Summary
هنا نحن تقرير الأساليب الشائعة لتحليل الدالة متجولة مورين البلاعم السنخية وإزالة البكتيريا من الرئة. دراسة هذه الأساليب البلعمه في المختبر من fluorescein isothiocyanate الخرز والمجراه في البلعمه من "بروتين فلوري أخضر" الزائفة الزّنجاريّة . كما يصف لنا طريقة لمسح P. الزّنجاريّة في الفئران.
Abstract
البلاعم السنخية (هيئة علماء المسلمين) حراسة الفضاء التهاب في الرئة. البلعمه بمقياس الدعم الكلي تلعب دوراً حاسما في الدفاع ضد غزو العوامل الممرضة، وإزالة الخلايا الميتة أو الجسيمات الأجنبية، وفي القرار الردود الملتهبة والأنسجة يعيد البناء، العمليات التي هي توسط المستقبلات السطحية المختلفة من هيئة علماء المسلمين. هنا، نحن التقرير أساليب لتحليل الدالة متجولة لمقياس الدعم الكلي باستخدام استراتيجيات تجريبية وفحوصات في المختبر والمجراه في التفريق بين نمط الاعتراف مستقبلات-وتكملة مستقبلات-، ونادي غاما بوساطة مستقبلات البلعمه. وأخيراً، نحن نناقش أسلوب لإنشاء ووصف نموذج P. الزّنجاريّة الالتهاب رئوي في الفئران لإزالة البكتيريا الحية في تقييم. هذه الاختبارات تمثل الأساليب الأكثر شيوعاً لتقييم وظائف صباحا ويمكن استخدامها أيضا لدراسة وظيفة بلعم وإزالة البكتيريا في الأجهزة الأخرى.
Introduction
هيئة علماء المسلمين هي البالعات المقيم الرئيسي في الحويصلات الهوائية في مرحلة استراحة وواحدة من اللاعبين الرئيسيين من الاستجابات المناعية الفطرية من خلال الاعتراف واستيعاب استنشاق الجراثيم والجسيمات الأجنبية1،2. وذكر أن هيئة علماء المسلمين تعتبر أساسية للتخليص السريع من العديد من مسببات الأمراض الرئوية مثل P. الزّنجاريّة و الالتهاب الرئوي الكلبسيله3،4، حيث غالباً ما يؤدي نقص في البلعمه صباحا في الجهاز التنفسي التهابات، مثل الالتهاب الرئوي الحاد، مما يتسبب في ارتفاع معدلات الوفيات والاعتلال.
هيئة علماء المسلمين أيضا بدء الفطرية الردود التهاب في الرئة بإنتاج السيتوكينات والمستقطبات مثل تنف-α وايل-1β، الذي الحديث المتبادل مع الخلايا الأخرى للبيئة السنخية لإنتاج المستقطبات وتجنيد العَدلات التحريضية، وحيدات، و الخلايا المناعية التكيفية في الرئة5. على سبيل المثال، يساعد إيل-1β التي تنتجها هيئة علماء المسلمين رئيس الوزراء إطلاق سراح chemokine العَدلات CXCL8 من الخلايا الظهارية6. وعلاوة على ذلك، تسهم هيئة علماء المسلمين البلعمه من الكريات البيض النوى apoptotic (بمنس)، فشل الأمر الذي يؤدي إلى تسرب المطرد للإنزيمات داخل الخلايا من بمنس إلى الأنسجة المحيطة مما أدى إلى تلف الأنسجة والتهاب المطول 7 , 8 , 9.
هو باعتراف مباشر بأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة في السطح الممرض المستقبلات التعرف على نمط (برس) من هيئة علماء المسلمين أو بواسطة الربط من مسببات الأمراض أوبسونيزيد مع مستقبلات المستجيب محصنة من هيئة علماء المسلمين وساطة البلعمه بهيئة علماء المسلمين 10-لهذا الأخير، مقياس الدعم الكلي يمكن التعرف على الأهداف التي أوبسونيزيد مع الغلوبولين المناعي (IgG) من خلال ما مستقبلات Fcγ (FcγR) أو مسببات الأمراض مغلفة بشظايا مكملاً، C3b و C3bi، من خلال مستقبلات تكمل بهم (CR)11. بين مستقبلات مكملاً، وأعرب عن الجمهورية التشيكية من فوق عائلة الغلوبولين المناعي (كريج) بشكل انتقائي في الأنسجة الضامة12، ونتيجة الأخيرة وأبرزت دور كريج في البلعمه صباحا في سياق P. الزّنجاريّة الالتهاب الرئوي 13.
