Summary
本文报道了分析小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能和肺细菌清除的常用方法。这些方法研究荧光素异硫氰酸珠的体外吞噬和铜绿假单胞菌绿色荧光蛋白的体内吞噬作用。我们还描述了一种清除小鼠铜绿假单胞菌的方法。
Abstract
肺泡巨噬细胞 (ams) 保护肺的肺泡空间。ams 的吞噬作用在防御入侵病原体、去除死细胞或异物以及解决炎症反应和组织重塑方面发挥着至关重要的作用, 这些过程是由各种表面受体介导的。ams。在这里, 我们报告了分析 ams 的吞噬功能的方法, 使用体外和体内的检测和实验策略, 以区分模式识别受体-, 补体受体, 和 fc 伽玛受体介导吞噬。最后, 我们讨论了建立和表征小鼠铜绿假单胞菌肺炎模型的方法, 以评估细菌在体内的清除率。这些检测是评估 am 功能最常用的方法, 也可用于研究巨噬细胞功能和其他器官的细菌清除。
Introduction
ams 是肺泡中处于休眠阶段的主要脂肪细胞, 也是通过识别和内化吸入病原体和外来颗粒 1, 2 而产生先天免疫反应的主要参与者之一。据报道, ams 对于快速清除铜绿假单胞菌和3,4 肺炎克雷伯菌等多种肺部病原体至关重要, 因此 am 吞噬能力的缺乏往往导致呼吸道疾病。感染, 如急性肺炎, 导致较高的死亡率和发病率。
ams 还通过产生细胞因子和趋化因子 (如 tnf-α和 il-1β) 在肺中引发先天炎症反应, 这些细胞与肺泡环境中的其他细胞相通, 产生趋化因子并诱导炎症中性粒细胞、单核细胞和自适应免疫细胞在肺5。例如, ams 产生的 il-1β有助于促进中性粒细胞趋化因子 cxcl8 从上皮细胞6中释放。此外, ams 还有助于凋亡多核白细胞 (pmn) 的吞噬, 而这种白细胞的失败会导致细胞内酶从 pmn 持续泄漏到周围组织, 从而导致组织损伤和长期炎症。7.,8,9个。
ams 的吞噬作用是通过对病原体表面病原体相关分子模式的直接识别, 通过 ams 的模式识别受体 (prr) 或通过将凋亡的病原体与 ams 的免疫效应受体结合而介导的10. 对于后者, ams 可以通过其 fcγ受体 (fcγr) 识别用免疫球蛋白 (igg) 进行光声的目标, 或通过其补体受体 (cr)11识别含有补体片段 c3b 和 c3bi 的病原体。在补体受体中, 免疫球蛋白超家族 (crig) 的 cr 在组织巨噬细胞12中选择性表达, 最近的一项发现强调了 crig 在铜绿假单胞菌肺炎背景下的作用。13岁
许多原始的研究使用的方法来评估巨噬细胞吞噬, 以描述巨噬细胞功能14,15 的分子机制。然而, 像体内吞噬作用这样的方法需要精确的吞噬量的定量。本文综述了用荧光素异硫氰酸酯 (fitc) 玻璃珠和铜绿绿绿色荧光蛋白 (gfp) 进行体外和体内吞噬的详细方法。此外, 我们还解释了在 prr-、cr-r 和 fcγ r 介导的吞噬作用之间的鉴别方法。最后, 我们报告了一种方法来描述细菌清除在小鼠与铜绿假单胞菌肺炎。
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Protocol
该协议遵循东弗吉尼亚医学院动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的指导原则。
1. 荧光珠吞噬作用
- 根据 iacuc 对动物的伦理安乐死协议, 用 co2 窒息对小鼠进行安乐死 (c57bl/6j, 6周大, 女性)。
- 将鼠标放在覆盖有纸巾的解剖板上。用爪子把它的爪子固定下来, 四肢展开老鹰, 在门牙下钩住一根绳子, 将它的头向后拉, 这样气管就被垂直和水平地定位。
- 用70% 的乙醇弄湿老鼠的喉咙、胸部和腹部, 对毛皮进行消毒, 防止毛皮粘附在工具上。
