev kultur rett å tilstrekkelig rom for individuelle kolonier å vokse. Ruge på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 air inkubator.
    Merk: Prøve ulike fortynninger. Enkeltceller må nok plass til å vokse som individuelle kolonier. Men kan ikke de også være altfor sparsom, som noen linjer ikke vokser bra når antall celler ikke er nok.
  3. Når koloniene begynner å danne, plukke dem under mikroskopet (med en 4 x forstørrelse) og plassere hver klone i en enkelt brønn av en 24-vel-plate som inneholder celle kultur medier. Ruge på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 air inkubator til cellene blir confluent.
    Merk: Et alternativ til seriell fortynninger og kolonien plukking er å bruke flowcytometri til å sortere for enkeltceller i en 96-brønns plate. Men kanskje dette ikke fungerer for noen linjer som ikke vokser godt når bare én celle finnes.

7. evaluering av effektiviteten

  1. Ekstra genomisk DNA av sentrifugering resterende 100 µL sortert cellene (fra trinn 6.1) i en benk toppen sentrifuge med maksimal hastighet (18 000 x g) for 5 min. leveringstanken nedbryting og fortsetter å isolere genomisk DNA ved å bruke en utvinning kit (se tabell av Materialer).
  2. Utføre T7 endonuclease jeg (T7EI) cleavage analysen (se figur 6).
    1. Sette opp en 50 µL PCR som inneholder 10 µL PCR reaksjon bufferen (5 x), 1 µL dNTP mix (10 mM), 2,5 µL av brukerdefinerte frem primer (10 µM), 2,5 µL av brukerdefinerte omvendt primer (10 µM), 0,5 µL av DNA polymerase, 2\u20125 µL av genomisk DNA (avhengig av hvor mange celler har blitt sortert), deretter topp opp til 50 µL med ddH2O (se Tabell for materiale).
      Merk: Primerne er utformet til å flanke målet genomisk locus og gir et PCR produkt av rundt 400\u2012700 bp. vanligvis en primer er plassert nærmere til kutt området av Cas enzym enn andre primer, slik at resultatet av T7EI analysen er to forskjellige band på en ag oppsto gel (se figur 6).
    2. Kjøre PCR i en termisk cycler med følgende parametere: 98 ° C i 3 minutter, 98 ° C for 30 s (trinn 2), 63 ° C for 30 s (trinn 3), 72 ° C for 30 s (trinn 4), Gjenta trinn 2\u20124 for en annen 34 sykluser, 72 ° C i 2 minutter , og hold på 4 ° C.
    3. Løse reaksjonen på en 2% agarose gel med 1 x TAE buffer.
    4. Avgiftsdirektoratet PCR produktet fra gel med rene, skarpe skalpell og rense bruker en gel utvinning kit, i henhold til produsentens instruksjoner. Måle konsentrasjonen av PCR produktet bruker et spektrofotometer på en bølgelengde på 260 nm absorbansen (se Tabell for materiale).
    5. Forberede en analysen blanding som inneholder 200 ng av DNA, 2 µL T7EI reaksjon buffer (10 x), og toppet opp til 19 µL med ddH2O (se Tabell for materiale).
    6. Nytt anneal PCR produktet i en termisk cycler bruker følgende parametere: 95 ° C i 5 min, rampe ned til 25 ° C på 6 ° C/min, hold på 4 ° C.
    7. Legge til 5 U T7EI re glødet PCR produktet, bland godt pipettering og ruge på 37 ° C i 50 minutter.
    8. Løse T7EI-fordøyd DNA på en 2,5% agarose gel med 1 x TAE buffer.
    9. Bilde gel kvantifisere bandet intensiteten bruker ImageJ og beregne prisen av indel formasjon bruker følgende formel:
      Equation 1
      der en representerer intensiteten intakt PCR og b og c tilsvarer intensiteten av cleavage produkter43.
      1. For å måle intensiteten av et band i ImageJ, først tegn en rektangulær boks rundt i bandet nær grensen som mulig. Andre Klikk på analyser og deretter Sette mål. Kontroller at alternativene , mener grå verdiog integrert tetthet er merket. Lukk vinduet ved å klikke ok. Tredje Klikk på analyser og deretter mål. Den betyr eller RawIntDen verdien brukes som bandet intensiteten.