العديد من الدراسات الأصلية استخدام أساليب تقييم بلعم البلعمه لوصف الآليات الجزيئية بلعم الدالة14،15. ومع ذلك، تتطلب أساليب مثل البلعمه المجراة في إجراء تقييم كمي دقيق البلعمه. وهنا، يمكننا تلخيص منهجية مفصلة البلعمه على حد سواء في المختبر والمجراه في استخدام fluorescein isothiocyanate (فيتك)-الزجاج الخرز والبروتين P. الزّنجاريّة أخضر نيون (التجارة والنقل)، على التوالي. علاوة على ذلك، يشرح لنا الطريقة للتفريق بين بر-والجمهورية التشيكية--و FcγR بوساطة البلعمه. وأخيراً، نحن تقرير طريقة تميز إزالة البكتيرية في الماوس فيما يتعلق بالتهاب رئوي P. الزّنجاريّة .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية.
1. فلوري الخرز البلعمه
- Euthanize الماوس (C57BL/6J، 6 أسابيع من العمر، أنثى) CO2 خنقاً وفقا لبروتوكولات IACUC للقتل الرحيم الأخلاقية للحيوانات ب.
- وضع الفأرة أعلى البطن على لوحة تشريح مغطاة بالمناشف الورقية. دبوس الكفوف باستمرار مع أطرافه في سبريديجلي وربط سلسلة تحت الأسنان الأمامية لسحب رأسه إلى الوراء حيث أن القصبة الهوائية هي في وضع مستقيم ومستوى.
- ويت الحلق والصدر والبطن مع الإيثانول 70% لتطهير ومنع الفراء من التمسك الأدوات الماوس.
- استخدام الملقط العادية، سحب ما يصل إلى الجلد في خط الوسط للجسم، وقطع بالمقص الجراحي تصل خط الوسط إلى الجزء العلوي من الحلق.
- استخدام نهاية حادة مقص جراحي القياسية، بعناية الابتعاد بالعضلات والأنسجة الضامة في الحلق واستخدام مقص الربيع (ميكروسسيسورس) لفضح القصبة الهوائية.
- تجتاح عصابة غضروف مع الملقط، بعناية إجراء شق صغير (~1.5 ملم)، باستخدام ميكروسسيسورس، في مواجهة بطين من القصبة الهوائية وإدراج قنية ز 18 في القصبة الهوائية.
- الغسل بلطف 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1 مل في وقت واحد. في كل مرة بلطف سحب السائل في المحاقن ورينفوسي مرة أخرى في الرئة، س 3 على التوالي. وبعد جمع بالف، أداء التفكك عنق الرحم التأكد من القتل الرحيم. نقل برنامج تلفزيوني المجمعة (مل ~2.8)، وسائل الغسل للفيسيولوجيا (بالف)، إلى أنبوب الطرد المركزي في غ س 1,000 لمدة 10 دقائق، وجمع بيليه. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد للأنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 10 دقيقة ليغسل الأنقاض وجمع الضامة السنخية الأعلاف.
- ريسوسبيند بيليه في 2 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 10% معطل nonheat الجنيني البقري المصل (FBS) وثقافة الضامة السنخية الأولية في نفس الوسائط لمدة يومين على طبق زجاج لأسفل عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد.
- نضح وسائط الإعلام القديمة وغسله مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل وسائط جديدة. إضافة الخرز فيتك (كاربوكسيلاتيد مطاط الخرز، 2 ميكرومتر في القطر، والخرز 50/خلية) واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد.
- أغسل على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (1 مل في وقت، لما مجموعة خمسة يغسل) لإزالة حبات خارج الخلية. صورة الخلايا 100 عشوائياً وحساب الخلايا مع الخرز داخل الخلايا (488 نانومتر).