- 使用常规钳子, 将身体中心线的皮肤拉起来, 用手术剪刀将皮肤切割到喉咙顶部。
- 使用标准手术剪刀的钝器端, 小心地移开喉咙上的肌肉和结缔组织, 并使用弹簧剪刀 (微剪刀) 来暴露气管。
- 用钳子夹住软骨环, 小心地做一个小切口 (~ 1.5 毫米), 用微型剪刀在气管的心室表面, 并将 18 g 插管插入气管。
- 轻轻灌洗3毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 一次1毫升。每次轻轻地将液体撤回到注射器中, 再注入肺部, 连续3倍。收集 balf 后, 进行颈椎脱位, 以确保安乐死。将收集到的 pbs (~ 2.8 ml), 即支气管肺泡灌洗液 (balf), 转移到管, 离心机 1, 000 x 克 10分钟, 并收集颗粒。在 1, 000 x 克的管道和离心机中加入1毫升新鲜的 pbs, 10分钟清洗碎片, 收集颗粒肺泡巨噬细胞。
- 用10% 的非热灭活胎儿牛血清 (fbs) 在不同的培养基中, 在37°c 的高湿空气中, 将颗粒在2毫升中重新注入, 并在同一培养基中培养原代肺泡巨噬细胞2天。
- 吸收旧的介质, 用1毫升的 pbs 清洗, 并添加2毫升的新鲜介质。加入 fitc 珠子 (羧基乳胶珠, 直径为 2μm, 50比德细胞), 在37°c 的加湿气氛中孵育1小时。
- 用 pbs 广泛清洗 (每次1毫升, 共洗 5次), 以去除细胞外的珠子。随机图像100个细胞, 用细胞内珠子 (488 nm) 计数细胞。
注: 吞噬指数是被摄入的珠子的数量除以巨噬细胞的总数;吞噬细胞的百分比是摄入至少一个珠子除以巨噬细胞总数16的巨噬细胞的数量.- 或者, 在用珠子孵育1小时后, 用3毫升的 pbs 清洗细胞, 并将其进行流式细胞仪的流式细胞仪处理, 以定量吞噬。同样, 将没有珠子的 ams 处理为未染色的细胞或对照细胞。使用流式细胞仪软件, 通过在软件中选择这些选项来计算百分比阳性率和平均荧光强度。
2. fcγr-和 crr 介导的吞噬细胞增多
- 对于选择 ss离, 在室温11下,用50μl 的兔抗 srbc-igm 或50μl 的兔抗 srbc-igg 孵育 2 x 10 8只羊红细胞 (srbc) 30分钟。
- 在37°c 条件下, 用50μl 的 c5 缺乏 (c5d) 人类血清对 srbc 进行30μl 的培养, 使补体 c3b 和 C3b 固定在 igm 涂层 srbc 上。
- 种子小鼠巨噬细胞 (mh-s 细胞) (10, 000 细胞/井) 在96孔板和孵育一夜得到一个约70% 的融合。在 mh-s 细胞的每口井中加入100μl 的 1 x 10 7/光被告 srbc, 并在37°c 孵育1小时。用100μl 氯化铵-钾 (ack) 裂解缓冲液快速 (~ 1分钟) 清洗未约束 srbc。
- 将细胞裂解为 0.1% sds, 并加入含有3% 过氧化氢和6m 尿素的50μl 的 2, 7-二甲基氟 (daf)。测量血红蛋白催化氟蓝形成在620纳米处的吸收率。
- 使用具有已知 srbc 数的 620 nm 吸收值的标准曲线来确定 srbc 的数量。同样, 用非光光化 srbc 培养的 mh-s 细胞作为阴性对照。
3. prr 介导的吞噬细胞增多
- 按照步骤1.1-1.9 分离和培养小鼠原发性肺泡巨噬细胞。
- 2天后, 取出培养基, 用1毫升的 pbs 清洗细胞, 并添加含有亚历克莎氟-488 共轭 zymosan-a 生物制品 (100粒) 的新鲜培养基500μl。
- 在37°c 下孵化1小时。通过添加500μl 的冰凉 pbs 来阻止吞噬。
- 用 pbs 广泛清洗细胞 (每次1毫升, 总共洗 5次)。在室温下用4% 的甲醛固定细胞10分钟。
- 用 pbs 广泛清洗细胞 (每次1毫升, 总共洗 5次), 并将细胞保持在500μl 的 pbs 中。