Figure 6
Figur 6 : Kontrollere celler for vellykket genomet redigering utfall. (en) A skjematisk illustrerer to vanligvis brukt analyser, nemlig mismatch cleavage analysen med T7 endonuclease jeg (T7EI) enzym og neste generasjons sekvensering (NGS) eller målrettet amplicon sekvenser. De blå vannrette rektanglene angir DNA og gule sirkler angi endringer forårsaket av CRISPR-Cas systemet. Primere for T7E1 analysen er merket i grønt, mens primere for å generere amplicons for NGS er merket i rødt. (b) Design av primer sekvenser for T7EI cleavage analysen og NGS. Her er målet genomisk locus ekson 45 av menneskelig CACNA1D genet. Webområdet tiltenkte endring angis med en stjerne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Utføre målrettet amplicon sekvenser (se figur 6).
    1. Design PCR primere å forsterke målet genomisk locus. Plasser ett primerne som mindre enn 100 bp men mer enn 20 bp fra protospacer.
      Merk: Vanligvis totalstørrelsen PCR produkt er utformet til å være rundt 150\u2012300 bp (se figur 6).
    2. Legge flere sekvenser primerne som følger: (a) 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC - NNNN-[frem Primer]-3'; (b) 5' - GTGCTCTTCCGATCT-[omvendt Primer] –3'.
    3. Sette opp en 50 µL PCR reaksjonen blanding som inneholder 10 µL PCR reaksjon buffer (5 x), 1 µL av dNTP (10 mM), 5 µL av primer en (10 µM), 5 µL av primer b (10 µM), 0,5 µL DNA polymerase, 2\u20125 µL genomisk DNA-mal (avhengig av hvor mange celler er sortert) , deretter topp opptil 50 µL med ddH20.
    4. Kjøre PCR i en termisk cycler med følgende parametere: 98 ° C i 3 minutter, 98 ° C for 30 s (trinn 2), 63 ° C for 30 s (trinn 3), 72 ° C i 15 s (trinn 4), Gjenta trinn 2\u20124 for en annen 34 sykluser, 72 ° C i 2 minutter , og hold på 4 ° C.
    5. Løse reaksjonen på 2% agarose gel og rense PCR produktet bruker en gel utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifisere DNA bruker et spektrofotometer på en bølgelengde på 260 nm absorbansen (se Tabell for materiale).
    6. Syntetisere følgende runde 2 PCR primere: (c) 5' \u2012 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'; (d) 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[strekkode] - GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3
    7. Sette opp en 20 µL PCR reaksjon blande inneholder 4 µL PCR reaksjon bufferen (5 x), som er 0,4 µL av dNTP (10 mM), 2 µL primer c (10 µM), 2 µL av primer d (10 µM), 0,2 µL av DNA polymerase, 2 µL av DNA (fra trinn 7.3.5 utvannet 1: 100), og 9,4 µL ddH2O.
      Merk: Fortynningsfaktoren for malen DNA kan variere avhengig av sin opprinnelige konsentrasjon. Hvis konsentrasjonen er rundt 20\u201240 ng/µL, bruke en fortynningsfaktoren for 1: 100. Dessuten, velge en annen strekkode for hver eksperimentelle prøve, hvis den samme primeren en og primer b brukes i trinn 7.3.3-feilrettingsprogram.
    8. Kjøre PCR i en termisk cycler med følgende parametere: 98 ° C i 3 minutter, 98 ° C for 30 s (trinn 2), 65 ° C for 30 s (trinn 3), 72 ° C for 30 s (trinn 4), Gjenta trinn 2\u20124 for en annen 14 sykluser, 72 ° C i 2 minutter , og 4 ° C holder.
    9. Løse 5 µL av hver reaksjon på en 2% agarose gel å avgjøre hvor vellykket PCRene. sammen alle prøvene sammen (forutsatt at en annen strekkode er brukt for hver prøve) og rydde opp grupperte DNA ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner. Hvis noen av PCRene viser flere band (som viser tilstedeværelsen av ikke-spesifikke produkter), kan du utføre et ekstra gel utvinning skritt.
    10. Sekvens biblioteket på en høy gjennomstrømning sekvensering instrument (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner å produsere sammenkoblede 151 bp leser. Les 1 sekvensering primer er tilpasset designet og har angis separat. Sekvensen er som følger: Read1_seq: 5-CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3 ". Les 2 sekvensering primer og indeks sekvensering primer er standard og tilbys i påreagenskassetten.
      Merk: T7EI analysen og målrettet amplicon sekvensering brukes vanligvis til å kontrollere effektiviteten av genomet redigering. Men kan andre eksperimenter utføres for å evaluere redigering effektivitet, avhengig av DNA endringer innført. For eksempel hvis en begrensning-området opprettes på målområdet, kan en begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP) analysen utføres. Det ligner på T7EI analysen bortsett fra at en begrensning endonuclease brukes til å fordøye PCR produktet i stedet.