ملاحظة: فهارس Phagocytic هي عدد حبات بلعها مقسوماً على العدد الكلي الضامة؛ النسبة المئوية للخلايا البلعمية هو عدد الضامة الذي يبتلع حبة واحدة على الأقل مقسوماً على العدد الكلي الضامة16.- وبدلاً من ذلك، بعد حضانة ح 1 مع الخرز، تغسل الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني وعملية لهم للتدفق الخلوي للتحديد الكمي البلعمه. وبالمثل، عملية هيئة علماء المسلمين دون الخرز كخلايا أونستاينيد أو خلايا عنصر التحكم. حساب الإيجابية النسبة المئوية ويعني كثافة الأسفار، واستخدام البرمجيات التدفق الخلوي، بتحديد هذه الخيارات في البرنامج.
2-البلعمه FcγR والجمهورية التشيكية-بوساطة
- ل opsonization، احتضان 2 x 108 الأغنام خلايا الدم الحمراء (سربكس) مع 50 ميليلتر من الأرانب المضادة-مخمدة-IgM أو 50 ميليلتر من الأرانب المضادة-مخمدة-مفتش لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة11.
- احتضان سربكس أوبسونيزيد IgM مع 50 ميليلتر من المصل الإنسان تفتقر إلى C5 (C5D) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإصلاح أجزاء مكملة C3b و C3bi على سربكس المغلفة IgM.
- البذور بلعم مورين الخلايا (خلايا MH-S) (10,000 الخلايا أيضا) في لوحة 96-جيدا واحتضان بين عشية وضحاها الحصول على التقاء ~ 70%. إضافة 100 ميليلتر من/mL 1 × 107أوبسونيزيد سربكس لكل بئر من الخلايا MH-S واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. المياه والصرف الصحي غير منضم سربكس بسرعة كبيرة (~ 1 دقيقة) مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم (ACK).
- الخلايا مع الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% وإضافة 50 ميليلتر من 2, 7-ديامينوفلوريني (DAF) التي تحتوي على 3% بيروكسيد الهيدروجين واليوريا م 6. قياس امتصاص لتشكيل الهيموغلوبين حفزت فلوريني الأزرق في 620 نانومتر.
- تحديد عدد سربكس باستخدام منحنى قياسي في شمال البحر الأبيض المتوسط 620 امتصاص القيم مع عدد معروف من سربكس. وبالمثل، المحتضنة الخلايا عملية MH-S مع سربكس نونوبسونيزيد لاستخدامها كعناصر سلبية.
3-بوساطة بر البلعمه
- اتبع الخطوات 1.1-1.9 للعزلة واستزراع للماوس البلاعم السنخية الأولية.
- بعد يومين، قم بإزالة الوسائط وتغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 500 ميليلتر الطازجة الوسائط التي تحتوي على فلور أليكسا-488-مترافق بيوبارتيكليس زيموسان-أ (100 الجسيمات في الطبق).
- احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. تتوقف البلعمه بإضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج.
- تغسل الخلايا على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (1 مل في وقت، لما مجموعة خمسة يغسل). إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الخلايا على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني (1 مل في وقت، لما مجموعة خمسة يغسل) وإبقاء الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- صورة الخلايا تحت التباين التدخل التفاضلية وقناة فلورسنت في 488 نانومتر. حساب مقياس الدعم الكلي التي تحتوي على بيوبارتيكليس زيموسان-أ وتحديد النسبة مئوية البلعمه.
4. في فيفو البلعمه البلاعم السنخية
ملاحظة: تطعيم P. الزّنجاريّة بروتينات فلورية خضراء على طبق أجار مغذيات واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تطعيم مستعمرة واحدة إلى 2 مل مرق المغذيات وتنمو البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- وفي اليوم التالي تخدير الفئران مع إدارة داخل xylazine الكيتامين و 10 مغ/كغ 100 مغ/كغ. تأكيد أنيسثيتيزيشن السليم عن طريق عدم الاستجابة إلى رشة أخمص القدمين.