- 在差分干涉对比度和 488 nm 荧光通道下对细胞进行成像。计算含有 zymosan-a 生物制品的 ams, 并确定吞噬的百分比。
4. 肺泡巨噬细胞在活体吞噬细胞增多中的作用
注: 接种铜绿假单胞菌 gfp 在营养琼脂板上, 在37°C 孵育。第二天, 将单个菌落接种到2毫升的营养液中, 并在37°C 中长出细菌。
- 第二天, 给小鼠麻醉腹腔注射 100 mggsh 的氯胺酮和 10 mg/kg 的木胺。通过对脚趾夹紧缺乏反应来确认适当的麻醉。
- 将鼠标放在板上, 上面的门牙上有橡皮筋, 并将其置于半卧位 (45°), 腹侧表面和讲台朝上。使用弯曲的钳子, 部分收回舌头。使用微喷雾器, 在球体内给出 50μl (5 x10 6个菌落形成单位 [cfu])17例铜绿假单胞菌 gfp 进入麻醉小鼠的肺部。
- 感染1小时后, 按照步骤 1.1-1.7 进行。
- 将 pbs 中的细胞重新扫描, 然后将其 (1, 000 x g,室温下 1分钟) 离心到玻璃滑梯上。
- 根据制造商的说明, 对肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的细胞蛋白滑块进行差异染色。
- 随机选择 100 ams, 计数含有细胞内细菌的 ams, 并确定吞噬的百分比。
5.使用铜绿假单胞菌清除体内细菌
- 在铜绿假单胞菌分离琼脂板上接种铜绿假单胞菌, 并在37°C 孵育钢板. 将单菌落接种到2毫升的溶酶汤 (lb), 并在37°C 中生长细菌。使用以下公式计算 cfu。
chu/ml = (菌落数 x 稀释因子) 培养板的体积。
使用 pbs 稀释培养, 以获得所需的 cpu/ml。 - 在试验1中, 如步骤4.2 所述, 在麻醉的野生类型 (wt) 和 trim72ko小鼠体内注射约 2.5 x 10 5 cfuml p .铜绿假单胞菌的亚致死剂量。每天测量体重6天。
- 在试验2中, 向试验1中存活的小鼠注射第二剂量铜绿假单胞菌 (5 x10 5 chuml), 并测量体重4天。
- 在试验3中, 使用一组不同的小鼠, 注射 wt 和 trim72 ko小鼠注射铜绿假单胞菌的致死剂量 (3 x10 7 cfu/cfml), 并记录注射后2天内的死亡率。表现出严重压力迹象的动物, 如体重明显下降、弯腰、厌食或呼吸困难, 将由参加的兽医进行评估。无法治疗的动物将立即被牺牲。
- 无论是在死亡时或在注射后第2天安乐死后, 收集全肺组织, 以定量肺细菌负担在高峰感染。
- 要测试肺细菌负担, 在肺组织中添加200μl 的生理盐水, 并在电子均质器上进行均匀化, 该设置在不破坏细菌的情况下完全破坏肺组织。在10倍连续稀释的假单胞菌分离琼脂板上, 将肺均质体的总体积调整为1毫升, 肺裂解产物的总体积调整为100μl。
- 在37°c 下将钢板培养 24小时, 并对细菌菌落进行计数, 以确定整个肺的 cfu。
6. 统计分析
- 用学生的t测试来确定两组差异的统计意义。考虑在p < 0.05 时的统计学显著差异。所有数据均以均值 (sem) 的均值标准误差表示。
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Representative Results