8. screening av personlige kloner

  1. Dele cellene fra trinn 6.3, når de begynner å bli confluent. For hver individuelle klone, samle de gjenværende cellene og ekstra genomisk DNA etter trinn 7.1.
  2. Utføre T7EI analysen for alle personlige kloner etter avsnitt 7.2, bortsett fra en endring. Forsterke målet genomisk locus fra wildtype celler og i trinn 7.2.5, i stedet for 200 ng test DNA, mix 100 ng test DNA med 100 ng av wildtype DNA.
    Merk: Grunnen til det endrede trinnet er at noen kloner kan ha gjennomgått vellykket biallelic konvertering og homozygous mutanter. I slike tilfeller blir det ingen cleavage band i T7EI analysen hvis wildtype DNA ikke er blandet.
  3. Sekvens målområdet i kloner som viser cleavage band i T7EI analysen.
    1. Forsterke endret genomisk locus etter trinn 7.2.1–7.2.4.
    2. Definere følgende kloning reaksjon: 4 µL av PCR produkt 1 µL av salt løsning, 1 µL av TOPO vektor (se Tabell for materiale).
    3. Bland forsiktig av pipettering og ruge ved romtemperatur for minst 5 min.
    4. 3 µL av reaksjonen blanding forvandle kjemisk kompetent E. coli celler (som TOP10 eller Stbl3) (se utfyllende fil 1). Spre transformert bakterieceller på en LB agar plate med 50 μg/mL kanamycin.
    5. Neste dag, vaksinere minst 10 koloniene i LB flytende mediet som inneholder 50 μg/mL kanamycin.
    6. Når bakteriekulturer grumset, isolere plasmider bruker en miniprep kit (se Tabell for materiale) og ordner dem ved hjelp av standard M13 frem eller M13 omvendt primer.
  4. Utføre en western blot (også kjent som immunoblot) for å bestemme fravær eller tilstedeværelse av målrettet protein (hvis genomet redigering eksperiment innebærer ut et protein-koding gen via frameshift mutasjoner). Se utfyllende filen 1.
    Merk: Andre eksperimenter kan utføres for å identifisere klone bærer genomisk endringene. En fenotypiske analysen kan for eksempel utføres hvis ut et bestemt gen er kjent for å forårsake visse endringer i mobilnettet atferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utføre et genom redigering eksperiment, en CRISPR plasmider uttrykke en sgRNA rettet mot den locus steder skal klones. Først er plasmider fordøyd med en begrensning enzym (vanligvis en type IIs enzym) å linearize den. Det anbefales å løse fordøyd produktet på en 1% agarose gel sammen med en ufordøyd plasmider å skille mellom en fullstendig og delvis fordøyelsen. Som ufordøyd plasmider er supercoiled, pleier de å kjøre raskere enn sine linearisert kolleger (se figur 7en). Andre, to oligonucleotides for sgRNA må herdet og samskrevet i den kuttet plasmider. For å avgjøre hvis oligonucleotides ha blitt med hell Klon i CRISPR plasmider ryggraden, er koloni PCR utført (se figur 7b). Positiv kloner er deretter inokulert før plasmider er trukket ut og sendt for Sanger sekvensering.