- وضع الماوس على لوحة مسطحة مع شريط المطاطي عبر القواطع العلوية ووضعه في موقف سيميريكومبينت (45°) مع السطح البطني والمنصة التي تواجه التصاعدي. استخدام الملقط المنحنية، جزئيا بسحب اللسان. استخدام ميكروسبرايير، إينتراتراتشيلي إدارة 50 ميليلتر (5 × 106 مستعمرة تشكيل وحدات [زيمبابوي])17 من P. الزّنجاريّة بروتينات فلورية خضراء في رئات الفئران أنيسثيتيزيد.
- بعد 1 ساعة إصابة، اتبع الخطوات 1، 1، 1-7.
- ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني وسيتوسينتريفوجي لهم (1,000 س ز، 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) إلى شريحة زجاج.
- خلطات وصمة عار الشرائح سيتوسبين البلاعم السنخية والعدلات واللمفاويات، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- حدد مقياس الدعم الكلي 100 عشوائياً، حساب مقياس الدعم الكلي التي تحتوي على البكتيريا داخل الخلايا، وتحديد النسبة مئوية البلعمه.
5. في فيفو "استخدام إزالة البكتيريا" P. الزّنجاريّة
- تطعيم P. الزّنجاريّة على طبق أجار عزلة P. الزّنجاريّة واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تطعيم مستعمرة واحدة إلى 2 مل مرق ليسوجيني (رطل) وتنمو البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. حساب زيمبابوي، باستخدام الصيغة التالية.
زيمبابوي/مل = (عدد المستعمرات × معامل التخفيف)/حجم لوحة الثقافة.
تمييع الثقافة مع برنامج تلفزيوني للحصول على المطلوب زيمبابوي/مل. - في المحاكمة الأولى، إينتراتراتشيلي بحقن جرعة ~2.5 x 105 مليلتر زيمبابوي P. الزّنجاريّة المقاسة تخديره البرية من نوع (WT) و TRIM72كو الفئران، كما ذكر في الخطوة 4، 2. قياس وزن الجسم يوميا لمدة 6 أيام.
- في 2 المحاكمة، حقن جرعة ثانية من P. الزّنجاريّة (5 × 105 زيمبابوي/mL) في الفئران التي نجت في 1 المحاكمة وقياس وزن الجسم لمدة 4 أيام.
- وفي 3 للمحاكمة، باستخدام مجموعة مختلفة من الفئران، حقن الفئرانكو WT و TRIM72 بجرعة قاتلة (3 × 107 زيمبابوي/mL) من P. الزّنجاريّة وتسجيل الوفيات خلال يومين حقن. سيتم تقييم الحيوانات تظهر علامات الإجهاد الشديد مثل هيئة هامة لتخفيف الوزن، متحدب مرة أخرى، وفقدان الشهية، أو ضيق التنفس من الأطباء البيطريين الذين حضروا. سيتم التضحية بالحيوانات غير قابل للعلاج فورا.
- أما في القتل أو بعد القتل الرحيم في اليوم الثاني بعد الحقن، جمع أنسجة الرئة الجامع للتحديد الكمي لعبء الرئة البكتيري في ذروة الإصابة.
- لاختبار عبء الرئة البكتيري وإضافة 200 ميليلتر من المحلول الملحي العادي إلى أنسجة الرئة وتجانسه، استخدام أحد إعدادات مجربة سابقا في الخالطون إلكترونية أن يعطل تماما أنسجة الرئة دون كسر البكتيريا. ضبط الحجم الإجمالي هوموجيناتي الرئة إلى ميليلتر 100 مل 1 ولوحة الرئة على ألواح أجار العزلة Pseudomonas في تخفيف المسلسل إذ.
- احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 24 وعدد المستعمرات البكتيرية لتحديد زيمبابوي في الرئة كاملة.