我们首先进行了小鼠原发性 ams 吞噬分析的实验。在所有分析中, 我们比较了从 wt 和 trim72 ko 小鼠中分离出的 ams。如图 1a 所示, 荧光显微镜显示, 小鼠原代 ams 在孵育1小时后, 会发生 fitc-玻璃微珠的吞噬作用。图 1b显示流式细胞仪对吞噬性的分析。用显微镜和流式细胞仪测量的吞噬量的定量分别在图 1c 和图 1d 中表示。mh-s 细胞的 fcγr 和 cro 介导的吞噬在图2a中表示,图 2b显示了定量.这些结果表明, trim72 在 mh-s 细胞中的表达导致补体吞噬减少了五倍多。图 2c显示了从 wt 或 trim72 ko 小鼠中分离出的原代 ams 摄入的亚历克莎氟-488 共轭 zymosan-a 粒子的代表性图像, 图 2 c 显示了定量.体内吞噬结果如图3所示。图 3a显示不同染色识别 ams、中性粒细胞和淋巴细胞以及 gfp+吞噬细胞的存在。图 3 b 和图3 c 分别显示了 balf 细胞的百分比和吞噬的定量。图 4a 显示了气管内注射铜绿假单胞菌后小鼠体重减轻的百分比, 以及第2天铜绿假单胞菌致命剂量后小鼠存活的百分比为如图 4b所示。图 4c显示小鼠铜绿假单胞菌感染后死亡时或第2天全肺细菌负担的散点图。
图 1: 小鼠原发性肺泡巨噬细胞的吞噬性.(a) 低吞噬指数与高吞噬指数的代表性图像, 显示初级 ams 含有绿色荧光珠 (左);显示吞噬性 ams 的低和高百分比的代表性图像。箭头: 低吞噬指数 ams;箭头: 高吞噬指数 ams。左边两个图像的刻度条 = 25μm, 右边两个图像的刻度柱 = 50μm。(b) 代表性流式细胞仪检测无珠控制中的吞噬细胞、wt + 珠子和 trim72 ko + 珠 ams。条形定义含珠细胞群 (百分比) 和平均荧光强度 (mfi)。(c) wt 和 trim72 ko ams 的平均吞噬指数和吞噬性 ams 百分比的统计数据;n = 5 为两个组, *p < 0.05。(d) wt 流式细胞仪和 fitc + 细胞百分比统计; n = 3 为两个组, *p < 0.05。这个数字是在美国胸科学会的允许下重印的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: fcγr-和 crr 介导的吞噬.(a) mh-s 细胞对光化绵羊红细胞吞噬作用的代表性图像。箭头指向一些 srbc。标度棒 = 25μm. (b) mh-s 细胞在 igg (fcγr 介导的吞噬作用) 或 igm (crc 介导的吞噬细胞增多反应) 中过度表达 trim72 (trim72oe) 对 srbc 吞噬的定量;n = 6 每个组, *p < 0.05 和 * *p < 0.005 与 wt 对照相比。(c) 从 wt 或 trim72 ko 小鼠中分离的初级 ams 摄入亚历克莎氟-488 共轭 zymosan 粒子的代表性图像。面板 a 和 b 中的箭头表示 zymosan + 细胞。刻度条 = 50μm. (d) 含有酶的 ams 百分比的统计结果;n = 3 为每个组, p > 0.05。这个数字是在美国胸科学会的允许下重印的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:铜绿假单胞菌 gfp 的体内吞噬作用。(a) 在注射铜绿假单胞菌 gfp 1小时后, 来自 wt 和 trim72 ko 小鼠的支气管肺泡灌洗液 (balf) 细胞细胞旋旋切片的代表性图像。kwik-diff 染色可识别 ams (大的圆形细胞) 和中性粒细胞;gfp 识别吞噬细胞 (白色箭头) 和 gfp+差分干扰对比度 (dic) 识别 ams 中的内化 gfp 细菌 (黑色箭头)。标度柱 = 50μm (b) 在铜绿假单胞菌注射1小时后, wt balf 和 trim72 ko 小鼠中 ams和中性粒细胞的百分比的量化。(c) 对 wt 和 trim72 ko小鼠吞噬性 ams 的百分比进行量化;n = 3 为每组, *p < 0.05。数据以平均值 (±sem) 的形式显示。这个数字是在美国胸科学会的允许下重印的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:铜绿假单胞菌(p. a.) 在体内清除细菌。