Figure 7
Figur 7 : Kloning av sgRNA-uttrykke CRISPR plasmider. (en) bildet viser fordøyd og ufordøyd plasmider etter gel geleelektroforese. Baner 1\u20123 viser plasmider som har vært linearized helt av BbsI. Lane 4 viser den opprinnelige ufordøyd plasmider, som er supercoiled og dermed overfører raskere på en agarose gel. (b) representant gel bilde av kolonien PCR produkter. Positiv kloner er merket med en grønn hake (indikerer at oligonucleotides har vært vellykket samskrevet i vektor ryggraden), mens negativ kloner er merket med et rødt kryss. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Når du konstruerer har vært sekvens verifisert, kan de være transduced i en ønsket celle linje (for eksempel HEK293T). CRISPR plasmider bære ofte en valgbar markør (f.eks en mCherry gen), og dermed slik at vellykket transduced celler kan velges. Fluorescens kan visualiseres lett under et mikroskop ved vellykket levering av plasmider (se Figur 8en). Celler er sortert av flowcytometri rundt 24\u201272 h etter hva. Den gating ligger basert på en ikke-transfekterte kontroll (se Figur 8b). Del av sorterte cellene er seeded på en vev kultur plate å muliggjøre gjenoppretting.

Figure 8
Figur 8 : Innføring av CRISPR reagenser i menneskeceller. (en) representant mikroskopi bildet av HEK293T celler ble transfekterte med en CRISPR plasmider bærer en mCherry markør (se Tabell for materiale). Hva effektivitet kan estimeres ved prosentandelen av celler vises røde fluorescens. 10 x forstørrelse, skala linjen representerer 200 µm. (b) representant FACS tomter. Transfekterte celler (høyre panel) er gated mot en ikke-transfekterte kontroll (venstre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mens sorterte cellene er skadefri, evalueres redigering effektiviteten for å fastslå om eksperimentet bør videreføres. Genomic DNA (gDNA) er isolert fra de gjenværende un-belagt cellene. En T7EI analysen utføres for å kontrollere cleavage effektiviteten, som beregnes fra intensiteten av bandene observert på en agarose gel (se figur 9en). I tillegg, hvis et HDR-baserte eksperiment er utformet for å innlemme en begrensning område på målet locus, en RFLP analysen kan utføres med tilsvarende begrensning enzymet (se figur 9b).

Figure 9
Figur 9 : Vurdere omfanget av genomet redigering. (en) representant gel bildet viser resultatene av en T7E1 analysen. Baner 1\u20128 representerer ulike eksperimentelle prøver. For hver prøve indikerer topp bandet uncut DNA, mens de nederste to bandene angi cleavage produktene. Varierende NHEJ effektivitet kan observeres blant eksemplene. Fordøyelsen av PCR amplicons fra ikke-transfekterte celler brukes som en negativ kontroll og er preget av en "-". (b) representant gel bildet viser resultatene av en RFLP analysen. Baner 1\u20126 representerer ulike eksperimentelle prøver. For hver prøve indikerer topp bandet uncut DNA, mens de nederste to bandene angi cleavage produktene etter begrensning digest. Varierende HDR effektivitet kan observeres blant eksemplene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hvis redigering effektiviteten er akseptabelt (f.eks minst 5% av T7EI analysen), vi fortsetter å identifisere individuelle kloner som bærer DNA endringene. Belagt celler, som har blitt igjen for å gjenopprette, er seeded tynt slik at enkelte koloniene å vokse. Deretter er enkelte koloniene plukket og utvidet, før gDNA er isolert fra disse personlige kloner. En annen runde av T7EI analysen utføres for å identifisere kloner med endrede DNA på målområdet. TOPO kloning og Sanger sekvensering utføres deretter for å fastslå den eksakte sekvenser av alle alleler. Ideelt for genet knockouts, skal indeler ikke være i multipler av tre, som gir frameshift mutasjoner (se Figur 10en). Videre validere at et protein-koding gen har vært vellykket deaktivert, en western blot kan utføres slik at det finnes ingen målrettet protein (se Figur 10b).