6. التحليل الإحصائي
- استخدام الطالب t-اختبار لتحديد الدلالة الإحصائية للفرق بين المجموعتين. تنظر فرق يعتد به إحصائيا عند 0.05 < p . يتم عرض كافة البيانات يعني ± الخطأ المعياري للوسط (SEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أجرينا أول تجربة لتحليل البلعمه بالماوس مقياس الدعم الكلي الأساسي. طوال جميع التحليلات، قارنا AMs المعزولة من الفئران WT و TRIM72كو . كما هو مبين في الشكل 1ألف، كشف الفحص المجهري الأسفار أن البلعمه من حبات الزجاج فيتك بالماوس مقياس الدعم الكلي الأساسي يحدث بعد ح 1 من الحضانة. الشكل 1 ب يبين تحليل البلعمه بالتدفق الخلوي. التحديد الكمي البلعمه تقاس بالفحص المجهري ويمثل التدفق الخلوي في الشكل 1ج دمن الرقم 1، على التوالي. يتم تمثيل البلعمه FcγR والجمهورية التشيكية-بوساطة خلايا MH-S في الشكل 2A، ويبين الشكل 2ب التحديد الكمي. وتظهر هذه النتائج أن التعبير عن TRIM72 في خلايا MH S نتج عنه انخفاض أكثر من خمسة إضعاف في تكملة البلعمه. صور الممثل لابتلاع الجسيمات زيموسان-أ فلور أليكسا-488-مترافق بمقياس الدعم الكلي الأساسي المعزولة من الفئران WT أو TRIM72كو مبينة في الشكل 2ج، والتقدير الكمي ويرد في الشكل 2د . يتم تمثيل النتائج المجراة في البلعمه في الشكل 3. الشكل 3 أ يظهر التفاضلية تلطيخ تحديد وجود مقياس الدعم الكلي، العَدلات، والخلايا الليمفاوية، والخلايا البلعمية التجارة والنقل+ . ويمثل النسبة المئوية للخلايا بالف والتحديد الكمي البلعمه في الشكل 3ب جمن الشكل 3، على التوالي. النسبة المئوية للجسم وفقدان الوزن في الفئران بعد الإدارة إعطاء جرعة المقاسة من P. الزّنجاريّة هو مبين في الشكل 4 أ، والنسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة فئران في اليوم الثاني بعد جرعة مميتة من P. الزّنجاريّة هو مبين في الشكل 4 باء. الشكل 4 ج يبين مؤامرة مبعثر لعبء كل الرئة البكتيري في الموت أو في اليوم الثاني بعد الإصابة P. الزّنجاريّة في الفئران.
الشكل 1 : البلعمه في الماوس الأساسي الضامة السنخية. (أ) صور الممثل منخفضة مقابل ارتفاع فهارس phagocytic عرض مقياس الدعم الكلي الأساسي يحتوي على الخرز fluorescent الأخضر (لليسار)؛ صور الممثل تظهر النسب المنخفضة والعالية من هيئة علماء المسلمين متجولة. سهام: انخفاض مؤشر فاجوسيتيك هيئة علماء المسلمين؛ رؤوس الأسهم: ارتفاع مؤشر phagocytic مقياس الدعم الكلي. شريط المقياس = 25 ميكرومتر للصورتين اليسرى و 50 ميكرون للحق الصورتين. (ب) الكشف الخلوي flow الممثل من فاجوسيتيزينج الخلايا في السيطرة لا الخرز، WT + الخرز، و TRIM72كو + الخرز هيئة علماء المسلمين. أشرطة define التي تحتوي على حبة الخلية السكان (بالنسبة المئوية) وكثافة fluorescence يعني (MFI). (ج) إحصاءات مؤشر phagocytic متوسط والنسبة المئوية لمقياس الدعم الكلي متجولة في وزن و TRIM72كو هيئة علماء المسلمين؛ n = 5 لكلا الفريقين، *p < 0.05. (د) إحصاءات flow الخلوي مؤسسة مونتانيار والنسبة المئوية للخلايا فيتك+ في وزن و TRIM72كو هيئة علماء المسلمين؛ n = 3 لكلا الفريقين، *p < 0.05. وهذا الرقم هو طبع بإذن من "جمعية الصدر الأمريكية"13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : FcγR، والجمهورية التشيكية-بوساطة البلعمه. (أ) الصور التمثيلية من الأغنام أوبسونيزيد خلايا الدم الحمراء (سربكس) البلعمه بالخلايا MH-S. تشير الأسهم إلى بعض سربكس. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (ب) Quantification سربكس البلعمه بالخلايا MH-S أوفيريكسبريسينج TRIM72 (TRIM72عمر الفاروق) بحضور مفتش (FcγR بوساطة البلعمه) أو IgM (الجمهورية التشيكية بوساطة البلعمه)؛ n = 6 لكل مجموعة، *ف < 0.05 و * *ف < 0.005 بالمقارنة مع التحكم بالوزن. (ج) صور الممثل لابتلاع الجسيمات زيموسان فلور أليكسا-488-مترافق بمقياس الدعم الكلي الأساسي المعزولة من WT أو TRIM72كو الفئران. وتبين الأسهم الموجودة في لوحة أ وب زيموسان + الخلايا. شريط المقياس = النتائج الإحصائية 50 ميكرومتر. (د) النسبة المئوية لمقياس الدعم الكلي؛ المحتوية على زيموسان n = 3 لكل مجموعة، p > 0.05. وهذا الرقم هو طبع بإذن من "جمعية الصدر الأمريكية"13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: البلعمه في المجراة من P. الزّنجاريّة التجارة والنقل- (أ) صور الممثل للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) خلية سيتوسبين الشرائح من وزن و TRIM72كو الفئران ح 1 بعد حقن P. الزّنجاريّة التجارة والنقل. تلوين كويك-مهرجان دبي السينمائي الدولي يحدد مقياس الدعم الكلي (كبير، جولة الخلايا) والعدلات؛ بروتينات فلورية خضراء يحدد الخلايا البلعمية (الأسهم البيضاء) والتجارة والنقل+ التدخل التفاضلية التباين (DIC) يحدد المدخلة بروتينات فلورية خضراء البكتيريا (الأسهم السوداء) في مقياس الدعم الكلي. أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر. (ب) التحديد الكمي للنسبة المئوية لهيئة علماء المسلمين والعدلات في بالف من وزن و TRIM72كو الفئران ح 1 بعد حقن P. الزّنجاريّة . (ج) تقدير النسبة المئوية لمقياس الدعم الكلي متجولة في الفئرانكو WT و TRIM72؛ n = 3 لكل مجموعة، *p < 0.05. يتم عرض البيانات كما يعني (± SEM). وهذا الرقم هو طبع بإذن من "جمعية الصدر الأمريكية"13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : إزالة البكتيريا الحية في استخدام P. الزّنجاريّة (سنوياً)- (أ) النسبة المئوية للجسم وفقدان الوزن (يتعلق) من السذاجة WT و TRIM72كو الفئران بعد الحقن داخل الأولى 2.5 × 105 PAO1 زيمبابوي/مليلتر (عزل سريرية من P. الزّنجاريّة)؛ n = 13 لوزن (المربعات السوداء)، n = 8 ل TRIM72كو (دوائر حمراء)، *p < 0.05، * *ف < 0.005 مقارنة مع الوزن (ب) النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة في اليوم الثاني بعد 3 × 107 زيمبابوي/مل ص الزّنجاريّة الحقن داخل؛ n = 10 WT (دوائر سوداء صلبة) و TRIM72كو (المربعات الحمراء الصلبة)، *p < 0.05 لوزن مقابل TRIM72كو المجموعات. (ج) مبعثر مؤامرة من عبء الجامع-الرئة البكتيري في اليوم الثاني من حقن P. الزّنجاريّة في وزن و TRIM72كو. خط متقطع رمادي يعين حقن جرعة البكتيرية؛ ^ يعين الفئران الذين لقوا حتفهم. لوزن مقابل TRIM72كو المجموعات، ف < 0.05. وهذا الرقم هو طبع بإذن من "جمعية الصدر الأمريكية"13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بينما تؤدي وظيفة تبادل غازات، يواجه الرئة إصرار الجسيمات الأجنبية ومسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية. مقياس الدعم الكلي توفر الخط الأول للدفاع بحكم وظيفتها الرئيسية، إلا وهي البلعمه. هيئة علماء المسلمين أيضا بتنسيق مع سائر الخلايا المناعية في تدمير مسببات الأمراض، وفي القرار من التهاب. هنا، يمكننا وصف أساليب تقييم البلعمه بمقياس الدعم الكلي المعزولة من الرئة الماوس على وجه التحديد. البروتوكول قدم في هذه المخطوطة يفسر دراسة مفصلة من البلعمه في الحية سواء في المختبر، التي يمكن استخدامها أيضا لدراسة وظيفة بلعم وإزالة البكتيريا في الأجهزة الأخرى.