(a) 在第一次腹腔注射 2.5 x 10 5 cfuml pao1 (一种临床分离株铜绿假单胞菌) 后, 天真的 wt 和 trim72 ko 小鼠体重下降的百分比; n = 13 表示 wt (黑色方块), n = 8 表示 trim72 ko (红圈), * p < 0.05, ** p < 0.005 与 wt 相比. (b) 第3天的生存百分比, 在 3x10 7 chuml p 之后 . 铜绿假单胞区腹腔注射;n = 10 为 wt (固体黑眼圈) 和 trim72 ko (实心红色正方形), *p < 0.05 为 wt 与 trim72ko 组.(c) wt 和 trim72 ko注射铜绿假单胞菌第2天全肺细菌负荷的散点图。灰色虚线表示注射的细菌剂量;^ 选定死了的老鼠。wt 对 trimmko 组的 < 0.05。这个数字是在美国胸科学会的允许下重印的。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在发挥气体交换功能的同时, 肺持续面对外来颗粒、病原体和过敏原。ams 凭借其主要功能, 即吞噬作用, 提供了第一道防线。ams 还与其他免疫细胞协调, 以摧毁病原体和解决炎症。在这里, 我们描述了从小鼠肺分离的 ams 专门评估吞噬性的方法。本手稿中提出的协议解释了在体内和体外对吞噬作用的详细研究, 该研究也可用于研究其他器官的巨噬细胞功能和细菌清除。
所描述的体外吞噬依赖于简单的想法, 培养血清处理的 fitc 珠或光化 srbc 与培养的 ams, 以启动吞噬。该方法包括大面积洗涤步骤和非吞噬性红细胞裂解, 以减少背景。必须注意不要将坚持的 ams 分离。涉及 ack 裂解溶液的清洗步骤应在1分钟内完成, 因为较长的洗涤时间会导致巨噬细胞的裂解。
此外, 在影像学分析中, 我们对吞噬细胞的百分比和吞噬指数进行了表征, 以全面了解 am 吞噬功能。我们还解释了在小鼠巨噬细胞 mh-s 细胞系中鉴别 prr-、fcγr-和 crr 介导的吞噬的方法。结合基因调控, 这一步是有用的, 当试图获得机械洞察的特定吞噬途径, 受目标基因操作的影响。
以前的报告记录了评估细菌吸收的方法;最值得注意的方法是庆大霉素保护试验14。在这里提出的协议中, 我们还展示了一种测量体内吞噬的成像方法。与以前发布的方法相比, 有几个关键因素使这种方法变得更好。这里描述的方法包括气管内注射铜绿假单胞菌 gfp, 然后对 balf 细胞进行鉴别染色。这种方法突出了荧光细菌的使用, 这有助于识别吞噬细胞内摄入的细菌。此外, balf 细胞的差异染色有助于在体内环境中特别区分 ams 与其他免疫细胞的吞噬能力, 并评估不同吞噬细胞对清除细菌的相对贡献从肺的负荷。这种方法的一个小限制是, 它需要仔细的气管内给药, 以避免小鼠之间的变异性。
此外, 我们还解释了在肺炎的情况下建立小鼠铜绿假单胞菌清除的方法。为了表征该方法的特点, 我们确定了铜绿假单胞菌气管内给药后的体重减轻和死亡率, 并采用定量测定确定肺细菌的负荷。死亡率是评估人体综合免疫反应的一个重要参数。我们用这个实验的肺样本来评估细菌的负担。然而, 细菌的负担也可以从在48小时内采集的肺部样本中确定, 在非致命剂量的细菌注射后。检测的成功与否将取决于注射时间、病原体质量和注射剂量的标准化, 以及在不破坏细菌的情况下完全破坏肺的均质化方法的优化细胞膜。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到 r01hl116826 至 x. zhao 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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