Figure 10
Figur 10 : Screening for genet fortrenging. (en) representant Sanger sekvensering data. Den opprinnelige uendrede DNA sekvensen (øverste rad) kan justeres sekvensering resultatet mottatt (nederste rad) til å kontrollere om endringer har skjedd. Her er det en 1 bp innsetting og 7 bp sletting på målområdet (som avbildet av røde bokser, som representerer hull i justeringen). (b) representant western blot bilde. Her er flere kloner (utvidet fra enkeltceller) vist for tilstedeværelse eller fravær av GLUL protein. Røde piler indikerer kloner der GLUL genet har blitt slått ut. "WT" står for wildtype celler, der GLUL er svært uttrykt. ACTB (β-utgangen) fungerer som en lasting kontroll (se Tabell for materiale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CRISPR-Cas systemet er en kraftig og revolusjonerende teknologi til ingeniør genomes og transcriptomes av planter og dyr. Mange bakteriell arter er funnet for å inneholde CRISPR-Cas-systemer, som kan være tilpasset genom og transcriptome engineering formål44. Selv om Cas9 endonuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) var den første enzymet distribueres vellykket i menneskeceller21,22,23,24, enzymer fra andre bakterie arter, inkludert de som vises i tabell 1, har også vist seg å fungere godt som engineering verktøy i menneskelig16,26,27,28. Følgelig er forskere som er opptatt av å bruke teknologien ofte usikker på hvilket system du bør velge for deres arbeid og hvordan du utformer sine eksperimenter for optimale resultater.

Her søker vi å hjelpe CRISPR brukernes å maksimere deres bruk av teknologi. Grunnleggende for noen genomet redigering eksperimentet er valget og kloning av et riktig sgRNA for målretting. Utført av oss og andre avsløre at forskjellige CRISPR-Cas systemer er optimalt aktive forskjellige spacer lengder (se tabell 1)25. I tillegg bør til forsker velge hvilket system du bruker basert på kunnskap om målområdet. Vanligvis blant enzymer testet i våre evalueringsstudie, utstillingen SpCas9 og LbCas12a høyeste cleavage effektiviteten, spesielt i mer uttrykt gener antagelig som følge av mer åpne og tilgjengelige chromatin. Derfor anbefaler vi disse enzymene for rutinemessig genomet redigering eksperimenter. Vi har imidlertid funnet at begge nucleases ha høyere toleranse for uoverensstemmelser mellom sgRNA og målrettet DNA enn AsCas12a. Derfor, hvis forskeren er rettet mot et gen med flere nært beslektede homologs eller en repeterende region i genomet, anbefaler vi bruker AsCas12a for å minimere off-målet effekter. Alternativt kan SaCas9 også benyttes som det krever lengre avstand langt for robuste aktivitet, og dermed tilby høyere iboende spesifisitet enn SpCas9 og LbCas12a.

Nøyaktig redigering av et genomisk locus krever innføring av en reparasjon mal med CRISPR reagenser. Malen fungerer som en bruksanvisning fortelle cellene reparere double-strandet pause via HDR veien. To vanlige typer mal er en ssODN og en plasmider. Utformingen av denne reparasjon mal er et kritisk punkt for optimal HDR effektivitet25,39,42,45,46,47. SsODNs er den DNA stranden som rekkefølgen av ssODN er avledet viktig. AsCas12a og LbCas12a viser en preferanse for ssODNs av ikke-mål strand sekvensen, mens SpCas9 en preferanse for ssODNs av målet strand sekvensen i stedet. Videre HDR effektivitet potensielt kan forbedres ytterligere ved å utnytte asymmetrisk givere. Forskeren har imidlertid være forsiktig med hvilke homologi arm er utvidet (se figur 2). Øke lengden på feil armen vil ende opp nedverdigende HDR effektiviteten i stedet. For plasmider donorer, er malen ofte linearized av begrensning digest før cellen signaltransduksjon. I tillegg har en "double-cut" plasmider donor, der spacer-PAM sekvenser er plassert før og etter venstre og høyre homologi armene, vist seg å gi en høyere HDR effektivitet enn en plasmider donor uten ekstra avstand-PAM sekvenser 42.