يعتمد على فكرة بسيطة تفرخ المعالجة بالمصل الخرز فيتك البلعمه في المختبر الموصوفة أو أوبسونيزيد سربكس مع مثقف مقياس الدعم الكلي الشروع في البلعمه. ويشمل هذا الأسلوب خطوات الغسل واسعة النطاق وتحلل كرات الدم الحمراء نونفاجوسيتيزيد للحد من الخلفية. ويجب الحرص لا لفصل AMs التقيد بها. الخطوة يغسل تنطوي ACK تحلل الحل ينبغي أن يتم داخل 1 دقيقة، كغسيل أطول الوقت يؤدي إلى تحلل الضامة.
وبالإضافة إلى ذلك، في تحليل التصوير، نحن يتسم كل من النسبة المئوية للخلايا فاجوسيتيزينج ومؤشر فاجوسيتيك للحصول على نظرة شاملة لوظيفة البلعمه صباحا. كما شرحنا طريقة للتفريق بين بر-FcγR-والجمهورية التشيكية بوساطة البلعمه في بلعم مورين MH-S خط الخلية. بالتزامن مع التحوير الوراثي، هذه الخطوة مفيدة عند محاولة الحصول على الأفكار الميكانيكية في مسار محدد البلعمه التي تأثرت بالتلاعب بالجينات المستهدفة.
توثيق التقارير السابقة أساليب تقييم استيعاب البكتيرية؛ هو الأسلوب أبرز المقايسة حماية الجنتاميسين14. في البروتوكول المعروضة هنا، أننا أظهرنا أيضا أسلوب تصوير لقياس المجراة في البلعمه. وهناك عدد قليل من العوامل الرئيسية التي تجعل هذا الأسلوب أفضل بالمقارنة مع الأساليب التي تم نشرها مسبقاً. الأسلوب الموصوفة هنا ينطوي على إعطاء حقن بروتينات فلورية خضراء P. الزّنجاريّة متبوعاً تلطيخ التفاضلية للخلايا بالف. ويبرز هذا الأسلوب استخدام البكتيريا الفلورسنت، مما يساعد على تحديد البكتيريا المستهلكة ضمن البالعات. وباﻹضافة إلى ذلك، تلطيخ التفاضلية للخلايا بالف يساعد على وجه التحديد التفريق بين قدرة هيئة علماء المسلمين من الخلايا المناعية الأخرى في البيئة الحية في متجولة وتقييم الإسهام النسبي لمختلف البالعات لمسح البكتيريا الأحمال من الرئة. حد طفيفة من هذا الأسلوب أنه يتطلب من إدارة إعطاء عناية لتجنب التقلبات بين الفئران.
علاوة على ذلك، لقد شرحنا الأسلوب إنشاء إزالة بكتيريا P. الزّنجاريّة في الفئران في السياق من الالتهاب الرئوي. تميز هذا الأسلوب، تحدد الجسم وفقدان الوزن والوفيات بعد إعطاء الإدارة من P. الزّنجاريّة ، وتستخدم تحليل كمي لتحديد عبء البكتيريا الرئة. الوفيات معياراً هاما لتقييم الاستجابة المناعية شاملة للجسم. كنا الرئة عينات من هذه التجربة لتقييم عبء البكتيرية. ومع ذلك، يمكن أيضا تحديد عبء البكتيرية من عينات الرئة حصادها خلال 48 ساعة بعد جرعة غير المميتة من الحقن البكتيرية. نجاح التحليل سوف تتحدد بتوحيد توقيت الحقن، ونوعية مسببات المرض وجرعة الحقن، والاستفادة المثلى من أسلوب التجانس الذي يعطل الرئة تماما دون كسر البكتيريا غشاء الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل منحة R01HL116826 إلى X. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