Foruten forberedelse av nødvendig CRISPR reagenser med eller uten en reparasjon mal omfatter generasjon av endrede linjer (f.eks inneholder bestemte genet fortrenging) også cellen signaltransduksjon enkeltcelle ekspansjon og screening av personlige kloner. Protokollen skisserer alle nedstrøms trinnene for å la brukere utføre en fullstendig genomet redigering eksperiment. Noen detaljer er cellen linje-spesifikke. For eksempel kan noen linjer være lett å transfect, mens andre krever omfattende optimalisering med forskjellige signaltransduksjon metoder, inkludert nucleofection og electroporation. Viktigere, fra våre erfaringer er et viktig skritt i protokollen encellede kloning. Visse celletyper kan ikke sprer når de er seeded som en enkeltcelle i en vel, kanskje på grunn av utskilles vekstfaktorer. For eksempel vokser menneskelige embryonale stamceller og mange pasient-avledede primære cellelinjer vanligvis veldig dårlig som isolert enkeltceller. Etter transduction anbefaler vi derfor plating celler tynt og deretter plukke personlige kolonier på en tallerken bruke flowcytometri til å sortere enkeltceller i forskjellige brønner av en 96-brønns plate. Det kan også være behov for å legge Pro overlevelse faktorer til celle kultur media, som ROCK hemmer48, for å forbedre utvinning av dissosiert celler. I tillegg under av encellede kloning, kan det være tilfeller der to separate celler vokse svært nær hverandre og ende opp sammenslåing, og dermed gi falske utseendet av en koloni bare. I slike situasjoner kan i fasen å bestemme genomisk mutasjoner introdusert, en ende opp identifisere tre eller flere forskjellige alleler. Likevel er det fortsatt mulig å utvinne individuelle kloner av tynt plating disse cellene igjen og deretter plukke flere individuelle kolonier.

Avslutningsvis revolusjonerer CRISPR-Cas teknologien biomedisinsk og bioteknologisk forskning. Men lider den for tiden av flere begrensninger (som begrenset målretting område og store protein størrelse) som hemmer utbredt wireheading i noen programmer, inkludert genterapi. Likevel, som tiden går, mer naturlig forekommende Cas enzymer vil bli oppdaget i et bredt spekter av mikrobielle arter og noen av disse nye enzymer kan ha fordelaktige egenskaper over eksisterende nucleases. Detaljerte studier så må utføres for å riktig forstå parameterne design av disse romanen CRISPR-Cas-systemer når de er utplassert som Genova og transcriptome engineering verktøy. Derfor, mens våre protokollen fungerer som en god referanse for gjeldende genomet redigering innsats, må det kontinuerlig oppdatert med siste informasjon om det nye systemer som de dukker opp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke konkurrerer økonomiske interesser.

Acknowledgments

M.H.T. støttes av et byrå for vitenskap teknologi og Research felles rådet Office grant (1431AFG103), gir en National Medical Research Council (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation gir (NRF2013-THE001-046 og NRF2013-THE001-093), en Departementet for utdanning Tier 1 grant (RG50-17 (S)), en oppstart gi fra Nanyang Technological University, og midler til internasjonale genetisk Engineering maskin (iGEM) konkurransen fra Nanyang Technological University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) NEB M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X 1st Base BUF-3000-50X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X 1st Base BUF-3020-10X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 
BbsI NEB R0539
BsmBI NEB R0580
T4 DNA Ligase NEB M0202 400,000 units/ml
Quick Ligation Kit NEB M2200 An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit Thermo Scientific K1423 An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit Thermo Scientific 451245 The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli Thermo Scientific C737303
LB Broth (Lennox), powder Sigma Aldrich L3022 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder Sigma Aldrich L2897 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media - - 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Biotechnology A-301
REDiant 2X PCR Mastermix 1st Base BIO-5185
Agarose 1st Base BIO-1000
T7 Endonuclease I NEB M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit Favorgen FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Hyclone SH30081.01 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM Gibco 25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X Gibco 25200
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160 FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X Gibco 20012
jetPRIME transfection reagent Polyplus Transfection 114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 Epicentre LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52067 An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix NEB N0447
6X DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 Merck 539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm Bio-Rad 1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X Bio-Rad 1610772 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X 1st base BUF-2020 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution Sigma Aldrich P7170
TBS, 20X 1st base BUF-3030 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Skim Milk for immunoassay Nacalai Tesque 31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP Advansta K12043
Antibody for β-actin (C4) Santa Cruz Biotechnology sc-47778 Lot number: C0916
MiSeq system Illumina SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
Qubit fluorometer Thermo Scientific Q33226
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Scientific AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA Addgene 61591 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 Addgene 108379 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Addgene 42230 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9 Addgene 41815 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) Addgene 71814 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) Addgene 72247 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Tags

Genetikk problemet 146 CRISPR Cas9 Cas12a genomet redigering ikke-homologe slutten begynte homologi-rettet reparasjon
Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. A. B.,… More

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. A. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter